Lumière-driven Enzymatic décarboxylation

L’objectif global de cette expérience est de piloter des réactions enzymatiques à l’aide de la lumière visible. Dans cette approche, la lumière est utilisée pour convertir les acides gras en alcynes terminaux dans des conditions de réaction douces. La décarboxylation nécessite la rupture des liaisons CC.

Et ce lien est très stable, ce qui rend cette réaction très difficile. L’utilisation de la lumière est une approche durable pour réaliser une réaction aussi difficile. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons essayé d’ajouter du peroxyde d’hydrogène directement à la réaction, ce qui a conduit à l’inactivation des enzymes.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une quantité constante de peroxyde d’hydrogène. Nous avons d’abord utilisé de l’OleT purifié pour la biocatalyse induite par la lumière afin de caractériser notre enzyme. Plus tard, nous avons également testé l’extraction brute qui serait importante pour le développement d’applications industrielles.

Après avoir cloné le gène synthétique OleT dans le vecteur d’expression et transformé le plasmide en E.Coli comme décrit dans le protocole de texte, inoculez les cellules dans deux tubes à essai contenant trois millilitres de milieu LB avec 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Incuber les pré-cultures dans un agitateur pendant 15 heures. Diluez deux millilitres de la culture dans 200 millilitres de LB avec de l’ampicilline dans deux flacons d’un litre.

Incuber les flacons dans un agitateur à 37 degrés Celsius et 180 tr/min jusqu’à ce que les cultures atteignent une densité optique à 600 nanomètres entre 0,6 et 0,8. Ensuite, ajoutez 0,5 millimolaire d’acide delta-aminolévulinique aux cultures. Et puis induire les cellules en ajoutant de la tétracycline à 0,2 microgramme par millilitre dans les flacons.

Incuber les cultures pendant 15 heures à 20 degrés Celsius et 180 tr/min. Après l’induction, décantez les cultures dans des tubes à centrifuger et centrifugez les tubes à 12000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Jetez le surnageant.

Remettez les granulés en suspension en les pipetant dans 50 millilitres de tampon Tris glacé et transférez la suspension dans un tube de centrifugation conique. Continuez en centrifugeant à 4000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension chaque pastille dans trois millilitres de tampon par pipetage répété.

Lysez les cellules en les sonisant avec trois cycles de 30 secondes en faisant une pause d’une minute entre les cycles. Ensuite, centrifugez le lysat à 15000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes, puis pipetez soigneusement l’extrait acellulaire dans des tubes de centrifugation coniques. Pour la préparation de l’extrait brut pour la biocatalyse assistée par la lumière, transférez trois millilitres d’un extrait acellulaire dans un filtre centrifuge de 10 kilodaltons et centrifugez-le à 4000 fois G à quatre degrés Celsius pour éliminer les petites molécules.

Remettez la protéine en suspension dans trois millilitres de Tris. Pour caractériser l’activité de l’OleT dans la biocatalyse induite par la lumière, la protéine doit être purifiée. Pour commencer la purification des protéines, chargez trois millilitres d’extrait acellulaire sur des colonnes de spin nickel NTA équilibrées.

Scellez les colonnes avec des bouchons inférieurs et des bouchons à vis. Et secouez-les légèrement jusqu’à ce que la résine soit uniformément répartie. Continuez en incubant les colonnes dans un agitateur aérien.

Ensuite, centrifugez la colonne. Ensuite, lavez les colonnes en ajoutant un millilitre de tampon de lavage et en les centrifugeant à 700 fois G pendant deux minutes. Répétez le lavage deux fois de plus.

Après le lavage, placez les colonnes dans des tubes à centrifuger coniques et ajoutez un millilitre de tampon d’élution dans chaque colonne. Centrifugez les tubes à 700 fois G pendant deux minutes et répétez l’élution deux fois de plus. Ajoutez les extraits combinés de la colonne dans un filtre centrifuge de 10 kilodaltons et centrifugez-le à 4000 fois G et quatre degrés Celsius pour séparer l’imidazole utilisé pour l’élution de l’enzyme.

Enfin, déterminez la pureté et la concentration des protéines comme indiqué dans le protocole textuel. Pour commencer la procédure de biotransformation, ajoutez d’abord 10 % d’un tensioactif tel que le tergitol et 28,4 milligrammes d’acide stéarique à de l’eau distillée pour obtenir 10 millilitres d’une solution mère de 10 millimolaires. Chauffez la solution dans une chambre de chauffe, à 60 degrés Celsius jusqu’à ce que l’acide stéarique soit complètement dissous.

Utilisez cette solution pour préparer un mélange réactionnel selon le protocole suivant. Ajoutez du FMN, de l’EDTA, un tampon et de l’acide stéarique dans deux tubes en verre transparent et mélangez dans un bain-marie à 25 degrés Celsius. Continuez en ajoutant 200 microgrammes par millilitre de l’enzyme purifiée ou de l’extrait brut dans les tubes.

Et éclairez-les avec une ampoule LED transparente à une distance de deux centimètres. Ensuite, prélevez des échantillons de 200 microlitres à des moments précis dans des tubes préremplis de 20 microlitres d’acide chlorhydrique à 37 % pour arrêter les réactions. Ajoutez ensuite cinq microlitres d’une solution d’acide myristique de 10 millimolaires à chaque échantillon en tant qu’étalon interne.

Pour analyser les produits de réaction, ajoutez deux fois 500 microlitres d’acétate d’éthyle dans les tubes. Renversez les tubes pour les mélanger et centrifugez pendant une minute à 13 000 fois G.Ensuite, transférez 400 microlitres de surnageants dans des micro-tubes à centrifuger et évaporez-les complètement en soufflant doucement sur les tubes avec de l’air comprimé. Ajoutez 200 microlitres de MSTFA dans les tubes.

Et incubez le mélange à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes pour dérivatiser les échantillons avant l’analyse. Analyser les produits de réaction en injectant un échantillon de quatre microlitres dans un chromatographe en phase gazeuse équipé d’un détecteur à ionisation de flamme en utilisant le profil de température décrit dans le protocole textuel. Ensuite, déterminez le rapport entre un heptadécane et un acide bêta-hydroxy formé dans chaque échantillon de réaction à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse.

Utilisez la température du four et les paramètres du spectromètre de masse comme décrit dans le protocole texte. Injectez un microlitre de chaque échantillon dans le chromatographe en phase gazeuse et enregistrez le chromatogramme. Enfin, surveillez les chromatogrammes du GCMS pour chaque échantillon et analysez-les selon le protocole du fabricant.

Les poids moléculaires des produits issus des réactions enzymatiques ont été déterminés à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse. Pour les acides gras ayant des chaînes acyles plus longues, l’enzyme OleT catalyse préférentiellement leur décarboxylation en oléfines de différentes longueurs. Des échantillons de la réaction de biotransformation ont été analysés par un chromatographe en phase gazeuse équipé d’un détecteur à ionisation de flamme.

Il a été démontré que la décarboxylation de l’acide stéarique se produisait trois fois plus rapidement que la réaction d’hydroxylation, 99 % de l’acide stéarique étant converti en un mélange 3,3:1 d’un heptadécane et d’un acide 2-hydroxystéarique. Une fois maîtrisée, la biocatalyse induite par la lumière peut être effectuée en quelques heures si je réalise correctement. Dans la catalyse de la lumière, le défi consiste à lier les réactions utiles à la récolte de la lumière.

Dans notre cas, nous avons la lumière à l’intérieur de la molécule FMN comme photosensibilisateur et nous la lions à notre enzyme via une molécule de transfert qui est le peroxyde d’hydrogène.