Name: Détection des bactéries à laide ADNzymes fluorogènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Découvrez une méthode de détection bactérienne rapide utilisant des sondes ADNzymes fluorogènes pour identifier Escherichia coli. Cette technique simplifiée offre une alternative efficace aux méthodes PCR traditionnelles.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Le financement de ce travail a été fourni par les sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et le Réseau de papier bioactif Sentinel.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Bacterial+Detection%3A+Biosensors%2C+Recognition+Receptors+and+Microsystems%22">Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems</a>. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+Opportunities+for+Pathogen+Detection+Using+DNA+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays.</a> Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li>
<li>Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+detection%3A+A+perspective+of+traditional+methods+and+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).</li>
<li>Velusamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+foodborne+pathogen+detection%3A+In+the+perspective+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors.</a> Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).</li>
<li>Ali, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+Probes+as+Bacterial+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Nucleic+Acid+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional Nucleic Acid Sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Li, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Y+%22Functional+Nucleic+Acids+for+Analytical+Applications%22">Functional Nucleic Acids for Analytical Applications</a>. , Springer. New York. (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+Years+of+In+Vitro+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Forty Years of In Vitro Evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).</li>
<li>Breaker, R. R., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+enzyme+that+cleaves+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A DNA enzyme that cleaves RNA.</a> Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).</li>
<li>Cuenoud, B., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+metalloenzyme+with+DNA+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity.</a> Nature. 375, 611-614 (1995).</li>
<li>Chinnapen, D. J., Sen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deoxyribozyme+that+harnesses+light+to+repair+thymine+dimers+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Silverman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+as+a+versatile+chemical+component+for+catalysis%2C+encoding%2C+and+stereocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).</li>
<li>Mei, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+RNA-cleaving+DNA+enzyme+that+synchronizes+catalysis+with+fluorescence+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).</li>
<li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal-ion+specificities+and+pH+dependences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+catalytically+efficient+acidic+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quenching+of+fluorophore-labeled+DNA+oligonucleotides+by+divalent+metal+ions%3A+implications+for+selection%2C+design%2C+and+applications+of+signaling+aptamers+and+signaling+deoxyribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).</li>
<li>Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+secondary+structure+and+identifying+functionally+essential+nucleotides+of+pH6DZ1%2C+a+fluorescence-signaling+and+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalization+of+six+abandoned+catalytic+DNA+species+reveals+a+common+three-way+junction+framework+and+diverse+catalytic+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores.</a> J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+high-branching+deoxyribozymes+from+a+catalytic+DNA+with+a+three-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction.</a> Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+and+rational+engineering+of+trans-acting+pH6DZ1%2C+an+RNA-cleaving+and+fluorescence-signaling+deoxyribozyme+with+a+four-way+junction+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+BioChem%22%5BJournal%5D)">Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure.</a> Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).</li>
<li>Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pH3DZ1+-+An+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+3%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3.</a> Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224(2007).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).</li>
<li>Kandadai, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5.</a> Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+assembly+of+nanospecies+on+repetitive+DNA+sequences+generated+on+gold+nanoparticles+by+rolling+circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification.</a> Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).</li>
<li>Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li>
<li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La plupart des méthodes courantes de détection bactérienne aujourd&#39;hui sont soit lent (microbienne classique) ou techniquement exigeants (anticorps, PCR). Ainsi, nous pensons que la prochaine génération d&#39;outils de détection doit répondre vers la vitesse et la simplicité. À cette fin, nous avons créé un ARN-clivage et la fluorescence de signalisation DNAzyme qui peut être utilisé pour développer des essais simples pour signaler la présence de bactéries à travers la génération d&#39;un signal de fluorescence. La vedette DNAzyme sonde, RFD-EC1, est activé par le CEM produite pendant la croissance de E. coli dans les milieux de culture. Depuis notre méthode utilise des mélanges bruts extracellulaires d&#39;une bactérie que l&#39;objectif de détection et de court-circuite l&#39;extraction laborieuse cible et d&#39;amplification, il peut être utilisé pour mettre en place très simple, &quot;mix-and-lire&quot; type de tests pour la détection bactérienne. L&#39;utilisation de notre DNAzyme ne se limite pas à la méthode basée sur la détection par fluorescence. Par exemple, la détection colorimétrique en utilisant le même système de dosage DNAzyme cune être conçus en utilisant une méthode précédemment rapporté que exploite amplification par cercle roulant en conjonction avec un colorant organique 32. Nous prévoyons l&#39;utilisation de ADNzymes pour la détection bactérienne comme une séduisante avenue pour générer de nouveaux biocapteurs bactériens avec une plus grande simplicité opérationnelle.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue ou de modèle </td></tr><tr><td> Gélose </td><td> BioShop Canada </td><td> AGR003 </td></tr><tr><td> Persulfate d&#39;ammonium (APS) </td><td> BioShop Canada </td><td> AMP001 </td></tr><tr><td> L&#39;acrylamide / bis-acrylamide (40%, 29:1) </td><td> BioShop Canada </td><td> ACR004 </td></tr><tr><td> L&#39;acide borique </td><td> BioShop Canada </td><td> BOR001 </td></tr><tr><td> Bleu de bromophénol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> EM Science </td><td> EXO539-1 </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38281 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada </td><td> HEP001 </td></tr><tr><td> Bouillon LB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> EMDProduits chimiques </td><td> B10149-34 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop Canada </td><td> SOD002 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> EMD Chemicals </td><td> SXO255-1 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> EMD Chemicals </td><td> SXO590-1 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> BioShop Canada </td><td> SDS001 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShop Canada </td><td> TEM001 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> BioShop Canada </td><td> BST666 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9416 </td></tr><tr><td> Urée </td><td> BioShop Canada </td><td> URE001 </td></tr><tr><td> Xylenecyanol FF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X4126 </td></tr><tr><td> Concentrateur d&#39;ADN </td><td> Thermo Scientific </td><td> Savant ADN SpeedVac 120 </td></tr><tr><td> Millex unité de filtre </td><td> Millipore </td><td> SLGP033RS </td></tr><tr><td> Conseils pour le chargement de gel </td&gt; <td> DiaMed </td><td> TEC200EX-K </td></tr><tr><td> Logiciel ImageQuant </td><td> Dynamique Moléculaire </td><td> Version 5.0 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark Professional </td><td> 34705 </td></tr><tr><td> Mini Vortexer </td><td> VWR </td><td> 58816-121 </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Pechiney Plastic Packaging </td><td> PM996 </td></tr><tr><td> Des boîtes de Pétri </td><td> Fisher Scientific </td><td> Fisherbrand 08-757-12 </td></tr><tr><td> Stripettor Plus (pipette arme à feu) </td><td> Corning </td><td> 07764714 </td></tr><tr><td> Cuves en quartz </td><td> Varian Inc </td><td> 66-100216-00 </td></tr><tr><td> Shaker / Incubateur </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> Classic Series C24 </td></tr><tr><td> Typhoon Scanner </td><td> GE Healthcare </td><td> 9200 mode Variable </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> X Allegra22-R </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre UV </td><td> Thermo Scientific </td><td> GenesysUV 10 </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre à fluorescence </td><td> Varian Inc </td><td> Cary Eclipse </td></tr></tbody></table>

détection des bactéries à l&#39;aide adnzymes fluorogènes

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Les épidémies liées aux agents pathogènes d'origine alimentaire et aux infections nosocomiales sont responsables de millions de décès et d'hospitalisations, ainsi que de pertes économiques colossales chaque année. La prévention de ces épidémies et la réduction de l'impact d'une épidémie en cours entraînent une demande croissante de méthodes analytiques capables d'identifier avec précision les agents pathogènes responsables au stade le plus précoce possible. Bien qu'un large éventail de méthodes efficaces de détection des pathogènes existe, aucune ne satisfait simultanément aux cinq critères essentiels suivants, qui définissent une méthode idéale : une grande spécificité (détection uniquement de la bactérie ciblée), une haute sensibilité (capacité à détecter une seule cellule bactérienne vivante), un délai d'obtention des résultats court (quelques minutes à quelques heures), une grande simplicité d'utilisation (pas besoin de procédures d'échantillonnage longues ni de matériel spécialisé) et un coût modéré. Par exemple, les méthodes microbiologiques classiques sont très spécifiques, mais nécessitent un temps long (de plusieurs jours à plusieurs semaines) pour obtenir un résultat définitif.1 Les techniques basées sur la PCR ou sur les anticorps offrent des délais d'attente plus courts (quelques heures à plusieurs jours), mais exigent l'utilisation de réactifs coûteux et/ou d'équipements sophistiqués.2-4 Par conséquent, la recherche scientifique doit encore s'efforcer de développer de nouvelles méthodes de détection bactérienne offrant des caractéristiques améliorées selon un ou plusieurs de ces critères. Notre laboratoire s'intéresse à l'exploration du potentiel des DNAzymes comme nouvelle classe de sondes moléculaires pour des applications de biosenseurs, notamment la détection bactérienne.5
Les ADNzymes (également connues sous le nom de désoxyribonucléozymes ou enzymes à ADN) sont des molécules d'ADN monocaténaires synthétiques capables de catalyser des réactions chimiques.6-8 Ces molécules peuvent être isolées à partir d'un grand pool d'ADN à séquences aléatoires (contenant jusqu'à 1016 séquences individuelles) par un procédé appelé sélection in vitro ou « SELEX » (évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel).9-16 Ces molécules d'ADN particulières ont été largement étudiées ces dernières années comme outils moléculaires pour des applications de biosensation.6-8
Notre laboratoire a mis au point des procédures de sélection in vitro permettant d'isoler des DNAzymes fluorescents clivant l'ARN (RFD ; Fig. 1) et a étudié l'utilisation des RFD comme outils analytiques.17-29 Les RFD catalysent le clivage d'un substrat chimère ADN-ARN au niveau d'une jonction unique de ribonucléotide (R) encadrée par un fluorophore (F) et un inhibiteur (Q). La proximité étroite entre F et Q rend le substrat non clivé faiblement fluorescent. Toutefois, l'événement de clivage entraîne la séparation de F et Q, accompagnée d'une augmentation significative de l'intensité de fluorescence.
Plus récemment, nous avons mis au point une méthode d'isolement de RFD pour la détection bactérienne.5 Ces RFD particuliers ont été isolés pour « s'illuminer » en présence du mélange extracellulaire brut (CEM) laissé par un type spécifique de bactéries dans leur environnement ou dans le milieu de culture (Fig. 1). L'utilisation du mélange brut permet d'éviter le processus fastidieux de purification et d'identification d'une cible appropriée à partir du micro-organisme d'intérêt pour le développement de biocapteurs (ce qui pourrait prendre des mois, voire des années). Le recours à des cibles extracellulaires signifie que la procédure d'analyse est simple, car il n'est pas nécessaire d'effectuer des étapes destinées à obtenir des cibles intracellulaires.
En utilisant l'approche décrite ci-dessus, nous avons obtenu un RFD qui clive son substrat (FS1 ; Fig. 2A) uniquement en présence du CEM produit par E. coli (CEM-EC).5 Ce RFD détectant E. coli, nommé RFD-EC1 (Fig. 2A), s'est révélé strictement sensible au CEM-EC, mais insensible aux CEM d'une série d'autres bactéries (Fig. 3).
Nous présentons ici les procédures expérimentales clés pour la mise en place de tests de détection d'E. coli à l'aide de RFD-EC1 et des résultats représentatifs.

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche pour générer des sondes DNAzyme fluorogènes qui peuvent être appliqués à mettre en place un simple, «mix-and-lire&quot; immunofluorescence pour la détection bactérienne. Ces sondes d&#39;ADN spécifiques catalyser le clivage d&#39;un chromophore de modification d&#39;ADN-ARN substrat chimérique en présence d&#39;un mélange brut extracellulaire (LEC) produite par une bactérie spécifique, traduisant ainsi la détection de bactéries dans la génération du signal de fluorescence. Dans ce rapport, nous allons décrire les principaux procédures expérimentales où une sonde DNAzyme spécifique notée &quot;RFD-EC1&quot; est employé pour la détection de la bactérie modèle,<em&gt; Escherichia coli (E. coli)</em&gt;.

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Les épidémies liées aux agents pathogènes d'origine alimentaire et nosocomiaux sont responsables de millions de décès et d'hospitalisations, ainsi que de pertes économiques colossales...

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter rapidement la présence de bactéries spécifiques telles que E. coli à l'aide de sondes ADN Zyme fluogéniques novatrices. Tout d'abord, des sondes ADN Zyme géniques complètes sont produites par ligature. Ensuite, les bactéries sont cultivées afin d'enrichir le nombre de molécules cibles, et un mélange extracellulaire accumulé est préparé à partir du surnageant.Le mélange extracellulaire brut est ensuite combiné au sondage ADNzyme ; l'interaction entre le sondage ADNzyme et les molécules cibles entraîne le clivage du sondage, qui devient alors fluorescent. L'utilisation d'un fluorimètre permet de détecter l'interaction entre le sondage et la cible par une augmentation de la fluorescence relative. Les résultats sont ensuite vérifiés par une analyse en électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes basées sur la PCR ou sur les anticorps réside dans sa simplicité et sa facilité de mise en œuvre. Bien que cette méthode ait été développée à l’aide de la bactérie modèle Escherichia coli, elle peut être appliquée à la détection de tout autre pathogène bactérien transmis par les aliments ou d’origine nosocomiale. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car elles ne sont pas nécessairement habituées à la manipulation de sondes d’ADN synthétiques et de bactéries. La procédure est démontrée par Sergio Aguire, assistant de recherche de mon laboratoire, et Monso Ali, chercheur postdoctoral, pour ce protocole.R-F-D-E-C un est le DZyme ADN mis en évidence. Il est constitué de la séquence catalytique EC un soulignée en noir et de la séquence substrat FS un soulignée en vert ; le substrat contient un lien ARN indiqué par le r bleu flanqué d'un DT marqué par un fluorophore indiqué par F et d'un DT marqué par un extincteur indiqué par Q. RF SS un est une version brouillée de RFD EEC un, dans laquelle la séquence catalytique EEC un est partiellement réorganisée en SS un, mais la portion FS un reste inchangée. RF DEC un et RF SS un sont synthétisés par ligation enzymatique médiée par un gabarit, reliant l'oligonucléotide FS un à l'oligonucléotide EC un ou SS un en présence de LT un agissant comme gabarit de ligation, afin de préparer des mélanges extracellulaires bruts ou cems qui seront utilisés comme cible pour R-F-D-E-C un. Commencez par distribuer deux millilitres de LB dans des tubes de culture stériles de 14 millilitres à l'aide d'une pipette automatique.Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélever une colonie unique d’*E. coli* à partir d’une boîte de Petri contenant un milieu gélosé LB et la déposer dans un tube de culture contenant du milieu LB. Placer les tubes dans un incubateur réglé à 37 °C et agiter à 250 tr/min pendant 14 heures après l’incubation. Pour préparer une culture de réinoculation à 1 %, distribuer 2 millilitres de milieu LB frais dans des tubes de culture de 14 millilitres et ajouter 20 microlitres de la culture bactérienne obtenue à l’étape précédente.Incuber les tubes à 37 degrés Celsius avec agitation à 250 tr/min jusqu'à ce que chaque solution bactérienne atteigne une DO 600 d'environ un transfert. Transférer un millilitre de chaque culture dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et former un culot des cellules par centrifugation à 11 000 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, transférer le surnageant clair dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre propre.Conserver le surnageant à moins 20 degrés Celsius. S’il n’est pas utilisé immédiatement pour déterminer si un signal fluorescent est généré par l’interaction des enzymes d’ADN avec l’extrait cellulaire brut, les échantillons sont analysés par spectrophotométrie. Allumer le spectrophotomètre de fluorescence et configurer les paramètres d’acquisition des données avec une excitation à 488 nanomètres et une émission à 520 nanomètres.Réglez également l'appareil pour effectuer des mesures chaque minute pendant une heure. Lavez trois cuvettes en quartz d'abord avec de l'eau distillée déionisée, puis avec de l'éthanol à 100 %. Séchez les cuvettes en soufflant du gaz azote.Étiqueter les cuvettes C1 pour le témoin 1, C2 pour le témoin 2 et T pour le test. Transférer ensuite 24 microlitres d'eau distillée désionisée dans C1 et 24 microlitres du mélange extracellulaire brut d'E. coli préparé dans C2 et T. Ajouter 25 microlitres de 2X RB dans chaque cuvette et les placer dans le fluorimètre. Commencer la collecte des données de fluorescence après cinq minutes, ajouter un microlitre de RFS S1 à cinq micromolaire à C2 et un microlitre de RFD eec1 à cinq micromolaire à T et C1, en veillant à ce que les mesures de fluorescence ne soient pas interrompues. Mélanger chaque solution à l’aide d’une pipette, puis laisser la réaction se poursuivre pendant le reste de la période d’acquisition.Enregistrez les données au format de fichier Excel. Ensuite, transférez les données sur un ordinateur personnel et utilisez Excel pour créer une image graphique. Les mêmes mélanges réactionnels qui ont été utilisés pour l'analyse par spectrométrie.La photométrie peut être utilisée pour l'analyse par électrophorèse sur gel. Après une heure d'acquisition, retirez les cuvettes du spectrophotomètre et transférez les solutions dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse.Arrêter les réactions en ajoutant cinq microlitres d'acétate de sodium trois molaire et 125 microlitres d'éthanol à 100 %. Mélanger chaque solution par vortexage et placer les tubes dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant une heure après la centrifugation d'incubation. Centrifuger les mélanges réactionnels à 11 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis retirer soigneusement le surnageant par pipetage.Séchez les culots à l'aide d'un concentrateur d'ADN pendant 10 minutes. Ajoutez 20 microlitres de tampon de charge pour gel et vortexez brièvement. Faites une courte centrifugation avec une centrifugeuse de banc.Ensuite, charger 10 microlitres des échantillons de réaction par puits d'un gel Dage 10 % après l'électrophorèse. Retirer les plaques de verre et les rincer soigneusement à l'eau du robinet. Pour éliminer tout résidu de gel, essuyer les plaques avec un essuie-tout Kim.Analyser la plaque de gel en fluorescence à l'aide d'un scanner Typhoon. Analyser les images obtenues à l'aide d'un logiciel de quantification d'images pour évaluer la sensibilité du système. Des cultures diluées en série sont cultivées pendant des durées croissantes.Pour déterminer la période d'incubation minimale nécessaire pour détecter une bactérie unique, préparez 10 tubes de culture contenant chacun deux millilitres de LB, inoculez chaque culture avec 100 microlitres de deux UFC par millilitre d'une souche d'E. coli en stock glycérolé, puis incubez à 37 degrés Celsius sous agitation à 250 tr/min à 4, 8, 12, 16 et 24 heures. Récupérez 300 microlitres à partir de chacun des tubes de culture inoculés, car il pourrait ne pas y avoir de bactéries détectables dans les échantillons prélevés aux temps 4, 8 et 12 heures.Laisser la culture restante croître pendant 24 heures afin d'identifier les cultures contenant des bactéries. Mesurer l'OD 600 et précipiter les cellules par centrifugation à 11 000 G pendant cinq minutes. Transférer le surnageant, qui contient les CEMS, dans de nouveaux tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre, puis conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation le lendemain.Inspectez les cultures pour observer la croissance. Une ou deux seulement des 10 cultures peuvent contenir des e coli après inoculation, les tubes restants ne contenant aucune cellule. Utilisez les CEMS récupérés à partir des cultures positives aux points temporels désignés pour préparer des réactions de clivage avec la RFD EEC une, analysez les mélanges réactionnels par électrophorèse sur gel DAGE comme décrit précédemment, les sondes RFD EEC une et RF SS une ont été préparées par ligation enzymatique des portions ADNzyme au substrat.Une interaction FS entre CEM EEC et RFD EEC un ou RF SS un a ensuite été évaluée par spectrométrie. Comme on peut le voir ici, R-F-D-E-C un a produit un niveau élevé de signal fluorescent suite à l'ajout de CEM ec.En revanche, R FS S un n'a pas produit un signal fluorescent intense. Ainsi, la fonction de production de fluorescence de RFD EEC un. Après contact avec CEM EC, il est séquencé.Spécifique pour vérifier que les augmentations de fluorescence observées étaient dues au clivage de la liaison ARN. Les mélanges réactionnels ont été analysés par électrophorèse après clivage de RFD eec, un clivage par l'hydroxyde de sodium à 0,25 molaire devant générer des fragments d'ADN 2D, un fragment en cinq prime conservant le fluorophore et un fragment en trois prime conservant l'extincteur. Comme on peut le voir ici.Le mélange réactionnel RFD EEC CEM EEC a effectivement produit le produit de clivage attendu. En outre, seule UNC a clivé R-F-D-E-C, et le fragment cinq-prime pouvait être détecté par imagerie de fluorescence. Afin d'examiner la spécificité de RFD EEC, des dosages par fluorescence ont été réalisés en utilisant des CEMS prélevés uniquement chez plusieurs autres bactéries à Gram négatif et à Gram positif.L'échantillon contenant les CEM EC a produit une augmentation de la fluorescence. L'absence de réactivité croisée avec les CEMS des autres bactéries indique que R-F-D-E-C un est hautement sélectif pour E. coli. Afin de déterminer le temps de culture minimal requis pour détecter une seule cellule d'E. coli, E. coli a été dilué à une UFC par millilitre dans 100 microlitres et cultivé avec un milieu de croissance pendant 4, 8, 12, 16 et 24 heures. Les CEMS obtenus ont ensuite été mélangés à R-F-D-E-C un et le clivage a été évalué par dage, comme illustré ici.Une image du test Dage indique que R-F-D-E-C n'a pas produit le produit de clivage attendu. Lorsqu'il est réagi avec CEM, l'ECS recueilli aux heures quatre et huit de croissance indique qu'un temps de culture de 12 heures est nécessaire une fois maîtrisé.Le composant clé de cette technique est que le dosage basé sur l'enzyme DA peut être réalisé en 60 minutes, à condition d'être effectué correctement après ce développement. Cette procédure a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'analyse biologique d'explorer des enzymes ADN allogéniques pour la détection d'un large éventail de pathogènes bactériens.

detection-of-bacteria-using-fluorogenic-dnazymes

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Kim, H. et al., Dépistage multi-enzymatique utilisant un système de criblage enzymatique génétique à haut débit. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre une méthode de dépistage génétique permettant de détecter l’expression enzymatique à l’aide de bibliothèques de fosmides métagénomiques et de substrats chromogéniques. La cytométrie en flux identifie et isole des cellules individuelles produisant des produits colorés, permettant une sélection à haut débit des cellules actives exprimant...

Détection de l’expression de l’enzyme cible dans les cellules bactériennes génétiquement modifiées

Cette vidéo présente une technique permettant de détecter les contaminants bactériens dans des échantillons d’aliments et d’eau à l’aide de nanocapteurs. Les bactéries pathogènes cibles sont détectées par une combinaison de relaxation magnétique et de modalités d’émission de fluorescence.

Détection de la contamination bactérienne à l’aide de nanocapteurs magnétofluorescents

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Ici, une méthode de localisation des bactéries dans des tissus inclus dans la paraffine à l’aide de sondes d’ADN ciblant l’ARNr 16S marquées DIG a été décrite. Ce protocole peut être appliqué pour étudier le rôle des bactéries dans diverses maladies telles que la parodontite, les cancers et les maladies immunitaires inflammatoires.

In Situ détection des bactéries dans les tissus inclus en paraffine Utiliser une sonde ADN de digoxine marqué ciblage ARNr 16S

Nous décrivons un protocole de détection colorimétrique d’E. coli à l’aide d’un test décisif modifié qui tire parti d’un DNAzyme clivant l’ARN, de l’uréase et de billes magnétiques.

Détection colorimétrique de bactéries à l&#39;aide de test Litmus

Comprendre la fonction des processus essentiels chez les bactéries est difficile. Microscopie à fluorescence avec des colorants spécifiques à la cible peut éclairer clé dans la progression de la croissance et cycle cellulaire des cellules microbiennes. Ici, Agrobacterium tumefaciens est utilisé comme une bactérie modèle pour mettre en évidence les méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour la caractérisation des processus essentiels.

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Courant multiplexés diagnostic pour détecter Zika, virus de la dengue et chikungunya nécessitent la préparation des échantillons complexes et instrumentation coûteuse et sont difficiles à utiliser dans des environnements peu de ressource. Nous montrons un diagnostic qui utilise l’amplification isotherme avec sondes déplaçable volet spécifique à la cible à détecter et différencier ces virus avec une spécificité et une sensibilité élevée.

L’Amplification isotherme multiplexée selon plate-forme diagnostique pour détecter Zika, Chikungunya et Dengue 1

Nous présentons ici un protocole détaillé pour une technique mis à jour le zymographic dans lequel les peptides fluorescents sont utilisés comme substrat biodégradable en lieu et place des protéines natives. Électrophorèse d’échantillons biologiques dans zymogrammes de peptides fluorescents permet la détection d’un plus large éventail de protéases que les techniques de zymographic précédente.

Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents

Les antibiotiques étiquetés fluorescents sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour étudier de multiples aspects de la résistance aux antimicrobiens. Cet article décrit la préparation des antibiotiques fluorescents marqués et leur application à l’étude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Les sondes peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de résistance bactérienne (p. ex., efflux) par spectrophotométrie, cytométrie du débit et microscopie.

Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

Imagerie par fluorescence multiplexée unicellulaire pour visualiser les acides nucléiques et les protéines virales et surveiller l’infection par le VIH, le VHB, le VHB, le VHC, le virus Zika et la grippe

Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

Découvrez une méthode de détection bactérienne rapide utilisant des sondes ADNzymes fluorogènes pour identifier Escherichia coli. Cette technique simplifiée offre une alternative efficace aux méthodes PCR traditionnelles.

Détection des bactéries à l'aide ADNzymes fluorogènes

Explorer plus de vidéos