Multi-cible approche de traitement parallèle pour Gene à la structure Détermination de la polymérase de l'influenza PB2 Subunit

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser une approche à cibles multiples pour la détermination structurale d'une protéine cible par cristallographie aux rayons X, en partant uniquement d'un seul gène ou d'une seule séquence génétique dans le cas présenté ici. La protéine cible est la sous-unité PB2 de la polymérase de la grippe A, un composant clé de la réplication virale. L'approche à cibles multiples est réalisée en concevant et en clonant d'abord en parallèle une série de constructions génétiques basées sur la séquence cible unique et d'autres informations connues sur la protéine.

La deuxième étape consiste à tester les niveaux d'expression de chaque construction et à sélectionner les meilleures pour une expression protéique à grande échelle en culture cellulaire. L'étape suivante nécessite l'ouverture des cellules afin de récupérer les protéines cibles à partir du matériel d'expression, puis de les purifier chacune à un très haut degré de pureté. Une série d'essais de cristallisation est ensuite mise en place pour chaque protéine afin d'obtenir une forme cristalline adaptée aux études par rayons X.

Des données de diffraction des rayons X à haute résolution sont ensuite recueillies sur un ou plusieurs cristaux et utilisées pour déterminer et affiner une carte de densité électronique décrivant la structure de chaque protéine cible. Ces résultats permettent de reconstruire une structure tridimensionnelle de la protéine cible à partir de la carte de densité électronique. Le traitement multi-cibles augmente fortement la probabilité de succès dans la détermination structurale en offrant des alternatives viables à chaque obstacle potentiel rencontré au cours du processus.

Travailler sur plusieurs cibles en parallèle est également très efficace, réduisant le temps et le coût par protéine à chaque étape. La possibilité d'augmenter le rythme auquel la détermination de structures est réalisée pour des cibles « fiables » permettra davantage d'opportunités de développement thérapeutique par an. Bien que cette méthode puisse fournir des informations précieuses en biologie structurale, la protéine de haute qualité obtenue grâce à ces méthodes peut soutenir toute étude basée sur les protéines.

Chaque phase du processus repose sur ses propres bases scientifiques et nécessite une expertise spécifique, mais l'investissement en personnel, en instrumentation et en savoir-faire peut porter de beaux fruits une fois que tous les éléments sont assemblés. Une fois qu'un gène cible et son produit génique ont été sélectionnés pour l'étude, la première étape consiste à concevoir plusieurs variants génétiques ou constructions. Un logiciel de conception génétique est utilisé pour concevoir ces constructions au niveau protéique, ainsi que le code associé sur des séquences génétiques synthétiques modifiées.

À l'aide du module de visualisation des alignements et du module de conception de constructions, comparez les alignements de séquences protéiques et définissez les amorces terminales de PCR pour l'insertion de constructions protéiques et du vecteur, ou des ampers. Ensuite, utilisez l'algorithme de traduction inverse de protéine en ADN du logiciel Gene Composer pour convertir chaque séquence d'acides aminés en une séquence d'acides nucléiques ingénierisée. Utilisez la table de fréquence d'utilisation des codons appropriée pour optimiser la séquence en vue de son expression dans une lignée cellulaire spécifique.

Dans ce cas, des bactéries Escherichia coli. Une fois que la séquence du gène cible est prête, cloner virtuellement et insérer le gène dans un plasmide vecteur approprié pour l'expression bactérienne. Dans ce cas, un vecteur PET 28 modifié.

Ce vecteur contient certains composants nécessaires à l'expression et à la purification des protéines. Le gène cible est modifié pour intégrer une séquence codant une étiquette d'histamine à l'extrémité N ou C de la protéine, ainsi qu'une séquence de clivage permettant la suppression de l'étiquette durant la purification. Le vecteur possède également un gène de résistance à un antibiotique destiné aux tests d'expression et à la fermentation.

Chaque séquence génétique codant pour la protéine cible est ensuite créée par des méthodes standard de synthèse génique en vue du clonage par extension primaire incomplète par polymérase, ou clonage PIPE, une stratégie de clonage basée sur la PCR au cours de laquelle le gène cible est amplifié à l’aide d’amorces complémentaires du vecteur prévu. Cette méthode exploite le caractère incomplet des stades tardifs de la PCR, qui laisse les produits PCR avec des extrémités simples brins variables. Je prépare la PCR d’insertion ou IPCR en ajoutant cinq microlitres de chaque amorce directe et inverse à chaque réaction.

Dans une plaque 96 puits selon une carte de plaque, ajouter deux microlitres de chaque gène synthétique complet dans le puits approprié selon la carte de plaque. Après avoir ajouté 25 microlitres de mélange maître PFU à chaque puits, effectuer 25 cycles de réactions en utilisant les conditions PCR suivantes. Dénaturer à 95 degrés Celsius pendant 30 secondes.

Anil à 50 degrés Celsius pendant 45 secondes et extension à 68 degrés Celsius pendant trois minutes. L'amplification du fragment est confirmée par analyse sur gel AGROS des produits d'IPCR. Les produits d'IPCR réussis sont représentés par des bandes intenses.

Des résultats moins satisfaisants sont souvent observés sous forme de bandes faibles ou de traînées dans une réaction distincte. Le plasmide d'expression est amplifié par PCR du vecteur, ou la fragmentation du VPCR est confirmée par analyse sur gel AROS des produits VPCR. Une fois les produits IPCR et VPCR amplifiés, ils sont ajoutés à une plaque de fusion et placés dans un thermocycleur pour la réaction de fusion.

Les constructions clonées avec succès sont ensuite transformées dans des cellules d’e. coli chimiquement compétentes et conservées dans des stocks de glycérol afin de commencer la série de tests d'expression. Une petite quantité de chaque échantillon provenant d'un stock de glycérol de la construction clonée est déposée sur une boîte de gélose séparée. La boîte est préparée avec un bouillon nutritif bactérien et le marqueur antibiotique kanamycine codé dans le vecteur, puis incubée toute la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant.

Commencez une pré-culture pour chaque échantillon en prélevant une colonie unique depuis la boîte de gélose récemment cultivée. Utilisez cette colonie pour ensemencer 1,2 millilitre de bouillon TB enrichi de canamycine et de glucose afin de permettre un traitement parallèle. Chaque pré-culture est cultivée dans un bloc de 96 puits à fond rond.

Cultiver toute la nuit à 37 degrés Celsius avec agitation à 220 tours par minute. Après la culture nocturne, amorcer des cultures d'induction à petite échelle pour chaque échantillon en utilisant 40 microlitres de la pré-culture pour l'ensemencement.

1,2 millilitre de bouillon TB, supplémenté avec 50 milligrammes par millilitre de canamycine et système Express Novagen. Un, faire croître les cultures d'induction à 20 degrés Celsius pendant 48 heures, sous agitation à 220 tr/min. Récolter les cellules par centrifugation à 4 000 unités de force relative centrifuge pendant 15 minutes.

Versez le surnageant et conservez les culots à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure avant tout traitement ultérieur après purification. Analysez la protéine avec et sans réaction de clivage par électrophorèse capillaire en utilisant un système Caliper Lab CHIP 90 selon le protocole du fabricant. Dans le cas de la protéine sous-unitaire PB2 de la grippe A, 14 des 34 constructions ont conduit à une protéine cible soluble et sont passées à l'étape suivante, à savoir la fermentation à grande échelle.

Pour démarrer une fermentation à grande échelle, ensemencer 100 millilitres de bouillon de culture bactérienne contenant 50 milligrammes par millilitre de can mycine à partir d'un stock de glycérol et faire croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, agiter à 220 tr/min et étendre la pré-culture en utilisant 10 millilitres pour l'ensemencement.

Un litre de bouillon contenant un milieu d'induction automatique et 50 milligrammes par millilitre de canamycine dans un flacon agité de deux litres. Agiter les cultures agrandies à 37 degrés Celsius environ toutes les 30 minutes. Vérifier la densité optique de la culture en mesurant l'absorbance UV à une longueur d'onde de 600 nanomètres.

Lorsque la densité optique atteint 0,6, modifier la température de l'incubateur agité à 20 degrés Celsius après le temps de croissance souhaité. Prélever un aliquot représentatif de 10 millilitres pour chaque construit afin de tester l'expression. Récupérer les cellules par centrifugation à 5 000 unités de force relative de gravité (G) pendant 15 minutes.

Versez le surnageant et congélez le culot cellulaire à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer cette procédure, décongelez et resuspendez la pâte cellulaire dans du tampon de lyse selon un rapport volumétrique de un à cinq. Agitez vigoureusement pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Utilisez une spatule propre pour détacher des morceaux sur les parois du bécher. Lysez mécaniquement les cellules sur de la glace à l’aide d’un sonicateur à barre. Clarifiez le lysat brut par centrifugation à 18 000 unités de force relative centrifuge pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Recueillir le surnageant et conserver un petit aliquot pour analyse avant de procéder à la purification à grande échelle. Confirmer l'expression protéique à grande échelle de chaque culture par analyse sur gel SDS-PAGE. Ce résultat représentatif de l'analyse SDS-PAGE montre une expression protéique robuste, une solubilité d'environ 50 % et environ 50 % de clivage.

Dans ce cas, la marque histidine a été éliminée en même temps qu'une marque de solubilité protéique ajoutée, qui avait été conçue dans le vecteur d'origine. La résine au nickel est utilisée pour séparer la protéine cible portant la marque unique d'histidine de tous les autres composants cellulaires, y compris les protéines bactériennes natives. Une colonne au nickel est préparée en la lavant avec quatre volumes de colonne d'eau UE afin d'éliminer le tampon de conservation, suivis d'un volume de colonne de tampon B et de cinq volumes de colonne de tampon.

La parallélisation de l'équilibration A pour E est effectuée à l'aide du distributeur de protéines, qui est capable de faire fonctionner plusieurs colonnes simultanément. Chargez chaque lysat clarifié contenant la protéine solubilisée portant une étiquette d'histamine sur une colonne distincte à un débit de deux millilitres par minute, puis effectuez plusieurs lavages d'un volume équivalent à celui de la colonne avec le tampon A ; récupérez le tampon de passage et conservez-le pour analyse. Éluisez la protéine liée selon une série de gradients par paliers avec les tampons A et B à 95 à 5, 60 à 40, puis finalement à 100 % de tampon B. Les composants du tampon B entrent en compétition avec l'histamine pour la résine au nickel et permettent ainsi de détacher la protéine de la colonne selon un rapport donné.

Recueillir chaque fraction d'élution séparément. Un chromatogramme représentatif obtenu lors d'une course sur une colonne au nickel est présenté ici. Analyser les fractions élutées sur la colonne au nickel, le lysat brut, le lysat clarifié et le flux sortant de la colonne au nickel par électrophorèse SDS-PAGE, puis comparer avec l'absorbance UV à 280 nanomètres enregistrée durant la purification sur colonne.

Cette étape détermine si la purification a été réussie. Sélectionnez et réunissez les fractions contenant la protéine cible afin de poursuivre le traitement ultérieur. Calculez la quantité totale de protéine à ce stade à l’aide du coefficient d’extinction théorique de la protéine, en mesurant l’absorbance UV à 280 nanomètres et en tenant compte du volume total des fractions regroupées.

Conserver un petit échantillon pour analyse. Le gène codant la protéine cible était associé à une séquence spécifique reconnue par la protéase ubiquitine-like (ULP) une comme site de clivage ; ainsi, l'ajout de l'ULP une entraîne la clivaison entre le marqueur histidine et la protéine d'intérêt. Pour commencer cette procédure, ajouter un microlitre de protéase ubiquitine-like une par cinq milligrammes de protéine présents dans les fractions regroupées.

À ce stade, la protéine clivée est transférée du tampon B vers le tampon A pour un traitement ultérieur à l'aide d'un tube de dialyse ; dialyser la protéine contre deux litres de tampon A pendant quatre heures à quatre degrés Celsius sous agitation. Utiliser une coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons pour PB2 après dialyse. Réaliser un autre gel SDS-PAGE de la protéine cible en présence et en absence de ULP1.

Ceci permettra de déterminer si le clivage par ULP1 a été réussi et d'identifier les meilleures fractions à retenir pour les étapes suivantes du traitement. On montre ici des résultats représentatifs de gel SDS-PAGE pour trois constructions de la polymérase pb. Deux marqueurs de poids moléculaire de sous-unité sont présents dans la voie un.

Les bandes deux, six et dix contiennent des protéines regroupées provenant de colonnes au nickel un. Les bandes trois, sept et onze contiennent l'écoulement du protéine clivée dans le tampon A à partir du nickel deux, et les bandes quatre, huit et douze montrent le retrait de la marque histamine dans le tampon B à partir du nickel deux.

Après l'élimination de l'histamine, les fractions regroupées provenant du deuxième nickel sont concentrées. Pour commencer la CEC, il faut à nouveau choisir la résine appropriée en fonction de la masse moléculaire de la cible. Dans ce cas, une colonne Acere S 110 over 30 GL est utilisée et équilibrée avec 200 millilitres de tampon CEC à un débit de 0,5 millilitre par minute. À l’aide d’une seringue de cinq millilitres, chargez l’échantillon dans une boucle d’injection de 10 millilitres et démarrez la course sur la colonne de CEC. Surveillez le chromatogramme d’absorbance UV à 280 nanomètres tout en collectant des fractions de petit volume.

Faites migrer toutes les fractions SEC pertinentes par SDS-PAGE. L'approche standard des essais de cristallisation des protéines repose sur la méthode de la goutte suspendue, impliquant une diffusion par la vapeur. Il n'est pas rare de mettre en place deux écrans matriciels étagés, voire plus, dès le départ pour chaque protéine cible.

Pour commencer ce processus, remplir préalablement chaque réservoir d'une plaque de cristallisation compacte de 96 puits avec 80 microlitres de chaque condition du crible de cristallisation sélectionné. Dispenser 0,4 microlitre de protéine dans le tampon SEC dans chacun des 96 puits. Ajouter ensuite 0,4 microlitre du crible de cristallisation, en veillant à un mélange complet de la goutte dans chaque puits. Recouvrir entièrement la plaque d'un ruban adhésif transparent, en assurant un scellement complet de chaque puits. Conserver la plaque à 16 degrés Celsius dans un endroit stable, à l'abri des vibrations environnementales.

Vérifiez périodiquement la cristallisation des protéines au cours des prochaines semaines au microscope stéréoscopique. Si des cristaux de protéines n'apparaissent pas, préparez de nouvelles plaques avec des conditions différentes et faites varier la concentration en protéine dans la goutte finale afin d'augmenter les chances de succès avant la récolte. Refroidissez un porte-échantillon de type A LS dans un bain rempli d'azote liquide et couvrez-le avec un couvercle pour commencer la récolte.

Couper le ruban transparent recouvrant le puits contenant le cristal de protéine cible vers un puits vide voisin. Ajouter 1,6 microlitre de la condition de cristallisation correspondante et le mélanger avec 0,4 microlitre d'éthylène glycol. Une solution contenant 20 % d'éthylène glycol dans la condition de cristallisation protège le cristal de protéine.

Lors de la congélation cryogénique, analyser le cristal au microscope et sélectionner une anse cryogénique appropriée pour la récolte, en adaptant le diamètre intérieur de l'anneau à la largeur maximale du cristal. Fixer l'anneau cryogénique à une baguette magnétique pour cristal et prélever le cristal directement à partir de la solution du puits. Plonger immédiatement l'anneau cryogénique avec le cristal récolti dans un agent cryoprotecteur, puis l'immerger dans un porte-échantillons de type LS.

Pour faire flasher, congeler le cristal en répétant l'opération pour un nombre souhaité de cristaux. Une fois la récolte terminée, utiliser une baguette à plateau pour placer un couvercle magnétique sur le plateau contenant les cristaux flashés à l'aide de languettes courbées. Retourner le plateau pour procéder à l'étape suivante.

Vissez un poussoir de palette sur la palette, puis transférez la palette vers le dispositif KU et utilisez-le pour détacher le couvercle. Les cristaux contenus dans la palette restent congelés dans un bain d'azote liquide jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour des études de diffraction des rayons X à l'aide du logiciel d'acquisition d'images J Director. Réglez les paramètres suivants pour l'analyse cristalline : fente du faisceau à 0,5 degré, distance du détecteur de 50 millimètres, pas d'image de 70 degrés et durée d'exposition de 30 secondes.

Voici un exemple de capture d'écran du logiciel d'acquisition d'images pendant l'analyse d'un cristal ; le panneau central montre la diffraction des rayons X observée à partir d'un cristal représentatif, permettant de collecter suffisamment d'images à haute résolution pour constituer un jeu de données complet nécessaire à la détermination de la structure tridimensionnelle. Les stratégies de clonage et de purification des protéines illustrées dans cette vidéo ont permis d'obtenir 14 échantillons purifiés de PB deux, parmi lesquels neuf ont produit des cristaux adaptés aux études de diffraction. Le jeu de données de diffraction des rayons X en laboratoire a été collecté sur cinq des neuf constructions à l’aide d’un générateur de rayons X à anode tournante Rigaku Super Bright FRE Plus utilisant un rayonnement QK alpha, équipé d’optiques Ossec Variamax HF et d’un détecteur CCD Saturn 944 Plus.

Une image de diffraction des rayons X de la sous-unité PB deux de la polymérase est présentée ici. Chaque jeu de données a été traité et un total de quatre structures de la sous-unité PB deux a été déterminé. Chaque structure a fait l'objet d'une évaluation par les pairs et a été téléchargée dans la banque de données des protéines pour un accès public.

Cette figure montre des diagrammes en ruban des molécules présentes dans l'unité asymétrique cristallographique. Parmi les quatre structures de PB deux, les structures secondaires sont colorées selon un motif arc-en-ciel avec les codes PDB correspondants. Le tableau présente l'analyse des résultats pour les cibles de PB deux de la grippe selon les méthodes décrites dans cet article vidéo.

Le pipeline de traitement parallèle à cibles multiples pour la détermination de la structure à partir du gène est illustré en cinq étapes : clonage, solubilité, purification, cristallisation et détermination de la structure. Le résultat de notre pipeline de biologie structurale fournit non seulement la base pour des recherches fondées sur la structure, mais alimente également des études supplémentaires telles que des tests fonctionnels pour confirmer l'activité de la protéine ou des criblages biophysiques de nouveaux composés par MAR ou SPR afin d'identifier des points de départ innovants pour le développement de médicaments. Cette technique et les outils inventés conjointement ont contribué à ouvrir la voie aux biologistes structuraux dans de nombreuses investigations orientées vers la découverte, notamment la conception de médicaments assistée par la structure, ayant eu un impact considérable sur la santé humaine et les maladies.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière dont le traitement parallèle multi-cibles peut grandement augmenter la réussite de la détermination structurale. N'oubliez pas que travailler dans un laboratoire de biologie structurale peut présenter des dangers extrêmes et que les précautions appropriées, telles que l'utilisation d'ÉPI, doivent toujours être prises lors des activités de laboratoire.