Analyse de développement germe dentaire innervation Utilisation de périphériques Co-culture microfluidique

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment isoler et co-cultiver les ganglions trijumeaux en développement et les bourgeons dentaires. Cela s'accomplit en stérilisant, en montant et en recouvrant tout d'abord les dispositifs microfluidiques. La deuxième étape consiste à disséquer les ganglions trijumeaux et les bourgeons dentaires à un stade de développement spécifique chez la souris d'intérêt.

Ensuite, les ganglions trijumeaux et les germes dentaires sont placés dans les dispositifs microfluidiques et cultivés en co-culture. La dernière étape consiste à fixer les cellules et à les colorer par immunofluorescence. Enfin, une microscopie est utilisée pour visualiser le schéma d'innervation résultant de la co-culture.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les cocultures conventionnelles, est qu'elle permet la coculture d'organes et de tissus différents, chacun dans son milieu de culture optimal. Cette méthode peut aider à répond游戏副本

Ensuite, stérilisez un lot de lamelles en verre de 24 millimètres sur 24 millimètres en les plaçant dans une solution d'acide chlorhydrique à un molaire sur un agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Lavez ensuite les lamelles trois fois avec de l'eau distillée stérile, puis rincez-les trois fois dans de l'éthanol à 99 %, faites-les sécher sous une hotte à flux laminaire ; une fois sèches, allumez la lumière UV de la hotte pendant 30 minutes. Conservez ensuite les lamelles dans de l'éthanol à 70 % jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires.

Ensuite, utilisez des pinces stériles pour retirer avec précaution les dispositifs microfluidiques d'isolement des axones de leur emballage et placez-les dans une boîte de Pétri stérile à l’aide d’un punch à biopsie stérile d’un millimètre. Créez un trou dans les dispositifs pour chaque échantillon, aligné avec les chambres de culture.

Veillez à ne pas percer trop près des micro-gorges, car celles-ci pourraient être endommagées par la pression. Ensuite, stérilisez les dispositifs en les immergeant dans de l'éthanol à 70 %. Veillez à éliminer tout l'air emprisonné.

Ensuite, retirez les dispositifs de l'éthanol et faites-les sécher complètement sous une hotte à flux laminaire. Retirez également les lamelles de la solution d'éthanol à 70 % et laissez-les sécher sous la hotte stérile. Attendez au moins trois heures avant de poursuivre.

Placer chaque lame couvre-objet dans un puits d'une plaque à six puits. Ensuite, placer le dispositif microfluidique sur la lame couvre-objet et appuyer doucement mais fermement avec la pince afin d'assurer une adhérence complète entre le dispositif d'isolement et la lame couvre-objet en verre. Puis, ajouter 150 microlitres de poly-D-lysine à 0,1 milligramme par millilitre dans chacune des chambres de culture à l’aide d’une pipette.

Ensuite, placer les dispositifs microfluidiques sous vide pendant cinq minutes afin d'éliminer tout l'air des chambres. Si de l'air est encore visible dans les chambres, répéter l'ajout de la solution de poly-D-lysine dans les chambres.

Incubez les dispositifs avec la poly-L-lysine pendant la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant. Lavez les chambres trois fois avec de l'eau distillée stérile, puis remplissez les chambres avec 150 microlitres d'une solution working de laminine à cinq microgrammes par millilitre, et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez les milieux de culture pour les ganglions trijumeaux et les bourgeons dentaires comme décrit dans le protocole de texte accompagnant.

Nettoyez la zone de dissection et le stéréomicroscope avec de l'éthanol à 70 % et placez les instruments de dissection après l'euthanasie. Disséquez la peau autour de l'abdomen inférieur d'une souris gravide ayant des embryons âgés de E 14,5 à E 17,5. Ouvrez ensuite soigneusement l'abdomen à l'aide de ciseaux.

Localisez l'utérus, retirez-le et placez-le dans un tube rempli de glace. Dans du PBS froid, disséquez les embryons et placez-les individuellement dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de PBS glacé. Une fois tous les embryons séparés des tissus extra-embryonnaires, décapitez-les à l’aide de ciseaux.

Séparez la mâchoire inférieure du reste de la tête à l’aide d’une microdissection avec des ciseaux, en prenant soin de ne pas endommager les ganglions trijumeaux. Ensuite, prenez la tête et placez-la sur une boîte de Pétri en verre refroidie. Utilisez une pince pour retirer la peau et le crâne.

Ensuite, placer la pince en dessous du céphalon et soulever. Pour retirer le céphalon et le cervelet, localiser les ganglions trijumeaux et utiliser la pince ainsi que les aiguilles de dissection pour séparer les ganglions trijumeaux des nerfs trijumeaux et nettoyer les ganglions. Conserver ceux-ci dans du PBS froid en utilisant les aiguilles de dissection comme des couteaux.

Retirer la langue et la peau entourant la mâchoire. Séparer les deux hémimâchoires gauche et droite en coupant le long de la ligne médiane de la mâchoire. Puis localiser les bourgeons dentaires et les isoler à l’aide d’aiguilles de dissection. Après la dissection des ganglions trijumeaux et des bourgeons dentaires, retirer la laminine des dispositifs microfluidiques et remplir les chambres avec 200 microlitres du milieu respectif.

À l’aide de pinces, transférer délicatement les ganglions trijumeaux disséqués et les bourgeons dentaires dans les orifices créés à l’aide d’un poinçon biopsique. Veiller à ce que les bourgeons dentaires ne flottent pas et qu’ils s’enfoncent jusqu’à entrer en contact avec les lamelles. Cultiver les échantillons dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Changer le milieu de culture toutes les 48 heures pendant 10 jours pour renouveler le milieu. Tout d'abord, retirer le milieu en orientant la pipette vers le côté externe des puits. Ensuite, ajouter le nouveau milieu préchauffé sur le côté des puits situé à l'opposé des chambres pendant la période de culture.

Observer les cocultures à tout moment en utilisant la microscopie optique. À la fin de la période de culture, laver les chambres en pipettant 150 microlitres de PBS dans un puits par chambre, en laissant le PBS circuler à travers les chambres. Répéter le lavage un total de trois fois après le dernier lavage.

Retirer le PBS et fixer les échantillons en pipetant 150 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS dans un puits par chambre, puis laisser le liquide circuler vers l'autre chambre. Incuber l'appareil à température ambiante pendant 15 minutes. Laver ensuite les chambres deux fois avec du PBS et poursuivre par des analyses supplémentaires telles que la coloration immunofluorescente et l'imagerie de l'expansion cellulaire.

Lors de la culture en co-culture, les neurites issues des ganglions trijumeaux s'étendent depuis leur compartiment de culture et progressent vers le germe dentaire en développement. En fort grossissement, on peut observer les neurites qui s'allongent à travers les chambres axonales et les microsillons du dispositif microfluidique. L'évolution de la croissance nerveuse peut être suivie dans le temps afin de décrire le développement de l'innervation.

Après cette procédure, d'autres méthodes comme la transcription d'ARN ou la production de protéines peuvent être réalisées afin d'étudier, par exemple, les modifications de l'expression des gènes ou de la sécrétion des protéines dans les tissus cibles suite à une innovation.