Name: Criblage des peptides qui activent MRGPRX2 à l’aide de cellules HEK modifiées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Découvrez un criblage de peptides activant MRGPRX2 par flux calcique dans des cellules HEK293 modifiées. Cette méthode économique permet l'identification à haut débit de ligands spécifiques pour la modulation immunitaire.

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SR et LDU aimeraient remercier Alberta Innovates Strategic Research Project, le CNRC et la subvention NSERC-Discovery pour ce projet.

1. Conception et développement d’une bibliothèque de peptides
<ol><li>Pour identifier les ligands du récepteur MRGPRX2 des mastocytes à base d’un ligand connu, c’est-à-dire PAMP-1213,suivez les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Générer une bibliothèque de peptides N-tronqués en tronquant successivement les résidus d’acides aminés N-terminaux du ligand par synthèse peptidique en phase solide (SPPS).</li>
		<li>Générer une bibliothèque de peptides tronqués C en tronquant successivement les résidus d’acides aminés C-terminal du ligand connu, successivement.</li>
		<li>Sur la base des résultats des 1.1.1 et 1.1.2, générez une bibliothèque de peptides tronqués N+ C à l’aide de SPPS en tronquant les résidus souhaités du N et du C-terminal, respectivement.</li>
		<li>Utilisez la synthèse peptidique en phase solide pour synthétiser les peptides13.</li>
		<li>Modifier le groupe N-terminal en acétyle (Ac) et le groupe C-terminal en groupe amide.</li>
		<li>Caractériser le peptide pour sa pureté par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) et pour la masse à l’aide d’un spectrophotomètre de masse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour étudier l’importance d’acides aminés spécifiques dans la molécule PAMP-12 mère, suivez les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Générez une bibliothèque de peptides à balayage de l’alanine en remplaçant les résidus d’acides aminés respectifs dans la molécule peptidique par de l’alanine, un à la fois en utilisant SPPS. Modifier le groupe N-terminal en acétyle (Ac) et le groupe C-terminal en groupe amide.</li>
		<li>Caractériser le peptide pour sa pureté par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) et pour la masse à l’aide d’un spectrophotomètre de masse. REMARQUE: Assurez-vous que les peptides synthétisés sont de haute pureté. Caractériser les peptides à l’aide de la spectroscopie de masse et de la CLHP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Culture cellulaire in vitro
<ol><li>Culturez les cellules HEK-X2 et HEK-WT en suivant les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Préparer le milieu de culture en complétant le DMEM à haute teneur en glucose avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.</li>
		<li>Passer les cellules dans des flacons de culture T-75 traités en culture tissulaire (TC) et croître dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2,jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 75-80%.</li>
		<li>Une fois confluent à 75%, lavez les cellules et ajoutez 2-3 mL de trypsine pendant 2 à 3 min. Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pour détacher les cellules.</li>
		<li>Une fois que les cellules se sont détachées, collectez les cellules dans la trypsine. Ajouter 6-9 mL de milieu frais.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 1620 x g pendant 3-5 min.</li>
		<li>Après centrifugation, jeter le surnageant pour recueillir la pastille. Resuspendez les cellules dans un milieu de culture frais. Diluer les cellules selon la concentration souhaitée. REMARQUE: Les cellules HEK sont des cellules à croissance rapide et optimisent donc les suppléments de milieu cellulaire. Les cellules HEK sont des cellules adhérentes; les passer dans des flacons de culture traités par TC pour soutenir l’adhérence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez une plaque d’essai de 96 puits pour l’expérience.<ol>
<li>Ajouter 200 μL de suspension cellulaire dans chaque puits, avec une concentration de 200 000 cellules/mL, pour ensemencer 40 000 cellules/puits.</li>
		<li>Cultivez les cellules pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2. REMARQUE: Optimisez la densité cellulaire par puits en fonction de la taille de la plaque et du type de souche cellulaire. Effectuez l’expérience en trois exemplaires dans une plaque de puits 96 noire traitée par TC avec un fond plat transparent.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dosage du calcium Fura-2 AM
<ol><li>Préparez le colorant en suivant les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Utilisez le colorant Fura-2 AM pour l’expérience.</li>
		<li>Préparer le tampon HEPES-Tyrode (HTB) contenant 25 mM de tampon HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mg/mL de glucose, 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 1,8 mM deCaCl2 fraîchement ajouté dans de l’eau stérilisée en autoclave.</li>
		<li>Ajouter 50 μL de DMSO dans un flacon de 50 μg de Fura-2 AM pour préparer une solution mère de 1 mM de colorant Fura-2 AM. Ajouter 1 μL de colorant Fura-2 AM de 1 mM par mL de milieu frais pour préparer le milieu de chargement du colorant ayant une concentration de colorant de 1 μM.</li>
		<li>Retirez la plaque de 96 puits de l’incubateur et jetez le milieu. Remplacez le milieu par un milieu de chargement de colorant frais. Ajouter 200 μL de milieu de chargement de colorant dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 30-40 min dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2. 
</li>
		<li>Après 40 min d’incubation, retirer le milieu. Lavez les cellules avec le tampon HTB. Ajouter 100 μL de tampon HTB pour la lecture de fluorescence. Prenez la plaque pour la lecture de fluorescence. REMARQUE: Optimiser la concentration de colorant dans le milieu de chargement du colorant. Les fuites de colorant et le photobleachage sont des préoccupations possibles associées au colorant. Ajouter caCl2 frais dans le tampon HTB pour éviter les précipitations.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Activation cellulaire et lecture fluorescente
REMARQUE: Le lecteur de plaques de fluorescence avec un système de pipetage automatisé permet le transfert automatique de composés d’une source de composés à la plaque d’essai sans retirer la plaque du lecteur de plaques.
<ol><li>Pendant l’incubage des cellules, réglez le lecteur de plaques.<ol>
<li>Réglez la température sur 37 °C.</li>
		<li>Dans Paramètres, sélectionnez Flex.</li>
		<li>Réglez le mode de lecture sur Fluorescence et Lecture inférieure.</li>
		<li>Dans Longueurs d’onde, définissez le nombre de longueurs d’onde sur 2. Réglez l’excitation sur 340 nm et 380 nm. Réglez l’émission sur 510 nm.</li>
		<li>Laissez la sensibilité à valeur par défaut.</li>
		<li>Dans Timing, définissez l’intervalle sur 3,9 s. Définissez le temps d’exécution sur 94 s pour obtenir 25 lectures.</li>
		<li>Ensuite, sélectionnez le type de plaque d’essai.</li>
		<li>Ensuite, sélectionnez les puits à lire.</li>
		<li>Dans Transfert de composé, réglez Transferts à 1 et Volume initial à 100 μL. Réglez la hauteur de la pipette à 100 μL, le volume à 50 μL et le point temporel à 36 s, pour ajouter le composé à la 10e lecture.</li>
		<li>Ensuite, sélectionnez le type de plaque Source composée. </li>
		<li>Laisser Triturate à Non utilisé.</li>
		<li>Sélectionnez les embouts dans la disposition des embouts de pipette.</li>
		<li>Pour les colonnes composées et tips,assurez-vous que les composés à transférer se trouvent dans la colonne 1 de la plaque composée. Définissez la colonne De pointe sur 1 et La Colonne composée sur 1.</li>
		<li>Laissez le calibrez automatique sur ON.</li>
		<li>Cliquez sur OK.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lorsque la température a atteint 37 °C, chargez les plaques dans le lecteur de plaques.<ol>
<li>Appuyez sur la chambre de lecture pour placer la plaque d’essai dans le lecteur de plaque defluorescence.</li>
		<li>Appuyez sur la source pour placer la plaque composée. Préparer la plaque composée en ajoutant 200 μL de peptides respectifs, d’ionomycine et de solutions d’acide éthylène glycol-bis(β-aminoéthylique)-N,N′,N′-tétraacétique (EGTA)-Triton X-100.</li>
		<li>Appuyez sur le porte-embouts pour placer la boîte à pourboires. Utilisez une pointe noire pour éviter l’autofluorescence de la pointe.</li>
		<li>Une fois les plaques chargées, passez en revue les paramètres du logiciel et appuyezsur Lire .</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse des données
<ol><li>Déterminer la concentration de calcium à partir du rapport de fluorescence par l’équation de Grynkiewicz - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62448/62448eq01.jpg"> où, Kd est la constante de dissociation de Fura-2 AM, R est le rapport d’émission après excitation à 340 nm et 380 nm (F340/F380) pour les peptides respectifs, Rmax est le rapport de fluorescence maximal observé par l’addition de 50 μL de 30 μM d’ionomycine, Rmin est la fluorescence minimale observée par l’addition de 50 μL de 100 mM EGTA/2,5% Triton X-100, et F380min et F380max sont l’intensité de fluorescence absolue de Fura-2 AM à l’état libre de calcium et lié, respectivement. REMARQUE: La machine distribue le liquide avec une certaine force. Ne fixez pas la hauteur de distribution du peptide trop près du bas de la plaque; il peut détacher les cellules. Utilisez des embouts de pipette noirs pour éviter l’autofluorescence. Lisez la fluorescence maximale et la fluorescence minimale pour chaque plaque pour chaque expérience.</li>
</ol>

<ol><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Mas-related+G+protein-coupled+receptor+X2+on+mast+cell-mediated+host+defense%2C+pseudoallergic+drug+reactions%2C+and+chronic+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).</li>
<li>Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+isolation%2C+and+maintenance+of+human+mast+cells+and+mast+cell+lines+derived+from+peripheral+blood+or+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood.</a> Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53568(2015).</li>
<li>Occhiuto, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+entry+via+STIM1+contributes+to+MRGPRX2+induced+mast+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions.</a> Frontiers in Immunology. 10, 3143(2020).</li>
<li>Baba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+for+the+calcium+sensor+STIM1+in+mast+cell+activation+and+anaphylactic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses.</a> Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).</li>
<li>Hoth, M., Penner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+calcium+stores+activates+a+calcium+current+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells.</a> Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).</li>
<li>Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+method+to+quantify+intraplatelet+calcium+dynamics+by+ratiometric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry.</a> PLoS One. 10 (4), 0122527(2015).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+measurement+of+cytosolic+free+Ca2%2B+in+monolayers+and+suspensions+of+various+types+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Generation+of+Ca2+%2B+Indicators+with+Greatly+Improved+Fluorescence+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+nanoscaffold+that+activates+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).</li>
<li>Lansu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+design+of+novel+probes+for+the+atypical+opioid+receptor+MRGPRX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).</li>
<li>Navinés-Ferrer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRGPRX2-mediated+mast+cell+response+to+drugs+used+in+perioperative+procedures+and+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11628(2018).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+store-operated+calcium+%28Ca+2%2B%29+entry+%28SOCE%29+in+HEK293+cells+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2.</a> Calcium Signalling. , 163-172 (2019).</li>
<li>Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+340%2F380+nm+light-emitting+diode+illuminator+for+Fura-2+AM+ratiometric+Ca2%2B+imaging+of+live+cells+with+better+than+5+nM+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

La signalisation du calcium est au cœur de la dégranulation des mastocytes et a été largement utilisée dans l’étude des interactions récepteur-ligand, l’identification des ligands et la découverte de médicaments14. MRGPRX2 est un récepteur de mastocytes récemment découvert qui s’est avéré jouer un rôle clé dans de nombreuses maladies inflammatoires comme les démangeaisons, l’asthme et la dermatite atopique, entre autres2. En outre, il a été démontré que plusieurs médicament...

Les mastocytes font partie intégrante du système immunitaire et jouent un rôle crucial dans les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les mastocytes sont principalement activés soit par la liaison d’un antigène au complexe de récepteurs immunoglobuline E (IgE) - FcεRI, soit par le récepteur X2 de la protéine G (MRGPRX2)récemment découvert. L’activation de MRGPRX2 a été liée à plusieurs maladies immunitaires et inflammatoires, et par conséquent, il est important de comprendre le mécanisme de liaison du récepteur à ses ligands2. Pour ce faire, une bibliothèque de petites molécules peptidiques a été développée et filtrée contre les récepteurs MRGPRX2 qui étaient surexprimés dans les cellules HEK. Dans l’étude, la bibliothèque de peptides a été construite en utilisant les techniques simples et polyvalentes de balayage de l’alanine et de troncature d’acides aminés. Le balayage de l’alanine consiste à remplacer des acides aminés spécifiques par un résidu d’alanine. L’alanine étant petite et neutre, dépouille le peptide des propriétés spécifiques conférées par le résidu remplacé et souligne consécutivement l’importance des propriétés physiochimiques respectives de l’acide aminé dans les interactions avec les récepteurs. Au contraire, dans la troncature d’acides aminés, les séquences peptidiques sont conçues de telle sorte qu’il manque un ou plusieurs résidus d’acides aminés du terminal N, du terminal C ou des deux. Cet ensemble de peptides a été utilisé pour identifier les séquences d’acides aminés cruciales pour la liaison MRGPRX2.
L’expérience avec les lignées de mastocytes humains (LAD-2) a montré que ces cellules sont difficiles à mettre en culture et à maintenir in vitro: un temps de doublement de deux semaines, des suppléments de milieu coûteux, et une attention directe requise lors du passage3. Ces attributs rendent les cellules impropres au dépistage à grande échelle de ligands potentiels. Ici, des cellules HEK transfectées de manière stable exprimant le récepteur MRGPRX2 (HEK-X2) ont été utilisées pour filtrer la bibliothèque peptidique1. Les cellules HEK-293 sont largement utilisées et étudiées pour l’expression hétérologue des récepteurs de surface en raison de leur efficacité de transfection élevée, de leur taux de doublement plus rapide et de la nécessité de mettre en culture des suppléments de milieu non coûteux en laboratoire4. Le protocole de transfecter la lignée cellulaire HEK-293 a été démontré et est bien établi5. Les cellules HEK-293 exprimant de manière stable le récepteur MRGPRX2 (passage 13-19) ont été activées avec les peptides générés par N-troncature, C-troncature, N+C-troncature et balayage de l’alanine1. Des cellules HEK de type sauvage (HEK-WT) (passage 16-21) ont été utilisées comme témoins. La libération intracellulaire de calcium lors de l’activation a été surveillée pour étudier l’activation basée sur MRGPRX2.
L’activation cellulaire par MRGPRX2 est suivie d’une mobilisation cytosolique du calcium. Cette libération intracellulaire régulée de calcium dans les mastocytes est régulée par l’entrée de calcium opérée par le magasin (SOCE), coordonnée par la molécule d’interaction stromale 1 (STIM1); et est au cœur de la cascade de réponse immunitaire6,7. Diverses méthodes ont été utilisées pour détecter la concentration intracellulaire de calcium, y compris les patch-clamps et les colorants fluorescents8. De toutes les techniques disponibles, les colorants calciques fluorométriques en conjugaison avec diverses techniques de détection sont largement utilisés9. Deux types de colorants fluorométriques qui ont gagné en intérêt sont, à savoir, les colorants à longueur d’onde unique comme Fluo-4 et les colorants ratiométriques à double longueur d’onde comme Indo-1 et Fura-2. L’avantage que les colorants ratiométriques à double longueur d’onde apportent par rapport aux colorants à longueur d’onde unique est que les colorants ratiométriques corrigent les erreurs expérimentales telles que le chargement des colorants, le photo-blanchiment et la mise au point10,11.
L’ester acétoxyméthylé de Fura-2 (Fura-2 AM) est un colorant fluorescent vert imprégné de cellules dont l’excitation se déplace vers une longueur d’onde inférieure lors de la liaison au calcium. Expérimentalement, Fura-2 est excité à 340 et 380 nm, tandis que l’émission est enregistrée à 510 nm. Lors de la liaison au calcium, l’intensité fluorescente à 340 nm augmente tandis que celle de 380 nm diminue, comme le montre la figure 1. Les données sont représentées sous la forme d’un rapport entre l’intensité de fluorescence après excitation à 340 nm (F340) et celle de l’intensité après excitation à 380 nm (F380), c’est-à-dire F340/F380. Le rapport F340/F380 est proportionnel au calcium intracellulaire, dont la valeur peut être calculée par l’équation de Grynkiewicz12. Étant donné que le signal de fluorescence est obtenu à partir de l’excitation du colorant à deux longueurs d’onde (340 nm et 380 nm), le rapport des signaux de fluorescence corrige les facteurs expérimentaux tels que la charge en colorant, les fuites de colorant, le photomélancage et les densités cellulaires.

<table><tbody><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793939</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 puits</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque en polystyrène noir</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fischer</td><td>11995065</td><td>High Glucose</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fischer</td><td>D12345</td><td>Stérile, de qualité biologique</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo Fischer</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Flexstation 3</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>FV06060</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Thermo Fischer</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampon</td><td>Thermo Fischer</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine</td><td>Thermo Fischer</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>RS Syntehsis</td><td>Custom</td><td>&ge ; 95 % pur ; N terminale - acétyle C terminale - amide</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>DOW Chemical</td><td>166704</td><td></td></tr></tbody></table>

criblage des peptides qui activent mrgprx2 à l’aide de cellules hek modifiées

Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells

L’identification de ligands spécifiques aux récepteurs cellulaires d’importance thérapeutique est cruciale pour de nombreuses applications, y compris la conception et le développement de nouveaux traitements. Le récepteur X2 de la protéine G lié au Mas (MRGPRX2) est un récepteur important qui régule l’activation des mastocytes et, par conséquent, dirige la réponse immunitaire générale. De nombreux ligands pour MRGPRX2 ont été identifiés et comprennent des peptides endogènes comme les PAMPs, les défensines, le LL-37 et d’autres fragments de protéines (c.-à-d. l’albumine dégradée). Une identification plus poussée des ligands spécifiques à MRGPRX2 nécessite le dépistage d’un grand nombre de peptides (c.-à-d. bibliothèque de peptides); cependant, les mastocytes sont difficiles et coûteux à entretenir in vitro et, par conséquent, pas économiques à utiliser pour le criblage d’un grand nombre de molécules. Le présent article démontre une méthode pour concevoir, développer et filtrer une bibliothèque de petites molécules peptidiques utilisant des cellules HEK exprimant MRGPRX2. Cette lignée cellulaire est relativement facile et peu coûteuse à entretenir et peut être utilisée pour l’analyse in vitro à haut débit. Un colorant fluorescent Fura-2 sensible au calcium pour marquer le flux de calcium intracellulaire lors de l’activation a été utilisé pour surveiller l’activation. Le rapport entre l’intensité de fluorescence de Fura-2 à 510 nm et les longueurs d’onde d’excitation de 340 et 380 nm a été utilisé pour calculer la concentration en calcium. La bibliothèque peptidique utilisée pour vérifier ce système était basée sur le sécréagogue endogène de la proadrénomédiline N-terminale 12 (PAMP-12), connu pour se lier à MRGPRX2 avec une spécificité et une affinité élevées. Les peptides suivants ont été générés par troncature d’acides aminés et techniques de balayage de l’alanine appliquées à PAMP-12. La méthode décrite ici est simple et peu coûteuse mais robuste pour le criblage d’une grande bibliothèque de composés afin d’identifier les domaines de liaison et d’autres paramètres importants qui jouent un rôle important dans l’activation des récepteurs.

Le tableau 1 contient les séquences peptidiques générées par troncature d’acides aminés terminaux et balayage de l’alanine. Comme le montre le tableau 1,la séquence peptidique RKKWNKWALSR manque de phénylalanine N-terminale (F) par rapport à son parent PAMP-12 et est donc un peptide représentatif dans la bibliothèque N-tronquée. De même, dans FRKKWNKWALS, la sérine C-terminalE PAMP-12 a été éliminée, représentant une bibliothèque peptidique tronquée C dérivée de PAMP-12. Dans la biblioth...

Les techniques de génération d’une bibliothèque de peptides courts pouvant activer les mastocytes via le récepteur MRGPRX2 sont décrites. Les techniques associées sont faciles, peu coûteuses et peuvent être étendues à d’autres récepteurs cellulaires.

Criblage des peptides qui activent MRGPRX2 à l’aide de cellules HEK modifiées

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new ...

Aujourd’hui, nous allons démontrer une méthode pour filtrer une bibliothèque de peptides, contre un récepteur maître récemment découvert, qui est le récepteur X2 de la protéine G lié à Mas, également connu sous le nom de récepteur MRGPRX2. Les mastocytes font partie intégrante du système immunitaire et jouent un rôle crucial dans les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les mastocytes sont activés soit par le récepteur Fc epsilon R1 lié à l’antigène, soit par le récepteur X2 récemment découvert.L’activation du récepteur X2 lié à la surface a été liée à plusieurs maladies immunologiques et enflammées et, par conséquent, il est important de comprendre le mécanisme de liaison de ce récepteur à ses ligands. Pour ce faire, nous avons développé une bibliothèque de petites molécules peptidiques, et les avons filtrées contre les récepteurs X2 sur-exprimés sur hexis. Dans l’étude, une bibliothèque de peptides a été construite en utilisant des techniques simples et polyvalentes de balayage de l’alanine et des troncations d’acides aminés.Heck293 dit, l’expression des récepteurs X2 lorsqu’ils sont activés avec les peptides et l’hexis de type large ont été utilisés comme contrôle. Dans la libération de troncature lors de l’activation a été surveillé pour étudier l’activation basée sur X2. Expérimentalement, fura-2 AM Calcium Sensitive Dye est excité à 340 et 380 nanomètres, tandis que l’émission est enregistrée à 510 nanomètres.Lors de la liaison au calcium, l’intensité de fluorescence à 340 augmente, tandis que celle de 380 nanomètres diminue. Le colorant est ensuite déposé au rapport de l’intensité de fluorescence à 340, à celle de 380 nanomètres. Le 340 d’un rapport 380, est proportionnel au calcium intracellulaire, la valeur de celui-ci, peut être calculée, par l’équation de Grynkiewicz.Le rapport de tabulation de deux intensités de fluorescence, l’effet de facteurs expérimentaux tels que la dilution, le photobleaching, les fuites de colorant et les densités d’odeur sont détectés. Alors, sans plus attendre, commençons l’expérience. Identifier les ligands du récepteur MRGPR X2 des mastocytes, générateur N-tronqué, C-tronqué et N+C-tronqué de la bibliothèque peptidique, en tronquant les acides aminés N-terminaux, C-terminal et N+C-terminal de la mauvaise proctivité pam-12.Utilisez la synthèse peptidique en phase solide pour synthétiser les peptides. Modifiez la borne terminale en un groupe de marée défini et la borne C en groupe amide. Générer et les alanines peuvent bibliothèque de peptides, en remplaçant les acides aminés respectifs de pam-12 par Alanine, un à la fois.Modifiez la borne terminale en groupe setide et la borne C en groupe amide. Préparer le milieu de culture en complétant le DMEM à haute teneur en glucose, avec 10% de sérum bovin fœtal, deux millimolaires L-Glutamine, cent unités par ml de pénicilline et cent microgrammes par ml de streptomycine. Outre les cellules de la culture tee sue, 375 flacons de culture à 37 degrés Celsius, 5% co2, jusqu’à ce qu’ils soient confluents à 75 à 80%.Une fois confluent à 75%, lavez les cellules et ajoutez deux à trois ml de Proof-C, pour détacher les cellules. Une fois que les cellules se sont détachées, collectez les cellules dans Proof-C. Ajouter six à neuf ml de milieu frais.Centrifuger les cellules à 1620g pendant trois à cinq minutes. Après centrifugation, jeter le surnageant pour recueillir la pastille. Resuspendez les cellules dans un milieu de culture frais.Diluer les cellules, selon la concentration souhaitée. À 200 microlitres de la suspension cellulaire avec une concentration de 200 000 cellules, versez l’ambon dans chaque puits pour rechercher 40 000 cellules par puits. Gardez les cellules pendant 24 heures dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5% CO2.Utilisez le colorant Fura-2 AM pour l’expérience. Ajouter 50 microlitres de DMSO dans 50 microgrammes de Fura-2 AM, pour préparer une solution millimolaire de colorant Fura-2 AM. Ajouter un microlitre d’un colorant millimolaire Fura-2 AM par ml de milieu frais pour préparer le milieu diluant d’une concentration de colorant micromolaire.Retirez la plaque de 96 puits de l’incubateur et jetez le milieu. Remplacer le milieu par un milieu diluant frais. Ajouter 200 microlitres de milieu diluant dans chaque puits.Incuber les cellules pendant 30 à 40 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% CO2. Pendant l’incubage des cellules, réglez le lecteur de plaques. Réglez la température à 37 degrés Celsius.Dans les paramètres, sélectionnez Flex. Réglez le mode de lecture sur Fluorescence et Lecture inférieure. Dans Longueurs d’onde, définissez le nombre de longueurs d’onde sur deux.Réglez l’excitation sur 340 nanomètres et 380 nanomètres. Réglez l’émission sur 510 nanomètres. Laissez la sensibilité sur Par défaut.Dans Timing, définissez l’intervalle sur 3,9 secondes. Définissez la durée d’exécution sur 94 secondes pour obtenir 25 nombres de lectures. Ensuite, sélectionnez le type de plaque d’essai.Ensuite, sélectionnez les puits à lire. Dans Transfert composé, définissez les transferts sur un et le volume initial sur cent microlitres. Réglez la hauteur de la pipette sur cent microlitres, le volume sur 50 microlitres et le point temporel sur 36 secondes pour ajouter le composé et tenir la lecture.Ensuite, sélectionnez le type de plaque Source composée. Laissez Triturate ne pas utiliser. Sélectionnez la disposition Conseils et embouts de pipette.Pour les colonnes composées et tip, le composé sera transféré dans la première colonne de la plaque composée. Définissez la colonne d’embout sur une et la colonne composée sur une. Laissez Le écalibrer automatique sur Activé.Cliquez sur OK. Après 40 minutes d’incubation, retirer le milieu.Lavez les cellules avec le tampon XDB. Ajoutez cent microlitres de tampon XDB pour la lecture de fluorescence. Prenez la plaque pour la lecture de fluorescence.Lorsque le pritchett a atteint 37 degrés Celsius, appuyez sur la chambre de lecture pour placer la plaque d’essai dans le lecteur de plaque de fluorescence. Appuyez sur la source pour placer la plaque composée. Préparez la plaque composée en ajoutant 200 microlitres de peptides respectés ionomysine et EGTA pour transformer les solutions X.Appuyez sur le pratt de pointe pour mettre la boîte à pourboires. Utilisez une pointe noire pour éviter l’autofluorescence de la pointe. Une fois les plaques conservées, et si vous utilisez les paramètres du logiciel et appuyez sur Lire.Déterminer la concentration de calcium à partir du rapport de fluorescence par l’équation de Grynkiewicz. Les données de fluorescence du bon peptide pam sont montrées. Comme on peut le voir, après l’ajout de peptides à 36 secondes, la fluorescence à 340 nanomètres qui est tiède augmente de celle de 380 nanomètres enregistre des diminutions.Les données sont représentées comme le rapport de 340, à celui du signal 380. Ils montrent que les signaux augmentent après l’ajout de peptides. Cette figure est la donnée représentative d’un peptide activateur.La figure A montre les signaux de fluorescence d’un peptide activateur. Les données représentatives correspondent au peptide cram12 ajouté après avoir créé une base de référence pour les cycles d’appel d’offres, comme le montre l’ado. La figure B montre le rapport entre l’émission de fluorescence après excitation à 340 nanomètres et celle de l’émission de fluorescence après excitation à 380 nanomètres.Cette figure est la donnée représentative pour le blanc. La figure A montre les signaux de fluorescence pour l’ébauche. HTB a été ajouté après dilution d’une ligne de base pour 10 cycles d’alimentation, comme le montre l’ado.La figure B montre la ration de l’émission de fluorescence après excitation à 340 nanomètres à celle de l’émission de floraison après excitation à 380 nanomètres. Cette figure est la donnée représentative des étalons d’étalonnage des colorants. La figure A montre que l’ionomycine a été ajoutée aux 10e lectures, comme le montre l’ado pour obtenir une fluorescence maximale dans l’état lié au cashem.EGPA Triton X cent a été ajouté après 20 lectures comme le montre l’ado qui obtient un signal minimum. La figure B montre le rapport entre l’émission de fluorescence après excitation à 340 nanomètres et celle de l’émission de fluorescence après excitation à 380 nanomètres. Ces valeurs sont ensuite mises dans l’équation de Grynkiewicz pour obtenir le cache intracellulaire de concentration.Cette figure montre la caractérisation d’un peptide représentatif pour confirmer la séquence et la pureté. La figure A montre que la masse verticale de la séquence peptidique représentative WNK WAL était de 857,90 éclaircies. Ce qui est montré par le rapport N sur Zed en spectroscopie de masse.La figure B montre une pureté peptidique de 99%, confirmée par hpLC. Ce peptide appartient à la bibliothèque de peptides tronqués N+ C. En conclusion, la méthode décrite ici est une méthode facile et polyvalente qui peut être efficace et brillante pour le dernier criblage à base de calcium.Cependant, plusieurs facteurs déterminent la qualité des données et, par conséquent, la composition doit être optimisée pour un système d’instrument cellulaire donné. Merci.

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