Détection des bactéries à l'aide ADNzymes fluorogènes

L’objectif global de l’expérience suivante est de détecter rapidement la présence de bactéries spécifiques telles que E coli à l’aide de nouvelles sondes d’ADN génique de la grippe D’abord, l’ADN génique complet. Les sondes Zyme sont générées par ligature. Les bactéries sont ensuite cultivées pour enrichir le nombre de molécules cibles et un mélange extracellulaire accumulé est préparé à partir du surnageant.

Le mélange extracellulaire brut est ensuite combiné avec l’interaction de la sonde de zyme d’ADN entre la sonde de zyme d’ADN et les molécules cibles, ce qui entraîne un clivage de la sonde, qui devient ensuite fluorescente à l’aide de celle-ci. Une interaction du fluorimètre entre la sonde et la cible est considérée comme une augmentation de la fluorescence relative. Les résultats sont ensuite vérifiés à l’aide d’une analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes PCR ou basées sur des anticorps est que la procédure est plus simple et plus facile à réaliser. Bien que cette méthode ait été développée avec le modèle bacterium e coli, elle peut être appliquée à la détection de tout autre pathogène bactérien d’origine alimentaire ou nosocomiale. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal parce qu’elles ne sont peut-être pas habituées à la manipulation de sondes d’ADN synthétiques et de bactéries.

R-F-D-E-C one est le Zyme d’ADN en vedette. Il se compose de la séquence catalytique EC soulignée en noir et de la séquence de substrat FS soulignée en vert contenue dans le substrat est une liaison d’ARN indiquée par le r bleu flanquée d’un DT marqué au fluor indiqué par le F et d’un QUENCHER étiqueté DT indiqué par la file d’attente RF SS un est une version brouillée de RFD EEC un où la séquence catalytique EEC un est partiellement mélangée dans SS un, mais la portion de l’EF reste inchangée. RF DEC one et RF SS one sont fabriqués par ligature enzymatique médiée par matrice de l’oligonucléotide FS un avec l’oligonucléotide EC un ou SS un en présence de LT un comme modèle de ligature pour préparer des mélanges extracellulaires bruts ou cems qui seront utilisés comme cible pour R-F-D-E-C un commencer par distribuer deux millilitres de LB dans des tubes de culture stériles de 14 millilitres à l’aide d’un pistolet à pipette.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélevez une seule colonie d’E. coli sur une plaque de tarière et déposez-la dans un tube de culture contenant lb. Placez les tubes dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et secouez à 250 tr/min pendant 14 heures après l’incubation. Pour générer une culture d’inoculation à 1 %, distribuez deux millilitres de LB frais dans des tubes de culture de 14 millilitres et ajoutez 20 microlitres de la culture bactérienne de l’étape précédente.

Incuber les tubes à 37 degrés Celsius en les secouant à 250 tr/min jusqu’à ce que chaque solution bactérienne atteigne une DO 600 d’environ un transfert. Un millilitre de chaque culture dans un nouveau microtube à centrifuger de 1,5 millilitre et granuler les cellules par centrifugation à 11 000 G pendant cinq minutes. Après l’essorage, transférez le surnageant transparent dans un microtube à centrifuger frais de 1,5 millilitre.

Stockez le surnageant à moins 20 degrés Celsius. S’il n’est pas immédiatement utilisé pour déterminer si un signal fluorescent est généré par l’interaction des enzymes de l’ADN avec l’extrait brut de cellule, les échantillons sont analysés par photométrie spectrale. Allumez le spectrophotomètre fluorescent et configurez les paramètres d’acquisition de données avec une excitation à 488 nanomètres et une émission à 520 nanomètres.

Configurez également l’instrument pour qu’il prenne des mesures toutes les minutes pendant une heure. Lavez trois cuvettes en cristal de quartz d’abord avec de l’eau déminéralisée distillée, puis avec de l’éthanol à 100 %. Sécher les cuvettes en faisant clignoter de l’azote gazeux.

Étiquetez les cuvettes comme C un pour le contrôle, C, deux pour le contrôle deux et T pour le test, puis transférez 24 microlitres d’eau distillée déminéralisée à C un et 24 microlitres du mélange extracellulaire brut préparé e coli à C deux et T. Ajoutez 25 microlitres de deux X RB à chaque vétérinaire Q et placez-les dans le spectrophotomètre fluorescent. Commencez à collecter des données de fluorescence après cinq minutes, ajoutez un microlitre de cinq micromolaires RFS S un à C deux et un microlitre de cinq micromolaires, RFD eec un à T et C un en veillant à ce que les lectures de fluorescence ne soient pas interrompues. Mélangez chaque solution par pipetage, puis laissez la réaction se poursuivre pendant le reste de la période d’acquisition.

Enregistrez les données au format Excel. Transférez ensuite les données sur un ordinateur personnel et utilisez Excel pour créer une image graphique. Les mêmes mélanges réactionnels qui ont été utilisés pour l’analyse par Spectra.

La photométrie peut être utilisée pour l’analyse par électrophorèse sur gel. Après une heure d’acquisition. Retirez les cuvettes du spectrophotomètre et transférez les solutions dans de nouveaux microtubes à centrifuger.

Éteignez les réactions en ajoutant cinq microlitres d’acétate de sodium à trois molaires et 125 microlitres d’éthanol à 100 %. Mélangez chaque solution par vortex et placez les tubes dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant une heure après la centrifugeuse d’incubation. Les mélanges réactionnels à 11 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et éliminent soigneusement le surnageant par pipetage.

Séchez les granulés à l’aide d’un concentrateur d’ADN pendant 10 minutes. Ajoutez 20 microlitres de tampon de chargement de gel et vortex brièvement. Faites tourner brièvement avec une centrifugeuse de paillasse.

Ensuite, chargez 10 microlitres d’échantillons de réaction par puits de gel 10 % Dage après le cycle. Retirez les plaques de verre et lavez-les soigneusement à l’eau du robinet. Pour retirer les morceaux de gel, essuyez les plaques avec une lingette Kim.

Scannez la fluorescence de la plaque de gel à l’aide d’un scanner de typhon. Analysez les images résultantes à l’aide d’un logiciel de quantification d’image pour évaluer la sensibilité du système. Les cultures diluées en série sont cultivées pendant des périodes de plus en plus longues.

Pour déterminer la période d’incubation minimale requise pour détecter une seule bactérie, préparez 10 tubes de culture contenant deux millilitres de lb, inoculez chaque culture avec 100 microlitres de deux UFC par millilitre d’un stock de glycérol d’e coli et incubez à 37 degrés Celsius en agitant à 250 tr/min à 4, 8, 12, 16 et 24 heures. Récoltez 300 microlitres de chacun des tubes de culture inoculés, car il peut n’y avoir aucune bactérie détectable pour les échantillons récoltés à temps. Points 4, 8 et 12.

Laissez la culture restante croître pendant 24 heures afin d’identifier les cultures contenant des bactéries. Mesurer la DO 600 et précipiter les cellules par centrifugation à 11 000 G pendant cinq minutes. Transférez le surnageant qui contient le CEMS dans des microtubes à centrifuger frais de 1,5 millilitre et conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé le lendemain.

Inspectez les cultures pour détecter la croissance. Seulement une ou deux des 10 cultures peuvent contenir E. coli après l’inoculation et les tubes restants ne contiendront aucune cellule. Pour préparer les réactions de clivage avec RFD EEC one, analysez les mélanges réactionnels à l’aide de l’électrophorèse sur gel DAGE comme décrit précédemment, les sondes RFD EEC one et RF SS one ont été préparées par ligature enzymatique des parties de zyme d’ADN sur le substrat.

FS une interaction de CEM EEC et RFD EEC one ou RF SS one a ensuite été évaluée par spectrométrie. Comme on peut le voir ici. R-F-D-E-C one a produit un niveau élevé de signal fluorescent lors de l’ajout de CEM ec.

En revanche, R FS S one n’a pas produit un signal fluorescent fort. D’où la fonction de production de fluorescence de RFD EEC one. Lors du contact CEM, EC est séquencé.

Spécifique pour vérifier que les augmentations de fluorescence observées étaient dues au clivage de la liaison ARN. Les mélanges réactionnels ont été analysés par clivage dage de RFD eec, un par 0,25 molaire d’hydroxyde de sodium devrait générer des fragments NA 2D, un fragment à cinq premiers temps conservant le fluor et un fragment à trois premiers temps conservant le quencher. Comme on peut le voir ici.

Le mélange réactionnel RFD EEC CEM EEC a effectivement produit le produit de clivage attendu. De plus, seuls le R-F-D-E-C clivé UNC et le fragment cinq premiers ont pu être détectés par imagerie de fluorescence. Afin d’examiner la spécificité de la RFD EEC, un test de fluorescence a été effectué à l’aide de CEMS prélevés uniquement sur plusieurs autres bactéries à Gram négatif et à Gram positif.

L’échantillon contenant CEM EC a produit une augmentation de la fluorescence. L’absence de réactivité croisée avec les CEMS des autres bactéries indique que R-F-D-E-C one est très sélectif pour E. coli afin de déterminer le temps de culture minimum requis pour détecter une seule cellule d’E. coli diluée à un UFC par millilitre dans 100 microlitres cultivés avec un milieu de croissance pendant 4, 8, 12, 16 et 24 heures. Le SSCE résultant mélangé à R-F-D-E-C et au clivage a été évalué par dage, comme illustré ici.

Une image du test de Dage indique que R-F-D-E-C one n’a pas produit le produit de clivage attendu. Lorsqu’il a réagi avec CEM. ECS collecté à quatre et huit heures de croissance, indiquant qu’un temps de culture de 12 heures est nécessaire une fois maîtrisé.

L’élément clé de cette technique que le dosage basé sur l’enzyme DA peut être effectué en 60 minutes s’il est effectué correctement Après ce développement. La procédure a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la bio-analyse pour explorer les enzymes d’ADN allogéniques pour la détection d’un large éventail d’agents pathogènes bactériens.