Perturbation Anti-virulente de biofilms pathogènes en utilisant Engineered Quorum-trempe Lactonases

L’objectif global de cette expérience est de démontrer l’efficacité des enzymes d’extinction du quorum dans la perturbation du biofilm bactérien. Cette méthode aidera à répondre à des questions clés dans le domaine des thérapies antibactériennes et à comprendre l’effet des lactonases sur les bactéries pathogènes dans un environnement de biofilm. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’ajouter directement des lactonases de quorum dans un environnement in vitro.

Ainsi, son effet sur la perturbation du biofilm est facilement quantifié. Terrence Tay, un technicien de notre laboratoire, fait la démonstration de cette procédure. Pour commencer, cultivez une culture de 5 millilitres d’A.baumannii S1 en LB à 30 degrés Celsius dans un incubateur à agitation pendant 16 heures.

Ajustez la culture à une OD 600 de 0,8. Ensuite, utilisez du LB frais contenant 4 milligrammes par millilitre d’enzyme GKL purifiée pour diluer la culture de un à 100. Et ajoutez 100 microlitres dans les puits d’une plaque de 96 puits.

Utilisez les couvercles pour couvrir les assiettes et placez-les dans un récipient en plastique de 10 litres. Fermez le récipient et incubez à 30 degrés Celsius pendant trois heures, avant de retirer délicatement le milieu. Ajoutez encore 100 microlitres de milieu LB frais dans les puits et incubez la plaque à 30 degrés Celsius pendant 21 heures.

Après avoir délicatement retiré le milieu, utilisez 200 microlitres d’eau stérile pour laver doucement les cellules bactériennes planctoniques. Positionnez la pointe de la pipette au fond du puits et retirez soigneusement le fluide liquide pour assurer des perturbations minimales sur le biofilm étranger entre l’interface air-liquide. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution cristalline de violet à 1 % dans chaque puits et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.

Retirez la solution de cristal violet en utilisant 200 microlitres d’eau stérile pour laver les puits trois fois. Ajoutez 100 microlitres d’acide acétique à 33 % dans chaque puits et incubez en secouant doucement pendant 15 minutes pour dissoudre le colorant. Quantifier la quantité de biofilm en mesurant l’absorbance du violet cristallin à 600 nanomètres.

La quantité de violet cristallin est proportionnelle à la quantité de biofilm formé. Pour effectuer la microscopie confocale à balayage laser, ou CLSM, des biofilms A.baumannii S1, cultivez une culture de cinq millilitres de A. baumannii S1 in LB à 30 degrés Celsius dans un incubateur à agitation pendant 16 heures. Ajuster la culture d’A. baumannii S1 à une DO 600 de 0,8.

Ensuite, utilisez du LB frais contenant 1,2 milligramme par millilitre d’enzyme GKL purifiée pour diluer la culture, un à 100, et ajoutez un millilitre dans une micro-parabole à fond de verre de 35 millilitres. Couvrez le microplat avec un couvercle et placez-le dans un récipient en plastique de 10 litres et fermez-le avant d’incuber le plat à 30 degrés Celsius pendant trois heures. Après avoir délicatement retiré le milieu, ajoutez un millilitre de milieu frais contenant 30 microlitres d’enzyme GKL purifiée, puis incubez à 30 degrés Celsius pendant encore 21 heures.

Retirez délicatement le milieu une deuxième fois et remplacez-le par un autre millilitre d’enzyme GKL dans un milieu frais. Incuber à 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, retirez délicatement le milieu et ajoutez 500 microlitres de cinq microgrammes par millilitre d’agglutinine de germe de blé conjugué Alexa Fluor 488 dissoute dans HBSS.

Incuber le microplat à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour colorer les biofilms. Pour fixer les biofilms, ajoutez 500 microlitres de formaldéhyde à 3,7 % dissous dans le HBSS et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Utilisez deux millilitres de HBSS pour laver le microplat une fois, puis retirez complètement la solution.

Conservez l’antenne dans l’obscurité à quatre degrés Celsius avant l’imagerie CLSM. Pour l’imagerie et l’analyse CLSM, utilisez un objectif 63X pour générer 97 piles par image avec un intervalle de 0,21 micron par pile. Dans l’expérience de quantification du violet cristallin, le GKL de type Wild et une enzyme améliorée d’extinction du quorum double mutant GKL ont été utilisés pour l’activité de la lactonase contre trois hydroxydécanoyl l homosérine lactone ou 3OHC10HSL, la principale molécule de quorum utilisée par A.baumanii S1.As montré ici, les deux enzymes ont pu réduire considérablement la formation de biofilms dans le type sauvage A.baumanii S1 prétraité. L’ampleur de la perturbation des biofilms par les deux enzymes n’est pas proportionnelle à leur efficacité contre le 3OHC10HSL.

Comme le montre ce tableau, le taux de renouvellement du GKL mutant est six fois plus rapide que celui du GKL de type Wild contre le 3OHC10HSL. Cependant, la différence dans l’étendue de la perturbation des biofilms entre les enzymes n’est que de deux fois. Dans cette expérience, l’enzyme mutante GKL améliorée et son enzyme inactive catecholy ont été utilisées à des fins de comparaison.

Cette image DIC montre que le traitement avec l’enzyme mutante GKL améliorée a entraîné une diminution de la taille du biofilm par rapport à l’enzyme inactive. L’analyse des images de fluorescence a également révélé une réduction de la surface, de la biomasse et de l’épaisseur moyenne des biofilms, lorsqu’ils étaient traités avec l’enzyme mutante GKL améliorée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures hors temps d’incubation si elle est réalisée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser l’élimination et la perturbation du biofilm pendant les étapes de lavage. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le comptage des cellules et les tests de stabilité enzymatique peuvent être effectuées. Cela répondra à des questions supplémentaires telles que les effets des lactonases sur la population cellulaire au sein du biofilm ainsi que leur durée d’action.

Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du traitement des maladies infectieuses pour explorer les effets des lactonases potentielles dans le biofilm produit par les bactéries pathogènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier la perturbation du biofilm par la coloration violette cristalline, et d’évaluer les changements morphologiques du biofilm par imagerie confocale. N’oubliez pas que travailler avec des matières pathogènes peut être extrêmement dangereux.

Des précautions, telles que l’utilisation d’installations appropriées de confinement des risques biologiques, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.