Analyse de développement germe dentaire innervation Utilisation de périphériques Co-culture microfluidique

L’objectif général de cette procédure est de montrer comment isoler et co-cultiver les ganglions du trijumeau en développement et les germes dentaires. Pour ce faire, il faut d’abord stériliser, monter et revêtir les dispositifs microfluidiques. La deuxième étape consiste à disséquer les ganglions du trijumeau et les germes dentaires d’un stade de développement spécifique chez la souris d’intérêt.

Ensuite, les ganglions du trijumeau et les germes dentaires sont placés dans les dispositifs microfluidiques et co-cultivés. La dernière étape consiste à fixer les cellules et à les colorer à l’aide de l’immunofluorescence. En fin de compte, la microscopie est utilisée pour montrer le modèle d’innervation qui est le résultat de la co-culture.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les co-cultures conventionnelles, est que cette méthode permet la co-culture de différents organes et tissus chacun dans leur propre culture optimale. Douleur moyenne. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’innovation artificielle, telles que le rôle des différentes molécules sur l’innovation dentaire et la règle de l’innovation dans le développement des dents. Commencez par les outils de dissection en autoclavage, qui comprennent une paire de pinces de microdissection et une paire de ciseaux.

Ensuite, stérilisez un lot de lamelles en verre de 24 millimètres sur 24 millimètres en les plaçant dans une solution d’acide chlorhydrique molaire sur un agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec de l’eau distillée stérile, puis rincez-les trois fois à l’éthanol à 99 %, séchez-les sous une hotte à flux stérile une fois secs, allumez la lumière UV de la hotte pendant 30 minutes. Stockez ensuite les lamelles dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires.

Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, retirez soigneusement les dispositifs microfluidiques d’isolement axonal de leur emballage et placez-les dans une boîte de Pétri stérile à l’aide d’un poinçon de biopsie stérile d’un millimètre. Créez un trou dans les appareils pour chaque échantillon. En correspondance des chambres de culture.

Attention à ne pas percer trop près des micro-rainures car elles pourraient être endommagées par la pression. Ensuite, stérilisez les dispositifs en les faisant sortir dans de l’éthanol à 70 %. En prenant soin d’éliminer tout l’air emprisonné.

Retirez ensuite les appareils de l’éthanol et séchez-les complètement sous une hotte à flux stérile. Retirez également les lamelles de la solution d’éthanol à 70 % et laissez-les sécher sous la hotte d’écoulement stérile. Attendez au moins trois heures avant de continuer.

Placez chaque lamelle dans un puits à l’intérieur d’une assiette à six puits. Placez ensuite le dispositif microfluidique sur la lamelle et appuyez doucement mais fermement avec la pince afin de permettre une adhérence complète entre le dispositif d’isolation et la lamelle en verre. Ensuite, pipetez 150 microlitres de 0,1 milligramme par millilitre, poly D lycine dans chacune des chambres de culture.

Placez ensuite les dispositifs microfluidiques sous vide pendant cinq minutes pour éliminer tout l’air des chambres. Si l’on peut encore voir de l’air à l’intérieur des chambres. Réinjectez la solution de poly D lysine dans les chambres.

Incuber les appareils avec de la poly de lysine pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain. Lavez les chambres trois fois avec de l’eau distillée stérile, puis remplissez les chambres avec 150 microlitres de cinq microgrammes par millilitre, solution de travail de lamin, et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, réparez les ganglions du trijumeau et les cultures de germes dentaires, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint.

Nettoyez la zone de dissection et le stéréoscope avec de l’éthanol à 70 % et placez les instruments de dissection après le sacrifice. Disséquer la peau autour du bas-ventre d’une souris enceinte avec des embryons de souris de stade E 14.5 à E 17.5. Ensuite, ouvrez soigneusement l’abdomen à l’aide de ciseaux.

Localisez l’utérus, retirez-le et placez-le dans un tube rempli de glace. PBS froid : disséquez les embryons et placez-les individuellement dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de PBS glacé. Une fois que tous les embryons ont été retirés des tissus embryonnaires supplémentaires, décapitez-les à l’aide de ciseaux.

Séparez la mâchoire inférieure du reste de la tête à l’aide d’une micro dissection, de ciseaux, en prenant soin de ne pas endommager les ganglions du trijumeau. Ensuite, prenez la tête et placez-la sur une boîte de Pétri en verre de dissection réfrigérée. Utilisez des pinces pour enlever la peau et le crâne.

Placez ensuite la pince sous le céphalon et soulevez-la. Pour enlever le céphalon et le cervelet, localisez les ganglions du trijumeau et utilisez les pinces et les aiguilles de dissection pour séparer les ganglions du trijumeau des nerfs du trijumeau et nettoyer les ganglions. Conservez-les dans du PBS froid à l’aide d’aiguilles de dissection comme couteaux.

Retirez la langue et la peau entourant la mâchoire. Séparez les mâchoires gauche et droite en coupant le long de la ligne médiane de la mâchoire. Ensuite, localisez les germes dentaires et isolez-les à l’aide d’aiguilles de dissection après dissection des ganglions du trijumeau et des germes dentaires, retirez la laminine des dispositifs microfluidiques et remplissez les chambres avec 200 microlitres de milieux respectifs.

À l’aide d’une pince, transférez doucement les ganglions du trijumeau disséqués et les germes dentaires dans les trous créés à l’aide d’un poinçon de biopsie. Assurez-vous que les germes dentaires ne flottent pas et qu’ils coulent jusqu’à ce qu’ils entrent en contact avec les lamelles de protection. Culture, les échantillons dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Changez le milieu de culture toutes les 48 heures pendant 10 jours pour changer le milieu. Tout d’abord, retirez le milieu en pointant la pipette vers le côté externe des puits. Ajoutez ensuite le milieu de préchauffage frais du côté des wels situés en face des chambres pendant la période de culture.

Imagez les co-cultures à tout moment à l’aide de la microscopie optique. Après la période de culture, lavez les chambres en pipetant 150 microlitres de PBS dans un puits par chambre et en laissant le PBS s’écouler à travers les chambres. Répétez le lavage au total trois fois après le dernier lavage.

Retirez le PBS et fixez les échantillons en pipetant 150 microlitres d’aldéhyde paraforme à 4 % dans du PBS dans un puits par chambre, et en le laissant s’écouler dans l’autre chambre. Incuber l’appareil à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, lavez les chambres deux fois avec du PBS et procédez à des analyses plus approfondies telles que la coloration immunofluorescente et l’imagerie de l’excroissance.

Au cours de la culture du charbon, les neurites des ganglions du trijumeau se ramifient à partir de son compartiment de culture et s’étendent vers le germe dentaire en développement. À un grossissement plus élevé, on peut voir les neurites s’étendre à travers les chambres axonales et les micro-rainures du dispositif microfluidique. La progression de la croissance nerveuse peut être suivie au fil du temps pour décrire le développement de l’innovation.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’ARN ou la PROTÉINISATION peuvent être réalisées afin d’étudier, par exemple, les changements d’expression génique ou de sécrétion de protéines dans les tissus cibles suite à l’innovation.