Surveillance de l’assemblage d’un facteur de virulence bactérienne sécrété à l’aide d’une réticulation spécifique au site

L’objectif général de l’expérience suivante est d’examiner la dynamique des interactions protéiques à l’intérieur d’une cellule vivante. Ceci est réalisé en exprimant d’abord une protéine d’intérêt chez e coli, en incorporant l’analogue d’acide aminé benzoyl phényl alanine dans la protéine à un endroit spécifique et en effectuant un marquage radio de chasse d’impulsions pour marquer une petite population de molécules de protéines synthétisées de manière synchrone. Dans un deuxième temps.

Des aliquotes de cellules collectées à différents moments au cours de la poursuite sont irradiées pour déclencher la formation de liaisons covalentes entre la protéine d’intérêt et tous les facteurs avec lesquels elle interagit. Ensuite, les protéines sont immunoprécipitées avec des anticorps spécifiques et résolues par électrophorèse sur gel de poly acrylamide SDS afin d’identifier les facteurs en interaction, des résultats sont obtenus qui montrent des changements dans les interactions entre la protéine d’intérêt et d’autres facteurs intracellulaires au fil du temps en fonction des changements dans la mobilité électrophorétique des produits de réticulation. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la co-immunoprécipitation ou la réticulation chimique, est sa capacité à générer des informations temporelles sur les interactions qui se produisent entre un résidu spécifique d’une protéine d’intérêt et d’autres molécules.

Ces données sont particulièrement précieuses lorsqu’il s’agit d’étudier la progression d’une protéine à travers une voie d’assemblage en plusieurs étapes et d’identifier les intermédiaires d’assemblage. Bien que cette méthode ait été optimisée pour une utilisation dans e coli, elle peut également être utilisée dans d’autres systèmes, y compris d’autres bactéries, levures et cellules de mammifères. Les détails pour la préparation de la culture se trouvent dans le protocole textuel.

Préparez brièvement cinq millilitres de milieu M neuf contenant 0,2 % de glycérol, tous les acides aminés el sauf la méthionine et la cystine et les antibiotiques commencez les cultures pendant la nuit en ajoutant e coli transformé avec un plasmide qui code pour la protéine d’intérêt avec une mutation ambrée et le plasmide qui code pour le système de suppression ambré incuber à 37 degrés Celsius. Le jour de l’expérience, ajoutez une quantité appropriée de cellules de la culture de nuit dans un erlenmeyer de 250 millilitres contenant 50 millilitres de milieu M neuf et des antibiotiques pour obtenir une densité optique à 550 nanomètres de 0,03. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau agitée.

Lorsque les cultures atteignent le début ou le milieu de la phase logarithmique, ajoutez 50 microlitres d’une molaire de benzoyle, de phénylalanine ou de BPA à chaque culture. Ajouter le BPA une goutte à la fois tout en faisant tourner le ballon pour éviter les précipitations. Ensuite, ajoutez tous les inducteurs nécessaires à l’expression du mutant ambré.

Continuez à incuber les cultures à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires pendant la période d’induction de 30 minutes. Étiquetez six tubes à centrifuger jetables de 15 millilitres avec le point temporel et plus UV ou moins uv. Placez les tubes étiquetés sur de la glace.

Placez une plaque de culture tissulaire à six puits sur un deuxième seau à glace rempli de glace. Allumez la lampe UV cinq minutes avant l’étiquetage radio. Ajoutez ensuite environ deux millilitres de glace dans chaque tube étiqueté moins UV et dans deux des puits de la plaque multi-puits.

Il est essentiel d’aérer la glace directement dans les tubes et les puits pour arrêter immédiatement les réactions intracellulaires à chaque point temporel et ainsi obtenir un instantané précis de la voie biochimique à la fin de la période d’induction de 30 minutes. Transférez 25 millilitres de la culture dans un erlenmeyer jetable préchauffé de 125 millilitres. Placez le ballon dans le bain-marie à 37 degrés Celsius.

Les étapes de l’étiquetage par chasse d’impulsions et de l’irradiation UV doivent être effectuées en temps opportun et nécessitent une organisation considérable et une préparation avancée. Ajoutez 30 micro-curies par millilitre de méthionine et de cystéine marquées S 35 à la culture et remuez rapidement pour mélanger à la fois. Une minute zéro seconde.

Ajoutez 250 microlitres d’une solution non radioactive de méthionine cystéine de 100 millimolaires et remuez rapidement. Pour mélanger immédiatement, pipetez quatre millilitres de la culture dans l’un des puits de la plaque multi-puits réfrigérée qui contient de la glace, pipetez une deuxième aliquote de quatre millilitres dans le tube de 15 millilitres étiqueté zéro minute moins UV à la fois. Deux minutes zéro seconde.

Pipetez quatre millilitres de la culture dans un deuxième puits de la plaque multi-puits réfrigérée qui contient de la glace. Ensuite, pipetez une autre aliquote de quatre millilitres dans le tube de 15 millilitres étiqueté une minute moins UV immédiatement avant le point temporel de cinq minutes à environ deux millilitres de glace jusqu’à un troisième puits dans la plaque multipuits à des moments de six minutes zéro seconde. Pipetez quatre millilitres de la culture dans le troisième puits de la plaque multipuits réfrigérée qui contient le tuyau à glace.

Il y avait une autre aliquote de quatre millilitres dans le tube de 15 millilitres étiqueté cinq minutes moins uv. Placez le seau à glace avec la plaque multipuits sous la lampe UV préchauffée et irradiez chaque échantillon individuellement pendant quatre minutes. Transférez les cellules dans les tubes réfrigérés de 15 millilitres étiquetés zéro minute plus uv, une minute plus UV et ainsi de suite.

Ensuite, centrifugez les cellules à 2 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Remettre en suspension chaque échantillon dans 300 microlitres de milieu M neuf ou PBS et 33 microlitres d’acide trichloracétique 100 % froid ou TCA pour précipiter les protéines centrifuger le TCA précipite dans une micro fuge à vitesse maximale pendant 10 minutes. Avant de retirer le sate, ajoutez 50 microlitres de tampon de solubilisation à chaque échantillon et chauffez en agitant à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour solubiliser la protéine précipitée.

Après avoir ajouté un millilitre de tampon de test de radio-immunoprécipitation, effectue des immunoprécipitations standard en utilisant un cinquième à la moitié de chaque échantillon. Résoudre les protéines immunoprécipitées par le sulfate de sodium ESAL, l’électrophorèse sur gel de poly acrylamide ou la page SDS. Enfin, exposez les gels colorés et séchés à un écran phospho pendant la nuit et pour détecter les protéines radioactives, y compris les produits de réticulation avec un imageur phospho.

Pour cette expérience, les codons de pH alanine aux résidus 1113 et 1214 du domaine bêta de l’ESPP ont été remplacés par des codons ambrés. La structure cristalline du domaine bêta de l’ESPP montre que les deux résidus se trouvent tous deux du côté périplasmique du baril bêta, séparés d’environ 120 degrés. Deux polypeptides différents ont été immunoprécipités à partir de cellules irradiées et de cellules témoins par l’anti-ESPP C terminal et le sérum.

Initialement, une forme précurseur d’environ 135 kilodaltons de la protéine qui contient des domaines passager et bêta liés de manière covalente prédominait à des moments ultérieurs. Le niveau de PRO ESPP a diminué et le domaine bêta libre a commencé à prédominer car le domaine passager était translocalisé à travers la membrane externe et séparé du domaine bêta par un clivage protéolytique. Cependant, il était clair que les échantillons rayonnés par les UV I présentaient des bandes de poids moléculaire plus élevées qui n’étaient pas présentes dans les échantillons témoins.

Ces bandes résultent de la réticulation de PRO ESPP à des protéines en interaction sur la base de la mobilité de ces polypeptides, les tailles des protéines en interaction ont été estimées pour tester si elles pouvaient correspondre à des facteurs d’assemblage de protéines de membrane externe connus. Des immunoprécipitations supplémentaires à l’aide d’anti cera généré contre les partenaires d’interaction présumés ont été effectuées. Un polypeptide d’environ 150 kilodaltons qui a été observé lorsque le BPA a été incorporé aux résidus 1113 et 1214 a pu être immunoprécipité avec un antisérum contre le chaperon périplasmique de 17 kilodaltons.

De plus, nous avons constaté que les polypeptides plus grands qui ont été observés lorsque le BPA était incorporé à une seule des deux positions pouvaient être immunoprécipités avec de l’anti-céra contre les sous-unités du complexe BAM, BAM B et BAM D respectivement. Après avoir effectué cette procédure, les produits de réticulation peuvent être purifiés et d’autres méthodes, y compris la spectrométrie de masse, peuvent être effectuées pour aider à identifier les facteurs qui interagissent avec une protéine d’intérêt. Après avoir regardé avec la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de combiner avec succès le marquage par chasse d’impulsions avec la réticulation de photos spécifiques au site pour étudier la dynamique d’interaction de votre protéine, d’intérêt avec d’autres molécules à l’intérieur de la cellule vivante.