Lumière-driven Enzymatic décarboxylation

L'objectif général de cette expérience est de catalyser des réactions enzymatiques à l'aide de lumière visible. Dans cette approche, la lumière est utilisée pour convertir des acides gras en alcynes terminaux dans des conditions de réaction douces. La décarboxylation nécessite la rupture de liaisons CC.

Et cette liaison est très stable, ce qui rend cette réaction très difficile. L'utilisation de la lumière constitue une approche durable pour réaliser une réaction aussi difficile. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons tenté d'ajouter directement le peroxyde d'hydrogène à la réaction, ce qui a entraîné l'inactivation des enzymes.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit une quantité constante de peroxyde d'hydrogène. Nous avons d'abord utilisé de l'OleT purifié pour la biocatalyse dirigée par la lumière afin de caractériser notre enzyme. Par la suite, nous avons également testé un extrait brut, ce qui serait important pour le développement d'applications industrielles.

Après avoir cloné le gène synthétique OleT dans le vecteur d'expression et transformé le plasmide dans E. coli comme décrit dans le protocole textuel, ensemencer les cellules dans deux tubes à essai contenant trois millilitres de milieu LB avec 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline. Incuber les pré-cultures dans un agitateur pendant 15 heures. Diluer deux millilitres de la culture dans 200 millilitres de LB avec ampicilline dans deux flacons d'un litre.

Incuber les flacons dans un agitateur à 37 degrés Celsius et 180 tr/min jusqu'à ce que les cultures atteignent une densité optique à 600 nanomètres comprise entre 0,6 et 0,8. Ensuite, ajouter 0,5 millimolaire d'acide delta-aminolévulinique aux cultures. Puis induire les cellules en ajoutant de la tétracycline à 0,2 microgramme par millilitre dans les flacons.

Incuber les cultures pendant 15 heures à 20 degrés Celsius et 180 tr/min. Après induction, verser délicatement les cultures dans des tubes de centrifugation et centrifuger les tubes à 12000 ×g et 4 degrés Celsius pendant 20 minutes. Éliminer le surnageant.

Resuspendre les culots en pipetant 50 millilitres de tampon Tris glacé et transférer la suspension dans un tube conique de centrifugeuse. Procéder ensuite à la centrifugation à 4000 ×g et à 4 °C pendant 15 minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre chaque culot dans 3 millilitres de tampon en effectuant plusieurs pipetages répétés.

Lysar les cellules par sonication en effectuant trois cycles de 30 secondes, avec une pause d'une minute entre chaque cycle. Ensuite, centrifuger le lysat à 15000 ×g et à 4 °C pendant 20 minutes, puis prélever soigneusement l'extrait acellulaire à l'aide d'une pipette et le transférer dans des tubes coniques pour centrifugeuse. Pour préparer l'extrait brut destiné à la biocatalyse dirigée par la lumière, transférer trois millilitres d'extrait acellulaire dans un filtre centrifuge de 10 kilodaltons et centrifuger à 4000 ×g et à 4 °C afin d'éliminer les petites molécules.

Resuspendre la protéine dans trois millilitres de Tris. Pour caractériser l'activité d'OleT dans la biocatalyse induite par la lumière, la protéine doit être purifiée. Pour commencer la purification de la protéine, charger trois millilitres d'extrait cellulaire libre sur des colonnes à centrifuger au nickel NTA équilibrées.

Fermez les colonnes avec des bouchons inférieurs et des bouchons filetés. Secouez-les doucement jusqu'à ce que la résine soit uniformément répartie. Incubez ensuite les colonnes sur un agitateur rotatif.

Ensuite, centrifuger la colonne. Puis laver les colonnes en ajoutant un millilitre de tampon de lavage et en les centrifugeant à 700 ×g pendant deux minutes. Répéter le lavage deux fois supplémentaires.

Après le lavage, placer les colonnes dans des tubes coniques de centrifugeuse et ajouter un millilitre de tampon d'élution à chaque colonne. Centrifuger les tubes à 700 ×g pendant deux minutes et répéter l'élution deux fois supplémentaires. Ajouter les extraits combinés des colonnes à un filtre de centrifugeuse de 10 kilodaltons et centrifuger à 4000 ×g et 4 °C pour séparer l'imidazole utilisé pour l'élution de l'enzyme.

Enfin, déterminez la pureté et la concentration des protéines comme indiqué dans le protocole écrit. Pour commencer la procédure de bio-transformation, ajoutez d'abord 10 % d'un tensioactif tel que le Tergitol et 28,4 milligrammes d'acide stéarique à de l'eau distillée afin d'obtenir 10 millilitres d'une solution mère à 10 millimolaire. Chauffez la solution dans une chambre chauffante à 60 degrés Celsius jusqu'à ce que l'acide stéarique soit complètement dissous.

Utilisez cette solution pour préparer un mélange réactionnel selon le protocole suivant. Ajoutez du FMN, de l'EDTA, du tampon et de l'acide stéarique dans deux tubes en verre transparents et mélangez dans un bain-marie à 25 degrés Celsius. Puis, ajoutez 200 microgrammes par millilitre de l'enzyme purifiée ou de l'extrait brut dans les tubes.

Et illuminez-les avec une ampoule LED claire à une distance de deux centimètres. Ensuite, prélève 200 microlitres d'échantillons à des points temporels spécifiques dans des tubes préremplis avec 20 microlitres d'acide chlorhydrique à 37 % pour arrêter les réactions. Puis ajoute cinq microlitres d'une solution de 10 millimolaire d'acide myristique à chaque échantillon comme étalon interne.

Pour analyser les produits de la réaction, ajouter deux fois 500 microlitres d'acétate d'éthyle dans les tubes. Inverser les tubes pour les mélanger et centrifuger pendant une minute à 13 000 × g. Ensuite, transférer 400 microlitres des surnageants dans des tubes de microcentrifugeuse et les évaporer complètement en soufflant doucement sur les tubes avec de l'air comprimé. Ajouter 200 microlitres de MSTFA aux tubes.

Et incuber le mélange à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de dériver les échantillons avant l'analyse. Analyser les produits de réaction en injectant un échantillon de quatre microlitres dans un chromatographe en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation de flamme, en utilisant le profil de température décrit dans le protocole textuel. Ensuite, déterminer le rapport entre l'heptadécane et l'acide bêta-hydroxy formés dans chaque échantillon de réaction à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse.

Utilisez la température du four et les paramètres du spectromètre de masse tels que décrits dans le protocole écrit. Injectez un microlitre de chaque échantillon dans le chromatographe en phase gazeuse et enregistrez le chromatogramme. Enfin, surveillez les chromatogrammes de GC-MS pour chaque échantillon et analysez-les conformément au protocole du fabricant.

Les masses moléculaires des produits issus des réactions enzymatiques ont été déterminées à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse. Pour les acides gras à chaînes acyles plus longues, l'enzyme OleT catalyse préférentiellement leur décarboxylation en oléfines de différentes longueurs. Les échantillons provenant de la réaction de biotransformation ont été analysés par un chromatographe en phase gazeuse équipé d'un détecteur à ionisation de flamme.

La décarboxylation de l'acide stéarique s'est révélée trois fois plus rapide que la réaction d'hydroxylation, avec 99 % de l'acide stéarique converti en un mélange de rapport 3,3:1 d'heptadécane à l'acide 2-hydroxystéarique. Une fois maîtrisée, la biocatalyse induite par la lumière peut être réalisée en quelques heures si je l'effectue correctement. Dans la catalyse photochimique, le défi consiste à associer des réactions utiles à la capture de la lumière.

Dans notre cas, nous avons la lumière au sein de la molécule de FMN agissant comme photosensibilisateur, que nous relions à notre enzyme via une molécule intermédiaire, le peroxyde d'hydrogène.