Name: Analyse de Yersinia enterocolitica Effecteur translocation dans les cellules hôtes à laide de bêta-lactamase effecteur Fusions (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Découvrez l'analyse de la translocation d'effecteurs bactériens dans les cellules hôtes HeLa à l'aide de fusions bêta-lactamase et de microscopie à balayage laser. Cette méthode permet de quantifier précisément les mécanismes de virulence de Yersinia.

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Nous remercions le Dr Antonio Virgilio Failla d’avoir fourni l’algorithme de quantification de l’acquisition FRET et Erwin Bohn d’avoir fourni les constructions pMK-bla et pMK-ova.

1. pic d&#39;émission et de la Croix-talk Détermination (voir également la figure 2) <ol><li> Afin de déterminer les pics d&#39;émission et le montant de la diaphonie entre le donneur (coumarine dérivé V450) et l&#39;accepteur (fluorescéine) colorants, effectuer des analyses spectrales de cellules marquées par deux fluorophores individuelles à 405 nm excitation. </li><li> Déterminer une largeur de bande de 10 nm à l&#39;intérieur de la pointe de chaque colorant qui sera utilisée pour les canaux de donneur et d&#39;accepteur (455 à 465 nm et ici de 525 à 535 nm). Tracer l&#39;intensité normalisée plus la longueur d&#39;onde et calculer le pourcentage moyen de diaphonie du donneur de colorant dans le canal de l&#39;accepteur et vice versa (Figure 2). </li></ol> 2. Préparation de Y. enterocolitica souches pour la culture cellulaire Infection <ol><li> Utilisez les souches suivantes: WA-314-pMK ovules (WA-314 transformé avec les plasmides pMK-bla 17 et PMK-ovules 17, respectivement) et WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformé avec le plasmide pMK-bla 17) </li><li> Au moins deux jours avant l&#39;infection série Y. enterocolitica souches WA-314 pMK-ovules, WA-314 pMK-bla et WA-314ΔE pMK-bla de cryo des stocks sur des plaques d&#39;agar-LB contenant les antibiotiques nécessaires (kanamycine pour WA-314 pMK-bla et WA-314 pMK-ova ; kanamycine et la tétracycline pour WA-314ΔE pMK-bla) et de grandir O / N à 27 ° C. Garder ensuite les plaques pendant jusqu&#39;à une semaine à 4 ° C. </li><li> Un jour avant l&#39;infection inoculer 3 ml de milieu LB contenant les antibiotiques nécessaires avec une colonie des souches respectives et incuber O / N à 27 ° C dans un agitateur à 180 rpm. </li><li> Le jour de l&#39;infection inoculer 2 ml de la culture O / N dans 40 ml de milieu LB frais sans antibiotiques et incuber pendant 90 min à 37 ° C dans un agitateur à 180 tours par minute pour induire l&#39;expression du système de sécrétion de type III. </li><li> Transférer les cultures dans un tube approprié et garder les cultures sur de la glace ou à 4 ° Cà partir de maintenant. Centrifuger les cultures pendant 10 min à 5000 xg et 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot bactérien dans 2-3 ml de PBS glacé. Diluer la suspension bactérienne à une concentration de 8 x 10 8 cfu / ml en utilisant un spectrophotomètre. Déterminer la densité optique correspondant individuellement. Gardez cette suspension sur la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;infection des cellules HeLa. </li></ol> 3. Les cellules HeLa Placage <ol><li> Un jour avant la graine de l&#39;infection de 1,5 x 10 4 cellules des cellules HeLa dans du DMEM 200 ul contenant inactivé sérum de veau foetal 10% de la chaleur (FCS) dans les puits d&#39;une plaque de 96 puits et de cultiver dans un incubateur à CO 2 de 5% à 37 ° C. Ensemencer trois puits pour chaque souche (trois temps d&#39;incubation différents). </li></ol> 4. Infection des cellules HeLa et chargement avec CCF4 <ol><li> Infecter des cellules HeLa en ajoutant 3,5 ul de la suspension bactérienne dans le milieu et le mélanger doucement par pipetage du milieu deux fois. Permettre aux bactéries de sédimentspour les cellules à une MOI (fragment d&#39;infection) d&#39;environ 100 bactéries par cellule. Pour un cours de temps de démarrage infections à -90 min -60 min -30 min et et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5% jusqu&#39;à 0 min pour atteindre un point final commun. </li><li> Quand l&#39;incubation est terminée, aspirer soigneusement le moyen sans enlever les cellules HeLa et ajouter 50 pi de PBS contenant 20 pg / ml de chloramphenicol pour arrêter l&#39;expression des effecteurs et 2,5 mM de probénécide pour réduire l&#39;exportation de CCF4. </li><li> A ce point de transférer la plaque de 96 puits dans la platine du microscope et de définir des points appropriés pour une analyse ultérieure dans chaque puits. Terminer cette étape en 10 min (pour plus de détails de l&#39;acquisition voir rubrique 5.1). </li><li> Par puits, ajouter 70 pi de solution CCF4 / AM de chargement (solution 0,24 pi A, 1,2 ul solution B, 18,56 ul solution C (solution A, B, et C fourni dans le kit / AM de chargement CCF4) et 50 pi de PBS (contenant 20 ug / ml de chloramphenicol et 2,5 mM de probénécide) à l&#39;aide d&#39;un multiple pipette et incuber pendant 5 min à température ambiante. A partir de maintenant sur le travail sans interruption. </li><li> Aspirer la solution de charge et ajouter 100 ul de PBS contenant 20 ug / ml de chloramphenicol et 2,5 mM de probénécide en utilisant une pipette multiple. Puis transférer rapidement la plaque à 96 puits dans la platine du microscope et de démarrer l&#39;acquisition à 10 min de l&#39;aspiration de la solution de chargement. </li></ol> 5. balayage laser et analyse des données <ol><li> L&#39;acquisition des images <ol><li> Définissez les conditions d&#39;imagerie de manière à maximiser le nombre de photons totale et de réduire la phototoxicité, photoblanchiment et de contre-excitation. <ol><li> Dans un laser microscope confocal à balayage moderne, utiliser un objectif ambitieux de l&#39;ouverture d&#39;immersion numérique 20X, ouvrir le trou de détection à 2,5 unités Airy (c.-à-large sectionnement optique), choisissez haute sensibilité GaAsP-détecteurs avec donneur et accepteur canaux actifs simultanément, profondeur de 8 bits , ~ 750 nm taille de pixel, 3 fois trame moyenne et EXCITe avec 10% d&#39;une diode laser à 405 nm. </li><li> Pour assurer la bonne quantification régler le gain du détecteur des deux canaux sur la même valeur et d&#39;éviter toute pixels saturés. Remarque: Ici, les gains ont été fixés à 150%. </li></ol></li><li> Assurer une immersion continue par diffusion milieu d&#39;immersion au fond des puits, par exemple avec une seringue de 1 ml, et d&#39;éviter le piégeage de bulles d&#39;air. </li><li> Activer la lumière transmise et de trouver un champ de vue représentatif dans chaque puits. Utilisez une étape automatique correctement calibré et marquer la position dans le logiciel. </li><li> Après le retrait de la plaque pour la coloration (voir rubrique 4.3), remettre la plaque et ajouter un poids sur le dessus pour éviter la dérive focale. Passez en revue les positions enregistrées avec le mode de balayage laser et la mise au point et la position latérale correctement. </li><li> Régler le laps de temps de 2 min, la durée de 2 heures et commencer à l&#39;acquisition. </li></ol></li><li> Image quantification (exemples seront donnés pour Bitplane Logicielssont tels que Imaris) <ol><li> Importer l&#39;ensemble de données dans un logiciel qui permet des calculs arithmétiques de matrices de pixels. Pour ce faire, par glisser-déposer le fichier source contenant à la fois le donneur et le canal de l&#39;accepteur sur l&#39;icône du logiciel. </li><li> Soustraire le fond dans les deux canaux en utilisant le même décalage. Pour ce faire, cliquez sur Menu, puis cliquez sur Image&gt; Traitement&gt; Baseline soustraction. Sélectionnez chaque canal et entrez la valeur de référence. </li><li> Corrigez la purge par le biais du canal des bailleurs de fonds (K1) dans le canal de l&#39;accepteur (CH2) avec le facteur de correction f pré-déterminé (voir 1.1), la création d&#39;une nouvelle chaîne: Ch2 &#39;= CH2 - K1 * f REMARQUE: une purge par de l&#39;accepteur dans le canal de donneur était non détectable sur le niveau de bruit. <ol><li> Cliquez sur Menu&gt; Traitement d&#39;image&gt; Canal Arithmétique et entrez abs (CH2- (CH1 * 0,33)). Ensuite supprimer Channel 2 en cliquant sur Menu&gt; Modifier&gt; Supprimer des chaînes. Veiller à ce que lasaigner à travers le canal-accepteur corrigée reste comme le nouveau canal 2. Facultatif: Changez la couleur de canal du gris à la couleur originale en allant à Menu&gt; Édition&gt; Propriétés de l&#39;image. Sélectionnez Channel 4&gt; mappé Couleur&gt; Couleur de base et changer pour par exemple, vert. </li></ol></li><li> Créer une nouvelle chaîne avec l&#39;opération suivante pour déterminer le coefficient relatif FRET: Ch3 = CH2 &#39;/ (Ch1 + Ch2&#39;) <ol><li> Allez dans Menu&gt; Image Processing&gt; Canal Arithmétique et entrez CH2 ./ (CH1 + CH2) </li></ol></li><li> Pour visualisation correcte du canal FRET dans une image de 8 bits, de créer un quatrième canal: CH4 = 255 * Ch3 <ol><li> Allez dans Menu&gt; Image Processing&gt; Canal Arithmétique et entrez 255 * CH3. Changez la couleur de canal en allant à Menu&gt; Propriétés Modifier&gt; Image. Sélectionnez Channel 4&gt; fichier mappé Table Couleur&gt; Couleur&gt; Jet. </li></ol></li><li> Appliquer un filtre médian 3x3 aux canaux CH3 et CH4 that permettra de réduire le bruit dans les images. Pour ce faire, cliquez sur Menu&gt; Traitement d&#39;image&gt; Lissage&gt; filtre médian. Sélectionnez les deux canaux et d&#39;appliquer une taille de filtre &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Pour la quantification des signaux cellulaires, de détecter les cellules de CH4 configuré correctement le décalage et de filtrer les structures de la taille d&#39;exclure trop petites structures. <ol><li> Sélectionnez la vue Surpass et cliquez sur l&#39;icône &quot;Ajouter de nouvelles surfaces&quot;. Définir les paramètres de l&#39;algorithme de détection dans la fenêtre de la surface. Pour un traitement plus rapide, activer le deux cases à cocher &quot;Segment seulement une région d&#39;intérêt» et «toute image de process enfin&quot;. Définir la région d&#39;intérêt en modifiant ses dimensions. </li><li> Sélectionnez Channel 4 que le canal de source et régler le seuil par seuillage&gt; soustraction de fond (contraste local) et définir un diamètre de 10 um. Réglez le seuil d&#39;intensité moins manuellement à 0 et le seuil maximal à l&#39;intensification maximaleTy. Filtrer les structures par zone et définir la valeur minimum par exemple, 187 μm². Terminez la détection de surface. </li></ol></li><li> Extraire les valeurs moyennes de l&#39;intensité de la fluorescence du donneur (CH1) et le coefficient de FRET relatif (CH3) et leurs écarts-types de l&#39;entité cellulaire. Pour ce faire, allez dans les propriétés de surface. Changer l&#39;apparence des structures en sélectionnant Surfaces Style / Qualité&gt; Surface. Sélectionnez toutes les structures en cliquant sur l&#39;onglet Filtres. Unifier les structures détectées en allant à Processus de sélection&gt; Unify. Exporter les statistiques de production en surface vers MS Excel en cliquant sur l&#39;onglet Statistiques&gt; Exporter toutes les statistiques de fichier. </li><li> Tracer ces valeurs au fil du temps. Identifier l&#39;intervalle de pente maximale d&#39;augmentation de fluorescence de canal des donateurs pour chaque condition comme un paramètre raisonnable pour représenter la quantité d&#39;effecteur une translocation 10 min. Calculer la pente comme Δ m = intensité de fluorescence du donneur / Δ temps (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous ici appliqué avec succès un essai à base TEM-1 bêta-lactamase reporter pour l&#39;analyse quantitative des effecteur translocation par Y. enterocolitica. De nombreuses variantes de cette technique sensible, spécifique et relativement simple ont été décrits dans la littérature. Dans cette étude, la microscopie à balayage laser a été réalisée pour la détection plus sensible et précise de signaux de fluorescence. Plus précisément, la correction de diaphonie entre les colorants donneur et accepteur et...

III systèmes de sécrétion de type sont spécialisés machines protéines exportation utilisées par les différents genres de bactéries gram-négatives de livrer directement des protéines effectrices codées par des bactéries dans les cellules cibles eucaryotes. Bien que la machinerie de sécrétion lui-même est hautement conservée, des ensembles spécialisés de protéines effectrices ont évolué entre les différentes espèces bactériennes à manipuler voies de signalisation cellulaire et faciliter les stratégies de virulence bactériennes spécifiques 1. En cas de Yersinia, jusqu&#39;à sept protéines effectrices, que l&#39;on appelle (protéines extérieures Yersinia) Yops, sont transportés au moment du contact de la cellule hôte et d&#39;agir de concert pour renverser les réponses des cellules immunitaires telles que la phagocytose et la production de cytokines, à savoir, pour permettre la survie extracellulaire des bactéries 2-4. Le processus de translocation est étroitement contrôlée à différents stades 5. Il est établi que l&#39;activation de la SST3 primaire est déclenchée par le contact de la cible thisll 6. Cependant, le mécanisme précis de cette ouverture n&#39;a pas encore été élucidé. Dans Yersinia un deuxième niveau de ce qu&#39;on appelle de réglage fin de la translocation est réalisé par haut ou bas-régulation de l&#39;activité des protéines cellulaires Rho GTP Rac1 ou RhoA. L&#39;activation de Rac1 par exemple invasine ou cytotoxique facteur nécrosante Y (CNF-Y) entraîne une augmentation de la translocation 7-9, tandis que le GAP (GTPase activating protein) fonction de translocation YopE down-régule l&#39;activité Rac1 et diminue en conséquence la translocation par un type de rétroaction négative mécanisme de 10,11. Méthodes valides et précises sont la condition préalable pour étudier comment la translocation est régulée au cours Yersinia interaction de la cellule hôte. De nombreux systèmes différents ont été utilisés à cet effet, chacune des avantages et des inconvénients spécifiques. Certaines approches reposent sur la lyse de cellules infectées par des bactéries, mais pas différents détergents suivie d&#39;une analyse par transfert de Western. The inconvénient commun de ces méthodes est que la lyse bactérienne mineure mais inévitable contamine éventuellement le lysat cellulaire avec des protéines effectrices bactéries associées. Cependant, le traitement des cellules avec de la protéinase K pour dégrader les protéines effectrices extracellulaires et l&#39;utilisation ultérieure de la digitonine pour la lyse sélective des cellules eucaryotes ont été proposés pour 12 minimiser ce problème. Surtout, ces essais dépendent de façon cruciale sur les anticorps anti-effectrices de haute qualité, qui ne sont généralement pas disponibles dans le commerce. Les tentatives d&#39;utilisation de fusions traductionnelles des protéines effectrices et les protéines fluorescentes comme la GFP pour suivre la translocation ont échoué probablement dû à la structure tertiaire des protéines globulaires fluorescents et l&#39;incapacité de l&#39;appareil de sécrétion de les déplier avant 13 sécrétion. Cependant, plusieurs mots-clés différents rapporteurs comme le cya (calmoduline-dépendante l&#39;adénylate cyclase) domaine de la toxine de Bordetella pertussis cyclolysin 14 ou Flashtag ont été utilisés avec succès pour analyser translocation. Dans le premier essai de l&#39;activité enzymatique de cya est utilisé pour amplifier le signal de la protéine de fusion intracellulaire, tandis que la balise de Flash, une étiquette de motif très court tétracystéine (4Cys), permet pour l&#39;étiquetage avec le colorant de Flash biarsénicale sans perturber le processus de sécrétion 15. L&#39;approche appliquée ici a été signalé pour la première fois par Charpentier et al., Et est basé sur la conversion intracellulaire de la Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) colorant CCF4 par translocation effecteur TEM-1 bêta-lactamase fusions 16 (figure 1A). CCF4 / AM est un composé de cellules infiltrant dans laquelle un dérivé de la coumarine (donneur) et une fraction de fluorescéine (accepteur) sont reliées par un noyau de céphalosporine. Lors de l&#39;entrée passive dans la cellule eucaryote, la non-estérifié composé fluorescent CCF4 / AM est traitée par les estérases cellulaires au CCF4 chargé et fluorescent et ainsi piégédans la cellule. Excitation de la fraction de coumarine à 405 nm de résultats FRET à la fraction de fluorescéine, qui émet un signal de fluorescence verte à 530 nm. Après clivage du noyau de céphalosporine par la bêta-lactamase FRET est perturbé et l&#39;excitation de la fraction de coumarine conduit à l&#39;émission de fluorescence bleue at460 nm. Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l&#39;analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, la technique a été utilisée dans un modèle d&#39;infection de la souris pour identifier les populations de leucocytes ciblées pour la translocation in vivo 17-19. Compteur de signaux peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Il faut noter que le procédé prévoit également la possibilité de contrôler la translocation en temps réel par microscopie des cellules vivantes au cours de la 20,21 processus de l&#39;infection. Ici, la microscopie par fluorescence à balayage laser a été appliquée pour readout des signaux de fluorescence comme il offre la plus élevée sensibilité et la précision. En particulier, la capacité d&#39;ajuster la fenêtre d&#39;émission avec une précision nanométrique en combinaison avec des détecteurs de haute sensibles facilite optimisé détection par fluorescence et minimisé la diaphonie. En outre, cette configuration de microscopie peut être adapté pour la surveillance en temps réel de la translocation et permet potentiellement pour l&#39;analyse simultanée de interaction hôte-pathogène au niveau cellulaire. Dans cette étude, les taux d&#39;un Y. de translocation enterocolitica souche de type sauvage et un mutant de deletion YopE présentant un phénotype de hypertranslocator 10,11 ont été analysés de manière exemplaire.

<table><tbody><tr><td>LB-Agar</td><td>Roth</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate salin tamponné</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 96 puits (noir, fond clair)</td><td>Greiner Bio One 655087</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hyperglucose, supplément GlutaMAX, pyruvate</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Kit de chargement avec CCF4-AM</td><td>Life Technologies</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Lectine de Triticum vulgaris (blé) FITC conjugué</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td><td>Utilisé pour la détermination de l’émission de pics et de la diaphonie</td></tr><tr><td>V450 Anti-souris CD8a</td><td>BD Bioscience</td><td>560469</td><td>Utilisé pour la détermination de l’émission de pics et de la diaphonie</td></tr><tr><td>Huile d’immersion Immersol W&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>Indice de réfraction = 1,3339 @ 23 &deg ; C</td></tr><tr><td>TCS SP5 II microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica microsystèmes</td><td></td><td>2x détecteurs GaAsP-Hybrid, spectromètre 4 canaux, séparateur de faisceau optique acusto, platine XY motorisée, sténopé réglable, objectif 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405&#160 ; Laser à diode NM 50&#160 ; Logiciel mW</td></tr><tr><td>Imaris 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Plugins inclus ImarisXT et MeasurementPro</td></tr><tr><td>Compilateur MatLab runtime</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>Logiciel</td><td></td><td></td> GraphPad</tr></tbody></table>

analyse de<em&gt; yersinia enterocolitica</em&gt; effecteur translocation dans les cellules hôtes à l&#39;aide de bêta-lactamase effecteur fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

De nombreuses bactéries gram-négatives, y compris pathogène Yersinia spp. Emploient de type III systèmes de sécrétion de translocation des protéines effectrices dans des cellules cibles eucaryotes. A l&#39;intérieur de la cellule hôte les protéines effectrices de manipuler les fonctions cellulaires au profit des bactéries. Pour mieux comprendre le contrôle de sécrétion de type III lors de l&#39;interaction de la cellule hôte, sensible et dosages précis pour mesurer la translocation sont obligatoires. Nous décrivons ici l&#39;application d&#39;un dosage basé sur la fusion d&#39;un fragment de protéine effectrice Yersinia enterocolitica (protéine extérieur Yersinia; YopE). Avec TEM-1 ß-lactamase pour l&#39;analyse quantitative de translocation Le test repose sur le clivage d&#39;une cellule de permeation FRET colorant (CCF4 / AM) par une translocation fusion bêta-lactamase. Après avoir clivé le noyau de Cephalosporine de CCF4 par la bêta-lactamase, de la coumarine FRET est perturbé à la fluorescéine et l&#39;excitation de la fraction de coumarine conduit à l&#39;émission de fluorescence bleue.Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l&#39;analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, dans un modèle de souris. La détection des signaux de fluorescence peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Dans l&#39;installation décrite ici, à la translocation in vitro de fusions effectrices dans des cellules HeLa par des mutants de Yersinia différents est contrôlée par microscopie à balayage laser. Enregistrement conversion intracellulaire de la journaliste de FRET par la bêta-lactamase effecteur fusion en temps réel fournit des résultats quantitatifs robustes. Nous montrons ici des exemples de données, ce qui démontre la translocation accrue par un Y. enterocolitica YopE mutant par rapport à la souche de type sauvage.

Pour démontrer la capacité de la méthode décrite pour analyser quantitativement effecteur translocation dans les cellules cibles, deux souches de Yersinia avec des cinétiques différentes de translocation ont été étudiés: Y. enterocolitica souche de type sauvage WA-314 (sérogroupe O8, hébergeant le plasmide de virulence pYVO8 22) et son dérivé WA-314ΔYopE (WA-314 hébergeant pYVO8ΔYopE 23). Des travaux antérieurs ont montré que Y. mutants dépourvus enterocoliti...

La translocation effectrice dans les cellules hôtes via un système de sécrétion de type III est une stratégie de virulence courante chez les bactéries à Gram négatif. Un test basé sur la fusion d’effecteurs bêta-lactamases pour l’analyse quantitative de la translocation a été appliqué. Dans les cellules infectées par Yersinia, la conversion d’un rapporteur FRET par la bêta-lactamase est surveillée à l’aide d’une microscopie à balayage laser.

Analyse de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l&#39;aide de bêta-lactamase effecteur Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer la translocation de protéines effectrices dans les cellules hôtes via le système de sécrétion de type trois vernia. Ceci est réalisé en incubant des cellules HeLa avec des mutants de yersinia exprimant des fusions entre l'effecteur TEM-1 et la bêta-lactamase, permettant ainsi la translocation de ces fusions effectrices dans les cellules HeLa. Dans une deuxième étape, les cellules HeLa infectées sont chargées avec un composé rapporteur FRET perméant aux cellules, qui est transformé par les estérases cellulaires en CCF4 chargé et non fluorescent, et ainsi piégé à l'intérieur de la cellule.La prochaine clivaison du CCF quatre par la bêta-lactamase située en trans entraîne la rupture de fre, ce qui est enregistré par microscopie à balayage laser afin d'analyser les intensités de fluorescence du donneur et de l'accepteur. Les résultats montrent des quantités différentes de l'effecteur TEM une fusion avec la bêta-lactamase localisée en trans, selon la cinétique de l'augmentation de la fluorescence du donneur. L'un des principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que le traitement intercellulaire du composé CCF quatre fournit un outil hautement spécifique et sensible pour mesurer la translocation.La méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogénie bactérienne, telles que la manière dont la translocation est finement régulée pendant l'interaction entre les bactéries et les cellules hôtes. Un jour avant l'infection, inoculer trois vials distincts contenant trois millilitres de milieu LB et les antibiotiques requis avec une colonie provenant de chacune des souches transformées de Y. enterocolitica préparées comme décrit dans le protocole texte d'accompagnement. Préparer également des plaques contenant des cellules HeLa la veille de l'infection en semant 15 000 cellules dans 200 microlitres de milieu de culture dans neuf puits d'une plaque de 96 puits. Incuber les cellules dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius le jour de l'infection.Inoculez deux millilitres de la culture de nuit dans 40 millilitres de milieu LB frais sans antibiotiques. Incubez les bactéries pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius dans un agitateur à 180 tr/min. Cela induira l'expression du système de sécrétion de type trois. Après 90 minutes, transférez les cultures dans un tube propre et maintenez-les sur de la glace.À partir de ce moment, centrifuger les cultures pendant 10 minutes à 5 000 G et à quatre degrés Celsius afin de former un culot bactérien. Ensuite, resuspendre le culot dans deux à trois millilitres de PBS glacé, diluer la suspension bactérienne à une concentration de 800 millions d'unités formant des colonies par millilitre, puis placer les cultures sur de la glace.Ensuite, déterminez la densité optique correspondante de chaque culture. Ajoutez 3,5 microlitres de la suspension bactérienne de chaque souche dans des puits différents de la plaque 96 préparée. Mélangez en aspirant et en expulsant doucement le milieu deux fois, puis laissez les bactéries sédimenter sur les cellules selon un taux de multiplicité d'infection d'environ 100 bactéries par cellule.Réalisez un cours temporel en démarrant les infections à des intervalles de 30 minutes et en maintenant les cellules dans une enceinte à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius. Après chaque infection, 90 minutes après la première infection, aspirez soigneusement le milieu sans retirer aucune des cellules HeLa. Ajoutez ensuite 50 microlitres de PBS contenant 20 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 2,5 millimolaire de pronic.Cela interrompra l'expression des effecteurs et réduira l'exportation du CCF4. Pour préparer la microscopie, assurez-vous d'une immersion continue en étalant le milieu d'immersion jusqu'au fond des puits, à l'aide d'une seringue d'un millilitre. Évitez de piéger des bulles d'air dans le milieu d'immersion.Ensuite, transférez la plaque de 96 puits sur la platine du microscope et localisez des zones appropriées pour une analyse ultérieure dans chacun. Terminez cette étape en moins de 10 minutes. Puis ajoutez 70 microlitres de solution de chargement CF 4:00 AM dans chaque puit.Incubez soigneusement la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez la solution de chargement et ajoutez 100 microlitres de PBS contenant 20 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 2,5 millimolaires de pronic. Puis démarrez rapidement la microscopie.Placez un objectif à immersion à haute ouverture numérique avec un grossissement de 20 fois en position et ouvrez le diaphragme du détecteur à 2,5 unités d'Airy, puis transférez la plaque à 96 puits sur la platine de balayage laser confocal. Ensuite, sélectionnez des détecteurs à phosphure d'arséniure de gallium à haute sensibilité avec des canaux donneur et accepteur activés simultanément. Utilisez une moyenne triple d'images avec une profondeur de 8 bits et excitez avec 10 % d'un laser à diode de 405 nanomètres.Pour garantir une quantification correcte, réglez le gain du détecteur des deux canaux à la même valeur et évitez tout pixel saturé. Ensuite, activez la lumière transmise et vérifiez à nouveau les champs de vision représentatifs dans chaque puits ; ajustez et réenregistrez les positions selon les besoins à l’aide d’un plateau motorisé calibré. Enfin, réglez l’intervalle de temps à deux minutes, la durée à deux heures, puis commencez l’acquisition d’images.Après l'acquisition des images, importez le jeu de données dans un logiciel permettant des calculs arithmétiques sur les matrices de pixels. Soustrayez le fond dans les deux canaux en utilisant le même décalage en cliquant d'abord sur le menu, puis allez dans le traitement d'image et sélectionnez la soustraction de la ligne de base. Ensuite, sélectionnez chaque canal et saisissez la valeur de la ligne de base.Corrigez le recouvrement du canal du donneur, canal un, dans le canal du capteur, canal deux, à l’aide du facteur de correction prédéterminé, en créant à cet effet un nouveau canal, canal deux prime. Cliquez sur le menu, puis sélectionnez Traitement d’image, suivi de Arithmétique des canaux, et entrez la valeur absolue du canal deux soustraite de 0,33 fois le canal un. Ensuite, supprimez le canal deux et assurez-vous que le canal du capteur corrigé du recouvrement reste comme nouveau canal deux.Ensuite, créez un nouveau canal à l'aide de l'opération indiquée ici afin de déterminer le coefficient de transfert d'énergie par résonance (FRET) relatif. Puis, retournez dans le menu d'arithmétique des canaux et saisissez le canal deux divisé par le canal un plus le canal deux pour une visualisation correcte du canal FRET. Dans une image 8 bits, créez un quatrième canal, le canal quatre, égal à 255 fois le canal trois.Modifiez la couleur du canal en accédant au menu des propriétés de l'image, sélectionnez le canal quatre, puis la couleur mappée, suivie du fichier de table de couleurs, et choisissez jet. Ensuite, appliquez un filtre médian 3 × 3 aux canaux trois et quatre. Cela réduira le bruit dans les images en accédant au menu de traitement d'image et en sélectionnant lissage.Ensuite, appliquez un filtre médian, sélectionnez les deux canaux et utilisez une taille de filtre de trois par trois par un pour la quantification des signaux cellulaires. Détectez les cellules dans le canal quatre en choisissant la vue en surbrillance et en cliquant sur l'icône. Ajoutez de nouvelles surfaces.Définissez les paramètres de l'algorithme de détection dans la fenêtre de surface et activez les deux cases à cocher. Segmentez uniquement une région d'intérêt et traitez l'image entière. Enfin, définissez la région d'intérêt en modifiant ses dimensions.Sélectionnez le canal quatre comme canal source et définissez le seuil en accédant au menu de seuil et en activant la soustraction du fond. Réglez le diamètre à 10 micromètres, le seuil d'intensité minimum manuellement à zéro et le seuil maximum à l'intensité maximale. Filtrez les structures par aire et définissez la valeur minimale à 187 micromètres carrés.Ensuite, terminez la détection de la surface. Enfin, extrayez les valeurs moyennes de l'intensité de fluorescence du donneur dans le canal un et du coefficient de FRET relatif dans le canal trois, ainsi que leurs écarts types au niveau de l'entité cellulaire. Afin de démontrer la capacité de cette méthode à analyser quantitativement la translocation des effecteurs dans les cellules cibles, deux souches de yersinia présentant des cinétiques de translocation différentes ont été étudiées à l'aide de la fluorescence du donneur et des coefficients de FRET relatifs.Les cellules infectées de type sauvage montrent une augmentation de l'intensité de fluorescence au fil du temps. Comme prévu, la pente maximale de l'intensité de fluorescence est positivement corrélée avec la durée de l'infection, indiquant que différentes concentrations de bêta-lactamase traduite peuvent être distinguées, conformément aux études antérieures. Les cellules infectées par le mutant délété YOPE de yersinia présentent une augmentation plus rapide de l'intensité de fluorescence par rapport à la souche de type sauvage.Curieusement, une extension de l' infection à 90 minutes n'a pas accéléré davantage la montée de la fluorescence du donneur par rapport à 60 minutes d' infection. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l' esprit que le traitement du composé CCR four débute immédiatement après son ajout. Par conséquent, il est essentiel de commencer l' acquisition des images en temps voulu.

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