Imagerie tridimensionnelle d’astrocytes immunomarqués à l’aide de la microscopie confocale

Prenez une section de cerveau de souris immunomarquée avec des astrocytes marqués par fluorescence. Le cytoplasme de l’astrocyte devient fluorescent en rouge, tandis que le noyau est fluorescent en bleu.

Placez la lame sur la platine d’un microscope confocal sous une lentille d’objectif appropriée.

À l’aide du logiciel d’acquisition, ajustez la mise au point et sélectionnez les fluorophores marquant le cytoplasme de l’astrocyte et le noyau.

Commencez l’imagerie en direct et optimisez les paramètres d’imagerie pour réduire le bruit dans l’image acquise.

Sous Paramètres d’acquisition, sélectionnez un mode de balayage à basse vitesse pour capturer une image bidimensionnelle de meilleure qualité.

Identifiez la position supérieure de l’astrocyte comme point de départ de la pile Z et la position la plus basse comme point d’extrémité.

Définissez le nombre de tranches couvrant toute la profondeur de la cellule.

Fusionnez les tranches pour générer une image tridimensionnelle de l’astrocyte.

Pour commencer la microscopie confocale, placez une lame sur la platine du microscope et sélectionnez l’objectif 63x. Après avoir ouvert le logiciel d’acquisition, cliquez sur Smart Setup dans l’onglet Acquisition et sélectionnez les fluorophores appropriés. Ici, DAPI et Alexa Fluor 555 sont utilisés.

Ensuite, cliquez sur Meilleur signal, puis sur Appliquer. Cliquez ensuite sur Régler l’exposition pour permettre à l’ordinateur de déterminer les paramètres d’exposition optimaux.

Pour optimiser l’image, ouvrez la fenêtre Chaînes et basculez l’image en direct. Ajustez la mise au point si nécessaire. Cliquez ensuite sur 1 AU pour optimiser le sténopé. Ajustez le gain pour obtenir la meilleure intensité.

Enfin, réglez le gain numérique entre 2 et 3. Après cette optimisation, arrêtez l’image en direct et ouvrez la fenêtre du mode d’acquisition. Ajustez la taille du cadre en cliquant sur X par Y, puis sélectionnez 1024 par 1024. Choisissez également une vitesse lente.

Ensuite, ouvrez l’onglet Calcul de la moyenne et sélectionnez un nombre supérieur ou égal à 4. Cliquez ensuite sur le bouton Snap et enregistrez l’image 2D capturée. Pour configurer l’imagerie 3D, ouvrez l’onglet Configuration intelligente et marquez l’élément Z-Stack, ce qui entraînera l’ouverture de la fenêtre de pile.

Pour définir la première et la dernière position de la pile Z, cliquez à nouveau sur En direct et ajustez la mise au point sur la position la plus haute de l’astrocyte. Cliquez d’abord sur Définir. Ajustez maintenant la mise au point sur la position la plus basse de l’astrocyte et cliquez sur Définir en dernier. Arrêtez ensuite la vue en direct.

Ensuite, choisissez l’intervalle en cliquant sur Optimal pour définir le nombre de tranches. Ici, l’intervalle est de 1,01 micromètre. Enfin, cliquez sur Démarrer l’expérience et enregistrez les images une fois le scan terminé.