Détection des bactéries à l'aide ADNzymes fluorogènes

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter rapidement la présence de bactéries spécifiques telles que E. coli à l'aide de nouveaux sondes ADN fluogéniques, appelées sondes ADN Zyme. Tout d'abord, les sondes ADN Zyme géniques complètes sont produites par ligature. Ensuite, les bactéries sont cultivées afin d'enrichir le nombre de molécules cibles, et un mélange extracellulaire accumulé est préparé à partir du surnageant.

Le mélange extracellulaire brut est ensuite combiné au sondage ADNzyme ; l'interaction entre le sondage ADNzyme et les molécules cibles entraîne le clivage du sondage, qui devient alors fluorescent. L'utilisation d'un fluorimètre permet de détecter l'interaction entre le sondage et la cible par une augmentation de la fluorescence relative. Les résultats sont ensuite vérifiés par une analyse en électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes basées sur la PCR ou sur les anticorps réside dans sa simplicité et sa facilité de mise en œuvre. Bien que cette méthode ait été développée à l’aide de la bactérie modèle Escherichia coli, elle peut être appliquée à la détection de tout autre pathogène bactérien transmis par les aliments ou d’origine nosocomiale. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car elles ne sont pas nécessairement habituées à la manipulation de sondes d’ADN synthétiques et de bactéries. La procédure est démontrée par Sergio Aguire, assistant de recherche de mon laboratoire, et Monso Ali, chercheur postdoctoral, pour ce protocole.

R-F-D-E-C un est le DZyme ADN mis en évidence. Il est constitué de la séquence catalytique EC un soulignée en noir et de la séquence substrat FS un soulignée en vert ; le substrat contient un lien ARN indiqué par le r bleu flanqué d'un DT marqué par un fluorophore indiqué par F et d'un DT marqué par un inhibiteur indiqué par Q. RF SS un est une version brouillée de RFD EEC un, dans laquelle la séquence catalytique EEC un est partiellement réorganisée en SS un, mais la portion FS un reste inchangée. RF DEC un et RF SS un sont synthétisés par ligation enzymatique médiée par un modèle, reliant l'oligonucléotide FS un à l'oligonucléotide EC un ou SS un en présence de LT un agissant comme modèle de ligation, afin de préparer des mélanges extracellulaires bruts ou cems qui seront utilisés comme cible pour R-F-D-E-C un. Commencez par distribuer deux millilitres de LB dans des tubes de culture stériles de 14 millilitres à l'aide d'une pipette automatique.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélever une colonie unique d’*E. coli* à partir d’une boîte de culture et la déposer dans un tube contenant du milieu LB. Placer les tubes dans un incubateur réglé à 37 °C et agiter à 250 tr/min pendant 14 heures après l’incubation. Pour préparer une culture de réensemencement à 1 %, distribuer 2 millilitres de milieu LB frais dans des tubes de culture de 14 millilitres et ajouter 20 microlitres de la culture bactérienne obtenue à l’étape précédente.

Incuber les tubes à 37 degrés Celsius avec agitation à 250 tr/min jusqu'à ce que chaque solution bactérienne atteigne une DO 600 d'environ un transfert. Transférer un millilitre de chaque culture dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et former un culot des cellules par centrifugation à 11 000 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, transférer le surnageant clair dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre propre.

Conserver le surnageant à moins 20 degrés Celsius. S’il n’est pas utilisé immédiatement pour déterminer si un signal fluorescent est généré par l’interaction des enzymes d’ADN avec l’extrait cellulaire brut, les échantillons sont analysés par spectrophotométrie. Allumer le spectrophotomètre de fluorescence et régler les paramètres d’acquisition des données avec une excitation à 488 nanomètres et une émission à 520 nanomètres.

Réglez également l'appareil pour effectuer des mesures chaque minute pendant une heure. Lavez trois cuvettes en quartz d'abord avec de l'eau distillée déionisée, puis avec de l'éthanol à 100 %. Séchez les cuvettes en soufflant du gaz azote.

Étiqueter les cuvettes comme C1 pour le témoin 1, C2 pour le témoin 2 et T pour l'échantillon test. Transférer ensuite 24 microlitres d'eau distillée désionisée dans C1 et 24 microlitres du mélange extracellulaire brut d'E. coli préparé dans C2 et T. Ajouter 25 microlitres de RB 2X dans chaque cuvette et les placer dans le fluorimètre. Commencer l'acquisition des données de fluorescence après cinq minutes, puis ajouter une microlitre de RFS S1 à 5 micromolaire dans C2 et une microlitre de RFD eec1 à 5 micromolaire dans T et C1, en veillant à ce que les mesures de fluorescence ne soient pas interrompues. Mélanger chaque solution à l'aide d'une pipette, puis laisser la réaction se poursuivre pendant le reste de la période d'acquisition.

Enregistrez les données au format de fichier Excel. Ensuite, transférez les données sur un ordinateur personnel et utilisez Excel pour créer une image graphique. Les mêmes mélanges réactionnels qui ont été utilisés pour l'analyse par Spectra.

La photométrie peut être utilisée pour l'analyse par électrophorèse sur gel. Après une heure d'acquisition, retirez les cuvettes du spectrophotomètre et transférez les solutions dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse.

Arrêter les réactions en ajoutant cinq microlitres d'acétate de sodium trois molaire et 125 microlitres d'éthanol à 100 %. Mélanger chaque solution par vortexage et placer les tubes au congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant une heure après la centrifugation d'incubation. Centrifuger les mélanges réactionnels à 11 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis retirer soigneusement le surnageant par pipetage.

Séchez les culots à l'aide d'un concentrateur d'ADN pendant 10 minutes. Ajoutez 20 microlitres de tampon de charge pour gel et vortexez brièvement. Faites une courte centrifugation avec une centrifugeuse de table.

Ensuite, charger 10 microlitres des échantillons de réaction par puits d'un gel Dage 10 % après l'électrophorèse. Retirer les plaques de verre et les rincer soigneusement à l'eau du robinet. Pour éliminer tout résidu de gel, essuyer les plaques avec un essuie-tout Kim.

Analyser la plaque de gel en fluorescence à l'aide d'un scanneur Typhoon. Analyser les images obtenues à l'aide d'un logiciel de quantification d'images pour évaluer la sensibilité du système. Des cultures diluées en série sont cultivées pendant des durées croissantes.

Pour déterminer la période d'incubation minimale nécessaire pour détecter une bactérie unique, préparez 10 tubes de culture contenant chacun deux millilitres de LB, inoculez chaque culture avec 100 microlitres de deux UFC par millilitre d'une conservation glycérolée d’E. coli, puis incubez à 37 degrés Celsius sous agitation à 250 tr/min aux temps de 4, 8, 12, 16 et 24 heures. Récupérez 300 microlitres à partir de chacun des tubes de culture inoculés, car il pourrait ne pas y avoir de bactéries détectables dans les échantillons prélevés aux temps 4, 8 et 12 heures.

Laisser la culture restante croître pendant 24 heures afin d'identifier les cultures contenant des bactéries. Mesurer l'OD 600 et précipiter les cellules par centrifugation à 11 000 G pendant cinq minutes. Transférer le surnageant, qui contient les CEMS, dans de nouveaux tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre, puis conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation le lendemain.

Inspectez les cultures pour observer la croissance. Une ou deux seulement des 10 cultures peuvent contenir des e coli après inoculation, les tubes restants ne contenant aucune cellule. Utilisez les CEMS récupérés à partir des cultures positives aux points temporels désignés pour préparer les réactions de clivage avec RFD EEC one, analysez les mélanges réactionnels par électrophorèse sur gel DAGE comme décrit précédemment, les sondes RFD EEC one et RF SS one ayant été préparées par ligation enzymatique des portions ADNzyme au substrat.

L'interaction FS entre CEM EEC et RFD EEC un ou RF SS un a ensuite été évaluée par spectrométrie. Comme on peut le voir ici, R-F-D-E-C un a produit un niveau élevé de signal fluorescent suite à l'ajout de CEM ec.

En revanche, R FS S un n'a pas produit de signal fluorescent intense. Ainsi, la fonction de production de fluorescence de RFD EEC un. Après contact avec CEM EC, il est séquencé.

Spécifique pour vérifier que les augmentations de fluorescence observées étaient dues au clivage de la liaison ARN. Les mélanges réactionnels ont été analysés par clivage dage de RFD eec, un clivage par l'hydroxyde de sodium à 0,25 molaire devant générer des fragments d'ADN 2D, un fragment en cinq prime conservant le marqueur fluorophore et un fragment en trois prime conservant l'extincteur. Comme on peut le voir ici.

Le mélange réactionnel RFD EEC CEM EEC a effectivement produit le produit de clivage attendu. En outre, seule UNC a clivé R-F-D-E-C, et le fragment cinq-prime pouvait être détecté par imagerie de fluorescence. Afin d'examiner la spécificité de RFD EEC, des dosages par fluorescence ont été réalisés en utilisant des CEMS prélevés uniquement à partir de plusieurs autres bactéries à Gram négatif et à Gram positif.

L'échantillon contenant les CEM EC a produit une augmentation de la fluorescence. L'absence de réactivité croisée avec les CEMS des autres bactéries indique que R-F-D-E-C un est hautement sélectif pour E. coli. Afin de déterminer le temps de culture minimal requis pour détecter une seule cellule d'E. coli, E. coli a été dilué à une UFC par millilitre dans 100 microlitres et cultivé avec du milieu de croissance pendant 4, 8, 12, 16 et 24 heures. Les CEMS obtenus ont ensuite été mélangés à R-F-D-E-C un et le clivage a été évalué par dage, comme illustré ici.

Une image du test Dage indique que R-F-D-E-C n'a pas produit le produit de clivage attendu. Lorsqu'il est réagi avec CEM, le SCE recueilli après quatre et huit heures de croissance indique qu'un temps de culture de 12 heures est nécessaire une fois maîtrisé.

Le composant clé de cette technique est que le dosage basé sur l'enzyme DA peut être réalisé en 60 minutes, à condition d'être effectué correctement après ce développement. Cette procédure a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'analyse biologique d'explorer des enzymes d'ADN allogéniques pour la détection d'un large éventail de pathogènes bactériens.