Multi-cible approche de traitement parallèle pour Gene à la structure Détermination de la polymérase de l'influenza PB2 Subunit

L’objectif général de l’expérience suivante est d’utiliser une approche multi-cibles pour la détermination structurée d’une protéine cible par cristallographie aux rayons X, en commençant par un seul gène ou une seule séquence génétique dans le cas présenté ici. La protéine cible est la sous-unité polymérase PB deux de la grippe A, un composant clé de la réplication virale. L’approche multi-cibles est réalisée en concevant et en clonant d’abord une série de constructions génétiques en parallèle sur la base de la séquence cible unique et d’autres informations connues sur la protéine.

La deuxième étape consiste à tester les niveaux d’expression de chaque construction et à sélectionner les meilleurs pour l’expression de protéines à grande échelle en culture cellulaire. L’étape suivante consiste à ouvrir des cellules pour éliminer les protéines cibles du matériel d’expression et à affiner chacune d’entre elles jusqu’à une très haute pureté. Une série d’essais de cristallisation est ensuite mise en place avec chaque protéine afin d’obtenir une forme cristalline adaptée aux études aux rayons X.

Les données de diffraction des rayons X à haute résolution sont ensuite collectées sur un ou plusieurs cristaux et utilisées pour résoudre et affiner une carte de densité électronique décrivant la structure de chaque protéine cible. Ces résultats permettent le rendu d’une structure tridimensionnelle de la protéine cible basée sur la carte de densité électronique. Le traitement multi-cibles augmente considérablement les chances de succès de la détermination structurée en fournissant des alternatives viables à chaque obstacle potentiel sur la voie.

Travailler plusieurs cibles en parallèle est également très efficace, ce qui réduit le temps et le coût par protéine à chaque étape. Le potentiel d’augmentation de la vitesse à laquelle la détermination structurée est effectuée pour les cibles médicamentables offrira davantage d’opportunités de développement thérapeutique par an. Bien que cette méthode puisse fournir des informations précieuses en biologie structurale, les protéines de haute qualité obtenues par ces méthodes peuvent soutenir toute recherche basée sur les protéines.

Chaque phase du processus a sa propre science et nécessite sa propre expertise, mais l’investissement dans les personnes, l’instrumentation et le savoir-faire peut porter ses fruits une fois que toutes les pièces sont assemblées. Une fois qu’un gène cible et un produit génique sont sélectionnés pour l’étude, la première étape nécessite la conception de plusieurs variantes ou constructions génétiques. Un logiciel de composition de gènes est utilisé pour concevoir ces constructions au niveau de la protéine ainsi que le code associé sur des séquences de gènes synthétiques modifiées.

À l’aide du module de visualisation d’alignement et du module de conception de construction, comparez les alignements de séquences de protéines et définissez les constructions de protéines, insérez la PCR et la PCR vectorielle, amorces terminales ou esperluettes. Ensuite, utilisez l’algorithme protéine-ADN du compositeur de gènes pour traduire chaque séquence d’acide aminé en un code sur une séquence d’acide nucléique modifiée. Utilisez le code approprié sur la table d’utilisation pour optimiser la séquence d’expression dans une ligne de cellule spécifique.

Dans ce cas, la bactérie E coli. Une fois que la séquence du gène cible est prête, clonez virtuellement le gène et insérez-le dans un plasmide de vecteur approprié pour l’expression bactérienne. Dans ce cas, il s’agit d’un vecteur PET 28 modifié.

Ce vecteur contient certains composants nécessaires à l’expression et à la purification des protéines. Le gène cible est modifié pour incorporer une séquence d’étiquette d’histamine à l’extrémité N ou C de la protéine et une séquence de clivage pour permettre l’élimination de l’étiquette pendant la purification. Le vecteur possède également un gène de résistance aux antibiotiques pour les tests d’expression et la fermentation.

Chaque séquence génétique de protéine cible est ensuite créée par des méthodes standard de synthèse de gènes en préparation du clonage en pipe Le clonage par polymérase à extension primaire incomplète, ou le clonage en pipe est une stratégie de clonage basée sur la PCR où le gène cible est amplifié avec des amorces complémentaires au vecteur visé. Cette méthode exploite la nature incomplète de la PCR à un stade avancé, ce qui laisse les produits de PCR avec des terminaisons monocaténaires variables. Je prépare l’insert PCR ou IPCR en ajoutant cinq microlitres d’amorces avant et arrière à chaque réaction.

Dans une plaque de 96 puits selon une carte de plaque, ajoutez deux microlitres de chaque gène synthétique de pleine longueur à son puits approprié selon la carte de plaque. Après avoir ajouté 25 microlitres de mélange maître PFU à chacun, bien cyclez les réactions 25 fois en utilisant les conditions PCR suivantes. Dénature à 95 degrés Celsius pendant 30 secondes.

Anil à 50 degrés Celsius pendant 45 secondes et étendre à 68 degrés Celsius pendant trois minutes. L’amplification des fragments est confirmée par l’analyse sur gel AGROS des produits IPCR. Les produits IPCR qui réussissent sont représentés par des bandes robustes.

Les résultats moins souhaitables sont souvent considérés comme des bandes faibles ou des bandes de frottis dans une réaction distincte. L’amplification des fragments de VPCR est confirmée par l’analyse sur gel AROS des produits VPCR. Une fois que les produits IPCR et VPCR sont amplifiés, ils sont ajoutés à une plaque de fusion et placés dans un thermocycleur pour la réaction de fusion.

Les constructions clonées avec succès sont ensuite transformées en cellules E coli chimiquement compétentes et stockées dans des tiges de glycérol pour commencer la série de tests d’expression. Une petite quantité de chaque échantillon provenant d’un stock de glycérol de construction clonée sur une plaque de gélose séparée. La plaque est faite avec un bouillon nutritif bactérien et le marqueur antibiotique Kanamycin codé dans le vecteur incube pendant la nuit à 37 degrés Celsius le lendemain.

Commencez une pré-culture pour chaque échantillon en prélevant une seule colonie dans la plaque de gélose fraîchement cultivée. Utilisez cette colonie pour inoculer 1,2 millilitre de bouillon de tuberculose complété par de la mycine et du glucose pour un traitement parallèle. Chaque pré-culture est cultivée dans un bloc de fond rond de 96 puits.

Cultivez pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec des secousses à 220 rotations par minute. Après la croissance pendant la nuit. Démarrez des cultures d’induction à petite échelle pour chaque échantillon en utilisant 40 microlitres de pré-culture pour inoculer.

1,2 millilitres de bouillon de tuberculose. Complété par 50 milligrammes par millilitre de mycine de canette et du système de nuit express novagen. Premièrement, cultivez les cultures d’induction à 20 degrés Celsius pendant 48 heures, en les secouant à 220 tr/min et en les faisant centrifuger à 4 000 unités GForce pendant 15 minutes.

Videz le surnageant et stockez les granulés à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure avant de poursuivre le traitement après la purification. Analysez la protéine avec et sans réaction de clivage par électrophorèse capillaire à l’aide d’un système CHIP 90 de laboratoire à coulisse selon le protocole du fabricant. Dans le cas de la grippe, une sous-unité protéique PB deux, 14 des 34 constructions, a conduit à la protéine cible soluble et est entrée dans l’étape suivante : la fermentation à grande échelle.

Pour commencer une fermentation à grande échelle, inoculez 100 millilitres de bouillon de culture cellulaire bactérienne contenant 50 milligrammes par millilitre. La mycine d’un stock de glycérol peut-elle croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius ? En secouant à 220 tr/min le lendemain, élargissez la pré-culture en utilisant 10 millilitres pour inoculer.

Un litre de bouillon contenant un milieu à induction automatique et 50 milligrammes par millilitre peut contenir de la mycine dans une fiole à chicanes de deux litres. Secouez les cultures expansées à 37 degrés Celsius environ toutes les 30 minutes. Vérifiez la densité optique de la culture en mesurant l’absorbance UV à une longueur d’onde de 600 nanomètres.

Lorsqu’une densité optique de 0,6 est atteinte, changez la température de l’incubateur à agitation à 20 degrés Celsius après le temps de croissance souhaité. Retirez un quadrilatère Ali représentatif de 10 millilitres de chaque construction pour le test d’expression. Récoltez les cellules par centrifugation à 5 000 unités GForce pendant 15 minutes.

Videz le surnageant et congelez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer cette procédure, décongelez et mettez en suspension la pâte cellulaire dans le tampon de lyse à un rapport de volume principal de un à cinq. Remuez vigoureusement pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

À l’aide d’une spatule propre, détacher les morceaux du côté du bécher. Lyce mécaniquement les cellules sur glace avec un sonicat maçonnique. Clarification du lysat brut par centrifugation à 18 000 GForce pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Prélever le surnageant et conserver une petite aliquote pour analyse avant de procéder à une purification à grande échelle. Confirmez l’expression protéique à grande échelle de chaque culture via l’analyse de gel de la page SDS. Ce résultat représentatif de la page SDS montre une expression protéique robuste, une solubilité d’environ 50 % et un clivage d’environ 50 %.

Dans ce cas, l’étiquette d’histidine a été retirée avec une étiquette de solubilité protéique ajoutée, qui a été conçue dans la construction originale. La résine de nickel est utilisée pour séparer la protéine cible avec l’étiquette histamine unique de tout autre matériel cellulaire, y compris les protéines bactériennes natives. Une colonne de nickel est préparée par lavage avec quatre volumes de colonne d’eau UE pour éliminer le tampon de stockage, suivi d’un volume de colonne de tampon B et de cinq volumes de colonne de tampon

La parallélisation de l’équilibrage A pour E se fait avec le fabricant de protéines, qui est capable d’exécuter plusieurs colonnes à la fois. Chargez chaque lysat clarifié contenant des protéines solubilisées avec un marqueur d’histamine dans une colonne séparée à raison de deux millilitres par minute, suivi de plusieurs lavages de volume de colonne avec le tampon A, collectez le tampon d’écoulement et enregistrez-le pour l’analyse. Éluer la protéine liée en une série de gradients d’étapes avec les tampons A et B à 95 à cinq, 60 à 40, et enfin 100 % tampon B. Les composants du tampon B entrent en compétition avec l’histamine pour la résine de nickel et éliminent ainsi la protéine de la colonne dans un rapport donné.

Collectez chaque fraction d’élution séparément. Un chromatogramme représentatif résultant d’un passage sur une colonne de nickel est présenté ici. Analysez les fractions éludées du nickel, le lysat brut, le lysat clarifié et le flux de nickel par page SDS et comparez-les avec l’absorbance UV à 280 nanomètres collectée lors de la purification de la colonne.

Cette étape détermine si la purification a réussi. Sélectionner et regrouper les fractions contenant la protéine cible à reporter pour un traitement ultérieur. Calculez la quantité totale de protéines à ce stade avec le coefficient d’extinction théorique de la protéine, en mesurant l’absorbance UV à 280 nanomètres et en tenant compte du volume total des fractions regroupées.

Conservez un petit échantillon pour analyse. Le gène de la protéine cible a été codé avec une séquence spécifique, qui est reconnue par ULP one comme un site de clivage, donc l’ajout de ULP un entraîne un clivage entre l’étiquette histidine et la protéine d’intérêt. Pour commencer cette procédure, ajoutez un microlitre d’ubiquitine comme la protéase, un pour cinq milligrammes de protéines présentes dans les fractions mélangées.

À ce stade, la protéine clivée est transférée du tampon B au tampon A pour un traitement ultérieur à l’aide d’une tubulure de dialyse, dialysée la protéine contre deux litres de tampon, A pendant quatre heures à quatre degrés Celsius avec agitation. Utilisez un seuil de poids moléculaire de 10 kilodaltons pour PB deux après la dialyse. Exécutez un autre gel de la page SDS de la protéine cible avec et sans ULP présent.

Cela permettra de déterminer si le clivage d’un CLP a réussi et de sélectionner les meilleures fractions à reporter pour un traitement ultérieur. Montré ici les résultats de notre page SDS représentative pour trois constructions de la polymérase pb. Deux marqueurs de poids moléculaire sous-unitaires se trouvent dans le couloir un.

Les voies deux, six et 10 sont des protéines regroupées à partir de colonnes de nickel un. Les voies trois, sept et 11 contiennent l’écoulement de la protéine clivée dans le tampon A à partir du nickel deux et des voies quatre, huit et 12. Montrer l’élimination de l’étiquette d’histamine dans le tampon B à partir du nickel deux.

Après l’élimination de l’histamine, les fractions regroupées du nickel deux sont concentrées. Dans ce cas, l’acere S 110 sur une colonne de 30 GL est utilisé et équilibré avec un tampon SEC de 200 millilitres à un débit de 0,5 millilitre par minute à l’aide d’une seringue de cinq millilitres, chargez l’échantillon dans une boucle d’échantillonnage de 10 millilitres et commencez l’exécution de la colonne SEC. Surveiller le chromatogramme absorbant les UV à 280 nanomètres tout en collectant de petites fractions volumiques.

Exécutez toutes les fractions SEC pertinentes via la page SDS. L’approche standard des essais de cristallisation des protéines est menée par la méthode de la goutte assise impliquant la diffusion de vapeur. Il n’est pas rare de mettre en place deux ou plusieurs cribles matriciels clairsemés dès le départ pour chaque protéine cible.

Pour démarrer ce processus, préremplissez chaque réservoir d’une plaque de cristallisation junior compacte de 96 puits avec 80 microlitres dans chaque condition dans l’écran de cristallisation sélectionné, distribuez 0,4 microlitre de protéines dans un tampon SEC dans chacun des 96 puits. Ajoutez ensuite 0,4 microlitre de tamis de cristallisation, en assurant un mélange complet de la goutte dans chacun. Couvrez bien l’ensemble du banal avec du ruban adhésif de plafond transparent comme du cristal, assurant une étanchéité complète sur chaque puits, stockez la plaque à 16 degrés Celsius dans un endroit non perturbé et exempt de vibrations environnementales.

Vérifiez périodiquement la cristallisation des protéines au cours des prochaines semaines sous un microscope à dissection. Si les cristaux de protéines n’apparaissent pas, placez de nouvelles plaques dans des conditions différentes et variez la concentration en protéines dans la goutte finale pour augmenter les chances de succès avant la récolte. Refroidissez une rondelle de style A LS dans un faiseur rempli d’azote liquide et couvrez-le avec un couvercle pour commencer la récolte.

Coupez le ruban adhésif transparent recouvrant le puits avec le cristal de protéine cible à un vide proche. Bien ajouter 1,6 microlitres de l’état de cristallisation correspondant et le combiner avec 0,4 microlitre d’éthylène glycol. Une solution de 20 % d’éthylène glycol à l’état cristallisant protège le cristal de protéine.

Pendant la cryocongélation, analysez le cristal au microscope et sélectionnez une boucle cryogénique appropriée pour la récolte, en adaptant le diamètre intérieur de la boucle à la largeur maximale du cristal. Fixez la boucle cryogénique à une baguette à cristal magnétique et enroulez le cristal directement à partir de la solution du puits. Trempez immédiatement la boucle cryogénique avec le cristal récolté dans un cryoprotecteur, puis immergez-la dans une rondelle de style LS.

Pour clignoter, figez la répétition du cristal pour un nombre souhaité de cristaux. Une fois la récolte terminée, utilisez une baguette de rondelle pour placer un couvercle magnétique sur la rondelle contenant des cristaux congelés avec les langues pliées. Retournez la rondelle pour l’étape suivante.

Vissez un poussoir de rondelle sur la rondelle, puis transférez la rondelle à l’acteur KU et utilisez-la pour défoncer le couvercle. Les cristaux dans la rondelle restent congelés dans un bain d’azote liquide jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour les études de diffraction des rayons X à l’aide du logiciel d’acquisition d’images J Director. Configurez les paramètres suivants pour la fente du faisceau de blindage de cristal à 0,5 degré, la distance du détecteur de 50 millimètres, le pas d’image à 70 degrés et la durée d’exposition de 30 secondes.

Voici un exemple de capture d’écran du logiciel d’acquisition d’images pendant qu’un cristal est en cours de blindage, le panneau central montre la diffraction des rayons X observée à partir d’un cristal représentatif collecter suffisamment d’images à haute résolution pour un ensemble complet de données nécessaires à la détermination de la structure tridimensionnelle. Les stratégies de clonage et de purification des protéines démontrées dans cette vidéo ont permis d’obtenir 14 PB purifiés, deux échantillons dont neuf ont donné des cristaux adaptés aux études de diffraction. L’ensemble de données internes de diffraction des rayons X a été collecté sur cinq des neuf constructions avec le rayonnement alpha QK à l’aide d’un générateur de rayons X à anode rotative FRE super lumineux rigaku, équipé d’une optique ossec variax hf, HF et d’un détecteur CCD Saturn 944 plus.

Une image de diffraction des rayons X de la sous-unité de la polymérase PB deux est présentée ici. Chaque ensemble de données a été traité et un total de quatre structures de la sous-unité PB deux ont été déterminées. Chaque structure a été examinée par des pairs et téléchargée dans la banque de données sur les protéines pour être accessible au public.

Cette figure montre des diagrammes en ruban des molécules de l’unité asymétrique cristallographique. Sur les quatre structures à deux du PB, les structures secondaires sont colorées en arc-en-ciel avec les codes PDB correspondants. Ce tableau présente l’analyse des résultats pour les cibles de la grippe PB deux selon les méthodes décrites dans cet article vidéo.

Le pipeline de traitement parallèle multi-cibles pour la détermination du gène à la structure est illustré en cinq étapes, clonage, solubilité, purification, cristallisation et détermination de la structure. Les résultats de notre pipeline de biologie structurale fournissent non seulement la base de la recherche basée sur la structure, mais alimentent également des études supplémentaires telles que des tests fonctionnels pour confirmer la fonction des protéines ou le criblage biophysique de nouveaux composés dans un MAR ou un SPR afin d’identifier de nouveaux points de départ pour le développement de médicaments. Cette technique et les outils inventés en même temps ont permis aux biologistes structurels de détecter de nombreux types d’investigations fondées sur la découverte, y compris la conception de médicaments basée sur la structure, qui a eu un impact énorme sur la santé humaine et la maladie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont le traitement parallèle multi-cibles peut augmenter considérablement le succès de la détermination structurée. N’oubliez pas que travailler dans un laboratoire de biologie structurale peut être extrêmement dangereux et que les précautions appropriées, telles que l’utilisation d’EPI, doivent toujours être prises lors des activités de laboratoire.