Analyse de Yersinia enterocolitica Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l'aide de bêta-lactamase effecteur Fusions

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer la translocation de la protéine effectrice dans les cellules hôtes via le système de sécrétion de type trois vernia. Ceci est réalisé en incubant des cellules heela avec des mutants yersinia exprimant des fusions effectrices TEM one beta lactamase pour permettre la translocation des fusions effectrices dans les cellules HELOC. Dans un deuxième temps, les cellules HELOC infectées sont chargées avec un composé rapporteur de frettes perméable à la cellule, qui est traité par l’œstrologie cellulaire en la charge dans le CCF quatre fluorescent et ainsi piégé dans la cellule.

Ensuite, le clivage de CCF quatre par la bêta-lactamase translocalisée entraîne une perturbation de fre, qui est enregistrée par microscopie à balayage laser afin d’analyser les intensités de fluorescence du donneur et de l’accepteur. Les résultats montrent différentes quantités de fusion effectrice TEM one beta lactamase translocalisée en fonction de différentes cinétiques d’augmentation de la fluorescence du donneur. L’un des principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que le traitement intercellulaire du composé CCF quatre fournit un outil très spécifique et sensible pour mesurer la translocation.

La méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogenèse bactérienne, telles que la façon dont la translocation est affinée lors de l’interaction des bactéries et des cellules hôtes un jour avant l’infection. Inoculer trois flacons distincts contenant trois millilitres de milieu LB et les antibiotiques requis avec une colonie de chacune des souches transformées d’entérocolite à Y préparées comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Préparez également des plaques contenant des cellules heela la veille de l’infection en ensemenceant 15 000 cellules dans 200 microlitres de milieu de culture dans neuf puits d’une plaque à 96 puits, incubez les cellules dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius le jour de l’infection.

Inoculez deux millilitres de la culture de nuit dans 40 millilitres de milieu frais sans antibiotiques. Incuber les bactéries pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius dans un agitateur à 180 tr/min. Cela induira l’expression du système de sécrétion de type trois après 90 minutes, transférera les cultures dans un tube frais et gardera les cultures sur de la glace.

À partir de ce moment. Centrifugez les cultures pendant 10 minutes à 5 000 g et quatre degrés Celsius pour granuler les bactéries. Ensuite, mettez à nouveau la pastille en suspension dans deux à trois millilitres de PBS glacé, diluez la suspension bactérienne à une concentration de 800 millions d’unités formant des colonies par millilitre, puis placez les cultures sur de la glace.

Déterminez ensuite la densité optique correspondante de chaque culture. Ajoutez 3,5 microlitres de la suspension bactérienne de chaque souche dans différents puits des 96 préparés. Bien plaquer et mélanger en pipetant doucement le milieu deux fois, laisser les bactéries se sédimenter sur les cellules à un moty d’infection d’environ 100 bactéries par cellule.

Effectuez une évolution temporelle en commençant les infections à des intervalles de 30 minutes et en maintenant les cellules dans une chambre à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius. Après chaque infection, 90 minutes après la première infection, aspirez soigneusement le milieu sans retirer aucune des cellules Hela. Ajoutez ensuite 50 microlitres de PBS contenant 20 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 2,5 millimolaires de pronique.

Cela arrêtera l’expression des effecteurs et réduira l’exportation de CCF quatre. Pour préparer la microscopie, assurez-vous d’une immersion continue en étalant le milieu d’immersion au fond des puits, à l’aide d’une seringue d’un millilitre. Évitez de piéger des bulles d’air dans le milieu d’immersion.

Transférez ensuite la plaque à 96 puits sur la platine du microscope et localisez les endroits appropriés pour une analyse ultérieure dans chacun d’eux. Eh bien, terminez cette étape en 10 minutes. Ajoutez ensuite 70 microlitres de solution de chargement CF 4:00 AM dans chacun.

Bien incuber la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez la solution de chargement et ajoutez 100 microlitres de PBS contenant 20 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 2,5 millimolaires proniques. Ensuite, démarrez rapidement la microscopie.

Placez un objectif d’immersion numérique à grande ouverture numérique à grossissement de 20 fois et ouvrez le sténopé du détecteur à 2,5 unités d’air et transférez la plaque à 96 puits dans la platine de balayage laser confocale. Ensuite, choisissez des détecteurs de phosphate d’arséniure de gallium à haute sensibilité avec des canaux donneur et accepteur simultanément actifs. Profondeur de bits triple image moyenne et excitation avec 10 % d’un laser à diode de 405 nanomètres.

Pour garantir une quantification correcte, réglez le gain du détecteur des deux canaux sur la même valeur et évitez les pixels saturés. Ensuite, activez la lumière transmise et vérifiez à nouveau les champs de vision représentatifs dans tous les domaines, ajustez et réenregistrez les positions si nécessaire à l’aide d’une platine automatique calibrée. Enfin, réglez le laps de temps sur deux minutes, la durée sur deux heures et commencez à acquérir des images.

Après l’acquisition de l’image, importez l’ensemble de données dans un logiciel qui permet les calculs arithmétiques des matrices de pixels. Soustrayez l’arrière-plan dans les deux canaux en utilisant le même décalage en cliquant d’abord sur le menu, puis allez dans le traitement de l’image et sélectionnez la soustraction de la ligne de base. Sélectionnez ensuite chaque canal et entrez la valeur de référence.

Corrigez le saignement du canal donneur, le canal un dans le canal accepteur canal deux avec le facteur de correction prédéterminé, en créant un nouveau canal deux prime à cette fin. Cliquez sur le menu, puis sélectionnez Traitement d’image, suivi de l’arithmétique du canal et entrez la valeur absolue du canal deux, soustraite du point 33 fois. Ensuite, supprimez le canal deux et assurez-vous que le fond perdu du canal Accepter corrigé reste le nouveau canal deux.

Créez ensuite un nouveau canal avec l’opération illustrée ici pour déterminer le coefficient de frette relatif. Ensuite, retournez dans le menu d’arithmétique des canaux et entrez le canal deux divisé par le canal un plus le canal deux pour une visualisation correcte du canal de frette. Dans une image de huit bits, créez un quatrième canal quatre, ce qui équivaut à 255 fois le troisième canal.

Modifiez la couleur du canal en accédant au menu des propriétés de l’image, sélectionnez le canal quatre, puis la couleur mappée, puis le fichier de table de couleurs, et sélectionnez jet. Ensuite, appliquez un filtre médian trois par trois aux canaux trois et quatre. Cela réduira le bruit dans les images en entrant dans le menu de traitement d’image et en sélectionnant le lissage.

Suivi d’un filtre médian, sélectionnez les deux canaux et appliquez une taille de filtre de trois par trois par un pour la quantification des signaux cellulaires. Détectez les cellules du canal quatre en sélectionnant la vue surpasser et en cliquant sur l’icône. Ajoutez de nouvelles surfaces.

Définissez les paramètres de l’algorithme de détection dans la fenêtre de surface et cochez les deux cases. Segmentez uniquement une région d’intérêt et traitez l’image entière. Enfin, définissez la région d’intérêt en modifiant ses dimensions.

Sélectionnez le canal quatre comme canal source et définissez le seuil en accédant au menu de seuillage et en sélectionnant la soustraction en arrière-plan. Réglez le diamètre à 10 micromètres, le seuil d’intensité minimum manuellement à zéro et le seuil maximum à l’intensité maximale. Filtrez les structures par surface et réglez la valeur minimale sur 187 micromètres carrés.

Terminez ensuite la détection de surface. Enfin, extrayez les valeurs moyennes de l’intensité de fluorescence du donneur dans le canal un et du coefficient de frette relatif dans le canal trois, ainsi que leurs écarts-types dans l’entité cellulaire. Pour montrer la capacité de cette méthode à analyser quantitativement la translocation effectrice dans les cellules cibles, deux souches de yersinia avec une cinétique de translocation différente ont été étudiées en utilisant à la fois la fluorescence du donneur et les coefficients de frette relatifs.

Les cellules infectées de type sauvage montrent une augmentation de l’intensité de la fluorescence au fil du temps. Comme prévu, la pente maximale de l’intensité de la fluorescence est positivement corrélée à la durée de l’infection, ce qui indique que différentes concentrations de bêta-lactamase traduite peuvent être distinguées conformément aux études précédentes. Les cellules infectées par le mutant de délétion yersinia YOPE présentent une augmentation plus rapide de l’intensité de la fluorescence par rapport à la souche de type sauvage.

Il est intéressant de noter que l’extension de l’infection à 90 minutes n’a pas accéléré davantage l’augmentation de la fluorescence du donneur par rapport à 60 minutes d’infection. Lors de cette procédure, il est important de garder à l’esprit que le traitement du composé CCR quatre commence immédiatement après son ajout. Par conséquent, il est important de commencer l’acquisition d’images à temps.