Génération de jonctions neuromusculaires à l’aide d’un dispositif microfluidique

Commencez par un dispositif microfluidique recouvert de polymère doté de puits interconnectés portant des compartiments en miroir reliés par des micro-rainures.

Ensemencez les cellules progénitrices neurales dans les puits d’un compartiment.

Permettez-leur de migrer dans le canal interconnecté et d’adhérer au polymère.

Superposer avec un milieu de croissance pour favoriser la maturation neuronale en motoneurones.

Dans le compartiment opposé, ensemencez les puits avec des cellules progénitrices musculaires, qui migrent et adhèrent au canal interconnecté.

Remplacer le milieu par un milieu de différenciation, induisant la fusion des cellules progénitrices musculaires et formant des cellules musculaires multinucléées.

Ajoutez un milieu de différenciation neuronale contenant des facteurs de croissance dans le compartiment contenant les cellules musculaires.

Pendant ce temps, ajoutez un demi-volume de milieu exempt de facteur de croissance dans le compartiment contenant les cellules neurales.

Les facteurs de croissance et un volume plus élevé de milieu dans le compartiment opposé favorisent l’extension des processus des motoneurones à travers les microsillons.

Ces processus neuronaux se connectent ensuite aux cellules musculaires, formant des jonctions neuromusculaires.

Pour plaquer les cellules progénitrices neurales, ou NPC, dans le dispositif microfluidique, retirez les DPBS de deux puits situés d’un côté des microsillons du dispositif à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Pour ensemencer un total de 250 000 PNJ dans 60 à 100 microlitres de milieu de motoneurones du jour 10 par dispositif dans le puits supérieur droit, ensemencez la moitié de la suspension cellulaire près de l’ouverture du canal à un angle de 45 degrés.

Faites une pause de quelques secondes pour permettre à la suspension cellulaire de s’écouler dans le canal avant d’ajouter la moitié restante de la suspension cellulaire dans le puits inférieur. Utilisez un stylo pour marquer le côté ensemencé comme NPC ou équivalent pour faciliter l’orientation de l’appareil sans microscope et incubez pendant cinq minutes pour la fixation de la cellule. Ensuite, remplissez lentement les deux puits ensemencés de NPC avec un milieu supplémentaire de motoneurones du jour 10 jusqu’à un volume total de 200 microlitres par puits. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirez les DPBS des deux puits situés de l’autre côté des microsillons opposés aux NPC fraîchement ensemencés.

Ajouter 200 microlitres de média de motoneurones du jour 10 par puits dans les puits non ensemencés. Ensuite, ajoutez 6 millilitres de DPBS par boîte de 10 centimètres autour de l’appareil pour éviter l’évaporation du milieu pendant l’incubation.

Pour changer de fluide, retirez lentement le support dans les deux puits avec des NPC en positionnant la pointe de la pipette de 200 microlitres sur le bord inférieur de la paroi du puits à l’opposé de l’ouverture du canal. Pour éviter qu’un fort flux de fluide n’endommage les cellules du canal, ajoutez lentement 50 à 100 microlitres de milieu de motoneurones frais à chaque puits, en changeant continuellement entre le puits supérieur et le puits inférieur. Répétez le processus jusqu’à ce que chaque puits contienne 200 microlitres de milieu.

Au 17e jour de la différenciation des motoneurones, retirez le milieu des motoneurones du côté non ensemencé des microsillons dans l’appareil avec une pipette de 200 microlitres et lavez les puits avec DPBS. Ensemencez un total de 200 000 mésoangioblastes primaires humains ou MAB dans 60 à 100 microlitres de milieu de croissance par dispositif en ensemenceant la moitié de la suspension cellulaire dans le puits supérieur.

Faites une pause de quelques secondes pour permettre à la suspension cellulaire de s’écouler dans le canal avant d’ensemencer la moitié restante de la suspension cellulaire dans le puits inférieur, comme démontré précédemment pour le placage des PNJ. Incuber l’appareil pendant cinq minutes pour la fixation des cellules. Ensuite, remplissez les deux puits fraîchement ensemencés de MAB avec un milieu de croissance supplémentaire et incubez à nouveau comme démontré.

Pour initier le gradient chimiotactique et volumétrique au 21e jour de la différenciation des motoneurones, ajoutez 200 microlitres par puits de milieu basal contenant des facteurs de croissance du motoneurone dans le compartiment des myotubes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres par puits de milieu basal du motoneurone sans facteurs de croissance dans le compartiment du motoneurone.