Name: Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Apprenez la dérivatisation post-colonne en HPLC à l'aide de colonnes à flux réactionnel pour améliorer la sensibilité et l'efficacité de détection des composés. Cette méthode élimine les bobines de réaction et s'applique aux sciences pharmaceutiques, biomédicales et environnementales.

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Ce travail a été soutenu par UWS et ThermoFisher Scientific. L’un des auteurs (DK) accuse réception d’une bourse australienne de troisième cycle.

Attention: S&#39;il vous plaît se référer à des fiches de données de sécurité (FDS) pour tous les matériaux et réactifs avant utilisation (c. -à- FS pour le méthanol). Assurer l&#39;utilisation de toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la manipulation des solvants et chromatographie liquide haute performance (HPLC) éluant. Veiller à l&#39;utilisation appropriée des contrôles techniques de HPLC analytique équilibre et détecteur instrumentation, et d&#39;assurer l&#39;utilisation des équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon de longueur, et des chaussures fermées). Remarque: Ce protocole décrit 3 méthodes de flux de réaction dérivatisation post-colonne (RF-PCD) techniques, chacune avec un réactif différent spécifique à la nature d&#39;un composé chimique d&#39;intérêt. Pour l&#39;analyse des ROS passez à la section «1. Détection des ROS en utilisant DPPH •&quot;, pour l&#39;analyse des amines primaires voir section &quot;2. Détection des amines primaires en utilisant fluorescamine&quot;, et pour l&#39;analyse des composés phénoliques passez à la section &quot;3 . La détection des phénolsen utilisant 4-aminoantipyrine et ferricyanure de potassium &quot;. Utiliser de l&#39; eau ultra-pure (par exemple, l&#39; eau Milli-Q) tout au long. Remarque: la connexion de la colonne HF est réalisée pratiquement de la même manière qu&#39;une colonne de HPLC classique avec la différence majeure étant le nombre de raccords d&#39;extrémité sur une colonne RF. Les raccords utilisés pour connecter une colonne de HPLC standard pour le système HPLC peuvent être utilisés pour connecter une colonne RF au système HPLC. 1. Détection des ERO Utilisation DPPH • <ol><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec 100% d&#39;eau sur la ligne A et 100% de methanol à la ligne B en tant que phase mobile. Purger les pompes selon les exigences du fabricant. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire , comme illustré sur la figure 4A. </li><li> Régler le détecteur UV-Vis à analyser à une longueur d&#39;onde de 520 nm. </li></ol></li><li> Mise en place decolonne RF <ol><li> Relier l&#39;entrée de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un orifice périphérique de sortie du détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connectez la ligne de pompe DPPH • à un port périphérique sur la sortie de la colonne de RF. </li><li> Bloquer le port de périphérique utilisé sur la sortie de la colonne RF en utilisant un bouchon de colonne. </li><li> Porter le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne B - 100% de methanol. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobile 100% de methanol pendant 10 minutes pour une colonne de longueur mm 4,6 mm DI x 100. Ce temps doit être adapté en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du DPPH • réactif <ol><li> Préparer une solution / ml 0,1 mg de DPPH • dans le méthanol. </li&gt; <li> Soniquer le flacon contenant le DPPH • réactif pendant 10 min. </li><li> Couvrir le flacon dans du papier pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger le DPPH • pompe avec le prêt DPPH • réactif selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Réglage de la sortie de la colonne HF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Repeser le récipient de port central et calculer le poids de l&#39;écoulement depuis l&#39;orifice central de la manière suivante: Poids de Port centrale (g) = Poids final de Port Central navire (g) - Poids initial de Port Central navire (g) </li><li> Répéter les étapes 1.4.2 et 1.4.3 de l&#39;effluent sortant de l&#39;UV-Vis qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids du récipient de port périphérique quesuit: Poids du port périphérique (g) = Poids final du port périphérique navire (g) - poids initial du port périphérique navire (g) </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit: % Port Central = Poids de Port centrale (g) / (poids de Port centrale (g) + Poids du port périphérique (g)) x 100 % Port périphérique = Poids du port périphérique (g) / (poids de Port centrale (g) + Poids du port périphérique (g)) x 100 </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et le flux périphérique est 30:70 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieure à 30%, de diminuer la quantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm Tuyau identifiant à la sortie de l&#39;orifice central. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 30% diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.4.1 à 1.4.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 30:70 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Réglez le taux de la D d&#39;écoulementPPH • pompe de réactif à 0,5 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec DPPH • réactif est maintenant prêt pour l&#39; analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés, ce qui indique que la course est terminée, arrêter le débit de la pompe de réactif de dérivatisation. </li><li> Retirez le DPPH • ligne de pompe de réactif du port périphérique et boucher le port. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobile dans laquelle il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile de l&#39;instrument CLHP. </li><li> Remplacer le DPPH • réactif avec du méthanol et purger la pompe supplémentaire. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol> 2. Détection de Amines primaires Utilisation Fluorescamine <ol><li> Préparation de la phase mobile <ol><li> Préparer 1 L d&#39;une solution 10 mM d&#39;acétate d&#39;ammonium, en ajustant le pH de la solution à 9,0 avec de 5 M d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium avant la dilution au volume. </li><li> Ajouter 52,6 ml d&#39;acétonitrile (ACN) dans le tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium pour obtenir une phase mobile prémélangée de 95:05 (tampon: ACN). </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec le tampon préparé préalablement mélangé à la ligne A en tant que phase mobile. Purger la pompe selon les exigences du fabricant. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire , comme illustré sur la figure 4A. </li><li> Fixer une bobine impulsion de l&#39;amortisseur à la pompe de dérivation. </li><li> Mettre en place le détecteur de fluorescence (FLD) avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 390 nm et une longueur d&#39;onde d&#39;émission de 475 nm. </li></ol></li><li> Mise en place de la colonne RF <ol><li> Connectez el&#39;entrée e de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un port périphérique sortie de la colonne HF au détecteur FLD en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connecter la ligne de la pompe à dérivatisation à un port périphérique sur la sortie de la colonne HF. </li><li> Bloquer le port de périphérique utilisé sur la sortie de la colonne RF en utilisant un bouchon de colonne. </li><li> Amener le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne A - 10 mM de tampon d&#39;acétate d&#39; ammonium à pH 9, prémélangée avec 5% d&#39; ACN. </li><li> Equilibrer la colonne avec la ligne A phase mobile 100% pendant 10 min pour une colonne de longueur mm 4,6 mm id x 100. Ce temps peut être mis à l&#39;échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du réactif à la fluorescamine <ol><li> Faire 100 ml d&#39;un ml -1 fluorescamine réactif 0,1 mg. </li> &lt;li&gt; Soniquer pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger la pompe de réactif avec le réactif fluorescamine préparé selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Réglage de la sortie de la colonne HF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Peser le récipient central et calculer le poids de l&#39;écoulement de l&#39;orifice central de la manière suivante à l&#39;étape 1.4.3. </li><li> À répéter les étapes 2.5.2 2.5.3 de l&#39;effluent sortant de la FLD qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids pour périphérique de la façon suivante à l&#39;étape 1.4.4. </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit dans l&#39;étape 1.4.5. </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et périphériquedébit est 43:57 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieur à 43%, de diminuer la quantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm Tuyau identifiant à la sortie de l&#39;orifice central. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 43%, diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5.1 à 2.5.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 43:57 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Régler le débit de la pompe de la phase mobile de débit à 0,7 ml min -1. </li><li> Réglez la pompe de dérivation à l&#39; écoulement à 0,1 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec le réactif fluorescamine est maintenant prêt pour l&#39;analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés, ce qui indique que la course est terminée, arrêter la pompe de dérivation. </li><li> Retirer la ligne de pompe de dérivation du port périphérique et le bouchon. </li><li> Équilibrer la colonne avec la phase mobilelaquelle il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile. </li><li> Remplacer le réactif fluorescamine avec de l&#39;acétonitrile et purger la pompe de dérivation. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol> 3. Détection de Phénols Utilisation 4-aminoantipyrine et Potassium Ferricyanide <ol><li> Préparation de la phase mobile <ol><li> Préparer 1 L d&#39;une solution d&#39;acétate d&#39;ammonium 100 mM, on ajuste le pH de la solution à 9,0 avec de 5 M d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium avant la dilution au volume. </li><li> Ajouter 52,6 ml de méthanol dans le tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium pour obtenir une phase mobile prémélangée de 95: 5 (tampon: methanol). </li></ol></li><li> Mise en place d&#39;instrument HPLC <ol><li> Préparation de l&#39;instrument HPLC avec le tampon préparé préalablement mélangé à la ligne A en tant que phase mobile. Purger la pompe selon fabricant »; S exigences. </li><li> Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et les deux pompes de réactif supplémentaires , comme illustré sur la figure 4B. </li><li> Fixer une bobine impulsion de l&#39;amortisseur à chacune des pompes de réactif. </li><li> Régler le détecteur UV-Vis pour analyser à une longueur d&#39;onde de 500 nm. </li></ol></li><li> Mise en place de la colonne RF <ol><li> Relier l&#39;entrée de la colonne de RF à l&#39;instrument CLHP. </li><li> Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l&#39;orifice de sortie central de la colonne HF. </li><li> Connecter un port périphérique sortie de la colonne RF au détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id. </li><li> Connecter chaque réactif ( par exemple, la 4-aminoantipyrine et du ferricyanure de potassium) , la ligne de la pompe à un orifice périphérique à la sortie de la colonne HF. </li><li> Amener le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne A - 100 mM de tampon d&#39;acétate d&#39; ammonium à pH 9, prémélangée avec 5% de methanol. </li><li> Équilibrer la colonne wvec la ligne A phase mobile 100% pendant 10 min pour une colonne de longueur mm 4,6 mm id x 100. Ce temps peut être mis à l&#39;échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l&#39;utilisateur peut employer. </li></ol></li><li> Préparation du réactif 4-aminoantipyrine <ol><li> Préparer un tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium avec un pH de 9 par suite de l&#39;étape 3.1.1. </li><li> Peser 150 mg de 4-aminoantipyrine et le dissoudre dans 100 ml de tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium préparé (pH 9). </li><li> Sonication pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purger la première pompe de réactif avec le réactif préparé 4-aminoantipyrine selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Préparation du réactif de potassium , le ferricyanure <ol><li> Peser 150 mg de ferricyanure de potassium et de se dissoudre dans 100 ml de tampon d&#39;acétate d&#39;ammonium (pH 9) préparés selon l&#39;étape 3.1.1. </li><li> Sonication pendant 1 min. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Purge la seconde pompe de réactif avec le réactif de ferricyanure de potassium préparé selon les exigences du fabricant. </li></ol></li><li> Tuning de la colonne RF <ol><li> Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l&#39;autre périphérique. </li><li> Recueillir l&#39;effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min. </li><li> Peser le récipient central et calculer le poids de l&#39;écoulement de l&#39;orifice central de la manière suivante à l&#39;étape 1.4.3. </li><li> Répéter les étapes 3.6.2 à 3.6.3 pour l&#39;effluent sortant de l&#39;UV-Vis qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids pour périphérique de la façon suivante à l&#39;étape 1.4.4. </li><li> Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit dans l&#39;étape 1.4.5. </li><li> Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et le flux périphérique est 50:50 (central: périphérique). Si l&#39;écoulement central est supérieure à 50%, diminuer laquantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm, un tube d&#39;identification au centre port de sortie. Si l&#39;écoulement central est inférieure à 50%, diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.6.1 à 3.6.6 jusqu&#39;à ce qu&#39;un rapport de segmentation de 50:50 (central: périphérique) est atteint. </li><li> Régler le débit de la pompe 4-aminoantipyrine débit à 0,5 ml min -1. </li><li> Régler le débit de la pompe de ferricyanure de potassium d&#39;écoulement de 0,25 ml min -1. Remarque: La colonne RF mis en place avec les réactifs à deux composants est maintenant prêt pour l&#39;analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés. </li></ol></li><li> Déposer exécuter des conditions d&#39;arrêt <ol><li> Une fois que tous les échantillons ont été injectés la course est terminée, ce qui indique que la course est terminée, arrêtez les deux pompes de réactif. </li><li> Supprimer les lignes de pompe à réactif à partir des orifices périphériques et les remplacer par un morceau de 0,13 mm Tuyau 15 cm. </li><li> Equilibrer la colonne avec la phase mobile dans which , il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min. </li><li> Arrêter l&#39;écoulement de la pompe de la phase mobile de l&#39;instrument CLHP. </li><li> Remplacer les deux réactifs sur le réactif pompes avec du méthanol et purger les pompes supplémentaires selon l&#39;exigence du fabricant. Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

RF-PCD permet le mélange efficace du réactif de dérivatisation avec le post-colonne HPLC effluent sans l&#39;utilisation de bobines de réaction, minimisant ainsi les effets de l&#39;élargissement de bande et améliorer la performance de séparation. Méthodes RF-CPD ont également montré l&#39;amélioration de la réponse du signal par rapport au procédé de détection. Camenzuli et al. 28 a été le premier à signaler l&#39;utilisation de colonnes de flux de réaction avec DPPH • pour la détection d...

Chromatographie haute performance liquide (HPLC) couplée à la colonne après dérivatisation (PCD) est un outil puissant qui est utile dans la résolution d&#39;un certain nombre de questions dans le laboratoire d&#39;analyse. Il peut être utilisé pour détecter des composés qui sont par ailleurs indétectable à la série de détecteurs disponibles 1,2, augmenter le signal de l&#39;analyte cible, ce qui permet aux limites inférieures de détection et la quantification ou de manière sélective 05/03 dérivatiser un analyte cible, afin d&#39;éviter les effets de matrice 6. Les réactions PCD couramment utilisés comprennent la réaction des amines, telles que des acides aminés, avec l&#39; ortho-phthaladehyde 7-9, ou ninhydrine 9,10 11,12 fluorescamine, la dérivatisation d&#39;espèces réactives de l&#39; oxygène (ERO) avec le 2,2-diphényl 1-picrylhydrazil radicaux DPPH (•) ou 13,14 2,2&#39;-azino-bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) 15,16, et l&#39;utilisation du réactif iodure azoture pour dériver du soufre ccomposés ontenant 17,18. Il existe, cependant, de nombreux inconvénients à l&#39;utilisation de réactions de PCD avec des systèmes HPLC 6. Parmi ceux - ci principalement l&#39;utilisation de bobines de réaction entre le point d&#39;addition du réactif de dérivatisation (s) et le détecteur, ce qui permet le temps de mélange et la réaction se produise 8. Ces réactions boucles ont souvent des volumes de 500 ul ou plus, ce qui est important par rapport au volume du reste du système HPLC 19. L&#39;utilisation de ces réactions à volume élevé entraîne une augmentation de boucles élargissement du pic par rapport à celle qui serait observée en l&#39;absence de la boucle de réaction. Il en résulte, des pics plus courts plus larges qui ont des limites plus élevées de quantification et de détection et négativement effets que la résolution chromatographique. Les figures 1 et 2 mettre en évidence la détérioration de la forme des pics qui résultent de l&#39;addition de divers volumes de boucle de réaction post-colonne. cette analysea été réalisée avec une composition de phase mobile de 94% de methanol et de 6% d&#39;eau Milli-Q. Le débit de la phase mobile d&#39;écoulement était de 1 ml / min, le volume d&#39;injection était de 20 ul et l&#39;analyse de la longueur d&#39;onde est de 265 nm. Des bobines de faire varier les volumes morts de 20 pi à 1000 pi ont été insérées entre la colonne et le détecteur pour simuler les effets de la boucle de réaction un volume mort dans les procédés de PCD. Ces boucles ont été préparés à partir d&#39;un tube de diamètre intérieur 0,5 mm en acier inoxydable. L&#39;expérience a été effectuée sur un système HPLC constitué d&#39;un dispositif de commande (SCL-10Avp), un faible gradient de pression de soupape (LCM-10ALVP), une pompe (LC-20ad), un injecteur (SIL-10ADVP), et un détecteur (PDA SPD-M10ADVP). La phase mobile est pompée à travers un dégazeur avant l&#39;introduction dans le système HPLC. La séparation a été effectuée en utilisant un x 4,6 mm id 5 um colonne de 250 mm. Les conditions expérimentales ont été choisies pour être typique de réactions PCD qui ont récemment été publiés dans la littérature. lela plus simple, la configuration du réacteur à colonne de poste le plus commun est appelé un réacteur tubulaire non segmenté qui est effectivement un long tube mince à travers lequel le liquide peut couler et la réaction peut avoir lieu. Dans ce pic système élargissement dépend non seulement sur ​​le volume mort ajouté au système, mais aussi le diamètre intérieur du tube , comme mis en évidence par Iijima et al. , 8. En outre, la géométrie de la bobine joue un rôle dans la marque élargissement observée. Stewart a indiqué que 20 l&#39; enroulement du réacteur modifie les profils d&#39;écoulement secondaire, ce qui entraîne un meilleur mélange, ce qui signifie que le volume mort peut être réduite au minimum. Il a été déclaré que l&#39; élargissement des pics est pas significative lors de l&#39; utilisation d&#39; un tube ouvert tricoté bobine 21. Lors de l&#39;élargissement du pic est trop grande, d&#39; autres types de réacteurs peuvent également être considérés 20,22. Ceux-ci peuvent comprendre des réacteurs à lit ou réacteurs à écoulement segmenté. Ces réacteurs sont particulièrement utiles pour des réactions lentes qui seraient autrement require grande réaction des boucles. Comme réacteurs tubulaires non-segmentés sont les types les plus courants de réacteurs utilisés dans les applications PCD, le reste de cet article traite de ce type de configuration du réacteur. La conception de la colonne d&#39;écoulement de réaction (RF) comprend un raccord d&#39;extrémité à orifices multiples qui permet la phase mobile pour sortir (ou entrée) de la colonne à travers un seul port situé dans la zone centrale radiale de la colonne ou trois ports situés à l&#39;extérieur région de paroi de la colonne (voir figure 3). Ces deux courants sont séparés au moyen d&#39;un raccord d&#39;extrémité contenant une fritte poreuse centrale qui est entourée par un anneau imperméable qui est à son tour entourée par une fritte poreuse externe qui se prolonge vers la paroi de la colonne. En raison de l&#39;écoulement imperméable bague de croix centrale est pas possible entre les deux régions poreuses. Au cours de la Chromatographie d&#39;écoulement de réaction, le réactif (s) de dérivation sont pompés à l&#39;encontre du sens d&#39;écoulement de la phase mobile dans une ou two des orifices extérieurs de la colonne d&#39;écoulement de réaction. L&#39;éluant de la colonne est mélangée avec le réactif (s) de dérivatisation dans la fritte externe et transmis au détecteur à travers un orifice externe libre. écoulement de réaction peut être utilisé soit pour un dérivé réactif unique (1 port du réactif de dérivatisation, 1 port pour passer l&#39;éluant de la colonne au détecteur et 1 port bloqué) ou d&#39;un système réactif à deux (2 ports pour les réactifs de dérivatisation et 1 port passer la colonne éluant au détecteur). Le débit du courant central peut soit être utilisé pour détecter l&#39;éluant de la colonne dérivatisé, la détection efficace de multiplexage 23, ou passé à perdre. Une technique de réglage principal qui est disponible lors de l&#39;exécution chromatographie RF-CPD est le rapport entre les flux centraux et périphériques. Le rapport optimal pour chaque dérivatisation dépend d&#39;un certain nombre de facteurs, tels que l&#39;écoulement central sera détecté ou transmis à déchets. Par conséquent, une fois que le rapport optimal a été déterminé, Il faut veiller à ce que le rapport de débit correct est réalisé avant chaque exécution en cours d&#39;exécution. Il a été constaté que l&#39;utilisation d&#39;une fritte pour mélanger le courant colonne d&#39;éluant et le réactif de dérivatisation dans les résultats RF-CPD dans un mélange plus efficace par rapport à des techniques de mélange classiques qui emploient typiquement une pièce en T à zéro du volume mort ou de faible volume mort W- pièce à mélanger les deux courants. Ceci a permis l&#39;utilisation de relativement petites boucles de réaction, voire la suppression de la boucle de réaction au total. La diminution des résultats de la taille de réaction en boucle pics plus par rapport aux méthodes traditionnelles de dérivatisation post-colonne. Cela signifie que, en dépit du fait que la totalité de l&#39;éluant de la colonne est dérivatisé, un plus grand rapport signal sur bruit sont observés et donc des limites inférieures de détection et la quantification peut être réalisée. Chromatographie d&#39;écoulement de réaction a été mis au point pour surmonter les difficultés d&#39;adaptation de la réaction de CPDs aux colonnes modernes de CLHP et de systèmes, en particulier la perte d&#39;efficacité causée par l&#39;élargissement de bande en raison de grands volumes morts après des colonnes causées par la nécessité d&#39;employer la réaction de grand volume boucles. Les procédés de mélange plus efficaces RF-PCD PCD par rapport au conventionnel signifie que le volume de la boucle de réaction inférieures peuvent être employées conduisant à une augmentation de l&#39;efficacité de la séparation observée. Par ailleurs Chromatographie RF-PCD montre à la fois le signal augmenté et diminué de bruit par rapport aux techniques de PCD classiques aboutissant à des limites inférieures de détection et la quantification par rapport aux méthodes de PCD classiques. Un autre avantage de la CPD-RF par rapport aux méthodes classiques de la CPD est la capacité à surveiller le courant dérivatisé qui est élué à partir de l&#39;orifice central de la colonne HF ainsi que le courant dérivé qui est élué à partir de la région périphérique de la colonne. RF-PCD est relativement nouvelle mais prometteuse technique qui affiche de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles de PCD. <p class="jove_content"&gt; Connexion de la colonne HF est réalisée pratiquement de la même manière qu&#39;une colonne de HPLC classique avec la différence majeure étant le nombre de raccords d&#39;extrémité sur une colonne RF. Les raccords utilisés pour connecter une colonne de HPLC standard pour le système HPLC peuvent être utilisés pour connecter une colonne RF au système HPLC.

<table><tbody><tr><td>Instrument HPLC</td><td>Série Agilent</td><td>1290 HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Pompe(s) supplémentaire(s) pour le système de dérivatisation</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td> Tube <td>PEEK non commercial</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons</td><td></td><td></td> de colonne <td>Fourni avec</td></tr><tr><td>coupe-tube PEEK</td><td>à colonne Sigma </td> Balance analytique <td>Aldrich Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Balance Balance</td><td></td><td></td><td>analytique à 4 points</td></tr><tr><td>Chronomètre</td><td></td><td></td><td>Equipement non scientifique Flacons</td></tr> de <tr><td>collecte Eluent</td><td>N’importe quel petit flacon à fond plat fera l’affaire, par exemple , Flacons HPLC</td>Flacons HPLC Dépendra de l’instrument <td></td><td></td></tr><tr><td>utilisé</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Récipients pour la phase mobile et la (les) solution(s) de dérivatisationSigma</td> <td>Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoire général Verrerie</td><td></td><td></td><td>Flacons jaugés, pippettes, etc. La quantité et les volumes dépendront de la méthode de préparation de l’échantillon.</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniac</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Acétonitrile corrosif</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4- aminoantipyrène&nbsp ;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Ferricyanure de potassium</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

poster colonne dérivatisation en utilisant la réaction colonnes flux chromatographie liquide haute performance

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Un protocole pour l’utilisation de colonnes de chromatographie liquide à haute performance en flux réactionnel pour les méthodes utilisant la dérivation post-colonne (PCD) est présenté. L’une des principales difficultés rencontrées dans l’adaptation des PCD aux systèmes et colonnes HPLC modernes est la nécessité de disposer de bobines réactionnelles de grand volume qui permettent le mélange des réactifs, puis la réaction de dérivatisation. Ce grand volume mort de colonne entraîne un élargissement de la bande, ce qui entraîne une perte de l’efficacité de séparation observée et de la détection de la sensibilité. Dans la dérivatisation post-colonne à flux réactionnel (RF-PCD), le(s) réactif(s) de dérivatisation sont pompés contre l’écoulement de la phase mobile dans un ou deux des orifices extérieurs de la colonne d’écoulement réactionnel où ils sont mélangés à l’effluent de la colonne à l’intérieur d’une fritte logée à l’intérieur du raccord d’extrémité de la colonne. Cette technique permet un mélange plus efficace de l’effluent de la colonne et du ou des réactifs de dérivatisation, ce qui signifie que le volume des boucles de réaction peut être minimisé, voire éliminé complètement. Il a été constaté que les méthodes PCD-RF sont plus performantes que les méthodes PCD conventionnelles en termes d’efficacité de séparation observée et de rapport signal/bruit. Un autre avantage des techniques RF-PCD est la possibilité de surveiller les effluents provenant du port central dans leur état sous-ivatisé. La RF-PCD a actuellement été testée sur une gamme relativement restreinte de réactions post-colonne, cependant, il n’y a actuellement aucune raison de suggérer que la RF-PCD ne pourrait pas être adaptée à une ou deux composantes existantes (tant que les deux réactifs sont ajoutés en même temps) réaction de dérivation post-colonne.

La première méthode PCD qui a été adapté pour être utilisé par RF-PCD est la dérivatisation d&#39;antioxydants en utilisant le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Cette réaction a été introduit par Koleva et al. , 25 et a été largement utilisée depuis. La détection repose sur la décoloration du DPPH • radicalaire en présence d&#39;espèces réactives de l&#39; oxygène, d&#39; où la présence d&#39;anti - oxydants se traduit par une diminution de l&#39;abso...

Un protocole pour l’utilisation de colonnes de chromatographie liquide à haute performance en flux réactionnel pour les méthodes utilisant la dérivation post-colonne (PCD) est présenté.

Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

L'objectif général de cette méthode est d'améliorer l'efficacité et la sensibilité de la dérivation en phase postcolonne par chromatographie liquide haute performance, ou méthode PCD, grâce à l'utilisation d'une colonne réactionnelle en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines tels que les sciences pharmaceutiques, biomédicales et environnementales, où des composés présentant une faible réponse aux détecteurs HPLC sont analysés. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'aucun serpentin de réaction n'est nécessaire.Étant donné que le mélange de l'effluent de colonne et du réactif de dérivation s'effectue de manière plus efficace que les méthodes conventionnelles, cette méthode a permis d'obtenir des informations sur les antioxydants, les acides aminés et les phénols. Elle peut également être appliquée à d'autres classes de composés, tels que les thiols, les métaux, les antibiotiques et les toxines.Bien que l'échantillon entier ne soit pas dérivatisé, en raison d'une moindre largeur de bande, la concentration de l'analyte dans le flux effluent est plus élevée que dans une analyse classique par dérivation post-colonne. Pour commencer cette procédure, préparez l'instrument de CLHP avec 100 % d'eau sur la ligne A et 100 % de méthanol sur la ligne B comme phase mobile, en purgeant les pompes conformément aux exigences du fabricant. Configurez les composants instrumentaux de la CLHP ainsi que la pompe supplémentaire de dérivation.Ensuite, régler le détecteur UV/VIS pour analyser à une longueur d'onde de 520 nanomètres. Connecter l'entrée de la colonne à flux de réaction, ou RF, à l'instrument de CLHP. Connecter un port périphérique de sortie au détecteur UV/VIS à l'aide d'un tube de 15 centimètres de longueur et de 0,13 millimètre de diamètre intérieur.Ensuite, reliez le tuyau de la pompe DPPH à un port périphérique située à la sortie de la colonne RF. Boucher le port périphérique inutilisé à la sortie de la colonne RF à l’aide d’un bouchon de colonne. Connectez un tube de 15 centimètres de longueur et de 0,13 millimètre de diamètre intérieur au port central de sortie de la colonne RF.Régler le débit de la pompe de l'HPLC à un millilitre par minute avec du méthanol à 100 %. Ensuite, équilibrer la colonne avec du méthanol à 100 % pendant 10 minutes. À ce stade, préparer une solution de DPPH à 0,1 milligramme par millilitre dans du méthanol.Soniquez le flacon contenant le réactif DPPH pendant 10 minutes. Purgez la pompe DPPH avec le réactif DPPH préparé conformément aux exigences du fabricant. Ensuite, prenez deux récipients secs et propres et étiquetez l'un comme « central » et l'autre comme « périphérique ». Pesez précisément les deux récipients.Recueillir l'effluent sortant par le port central dans le récipient étiqueté « central » pendant une minute. Après avoir re-weighé le récipient du port central, calculer la masse du débit provenant du port central. Répéter les étapes précédentes pour l'effluent sortant du UV/VIS qui est relié au port périphérique de la colonne RF.Calculez le poids pour le vaisseau du port périphérique. Ensuite, calculez le pourcentage du débit provenant des ports central et périphériques. Répétez les étapes précédentes jusqu'à ce que le rapport de débit soit correct, puis réglez le débit de la pompe DPPH à 0,5 millilitre par minute.Une fois l'analyse terminée, arrêter le débit de la pompe du réactif de dérivation. Retirer la ligne de la pompe du réactif DPPH du port périphérique et boucher le port. Équilibrer la colonne avec la phase mobile dans laquelle elle doit être conservée, en laissant la phase mobile circuler à travers la colonne à raison d'un millilitre par minute pendant 10 minutes.Ensuite, arrêtez l'écoulement de la pompe de la phase à bulles sur l'appareil de CPG. Enfin, remplacez le réactif DPPH par du méthanol et purgez la pompe supplémentaire. Deux chromatogrammes d'un échantillon de café ristretto, dérivés avec un radical DPPH à l'aide d'un appareil PCD conventionnel et d'un appareil RF-PCD, sont présentés ici.Les limites de quantification et de détection calculées pour chacun des acides aminés analysés dans les deux modes, PCD-RF et PCD conventionnelle, sont indiquées ici. Un chromatogramme des quatre acides aminés analysés à l'aide de la méthode PCD conventionnelle, de la méthode PCD-RF et du flux non dérivatisé provenant de la méthode PCD-RF est présenté ici. Une comparaison des signaux obtenus pour les pics dus à la glycine et à la leucine, à l'aide des méthodes PCD conventionnelle et PCD-RF, est affichée ici.Une comparaison de la largeur du pic de la tryptophane lors de l'analyse selon la méthode PCD classique, la méthode RF-PCD et le flux non dérivé de la méthode RF-PCD est présentée ici. Un échantillon témoin de 21 composants, contenant certains composants qui produisent une réponse au schéma de dérivation et d'autres qui n'en produisent pas, a été séparé, dérivé et détecté. Le même mélange a également été séparé et détecté sans dérivation, à des fins de comparaison.Une comparaison de la forme des pics du para-crésol, dérivatisé et non dérivatisé à l'aide de la colonne RF-PCD, est présentée ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être mise en place dans un délai équivalent à celui d'une analyse classique par dérivation en post-colonne. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de veiller à respecter au plus près les rapports de débit prescrits.Après cette procédure, d'autres réactifs de dérivation post-colonne, tels que l'OPA, la ninhydrine ou les halogènes, peuvent être utilisés afin d'analyser d'autres composés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de configurer et d'ajuster une colonne à réaction en flux.

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Tuning une colonne sectorielle écoulement parallèle et Activation de la détection multiplexée

Phosphoinositides sont des lipides dont l'abondance relative change rapidement en réponse à divers stimuli de signalisation. Cet article décrit une méthode pour mesurer l'abondance des phosphoinositides par les cellules métaboliquement étiquetage avec 3 H- myo-inositol, suivie par l'extraction et la désacylation. Glycéro-inositides extraites sont ensuite séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance et quantifiés par scintillation de flux.

Radiomarquage et la quantification des niveaux cellulaires de phosphoinositides par chromatographie liquide haute performance couplée flux scintillation

Une nouvelle méthodologie est présentée à synthétiser et élastomères programme de la chaîne principale cristallins liquides à l'aide disponibles dans le commerce monomères de départ. Une large gamme de propriétés thermomécaniques a été adaptée en ajustant la quantité d'agent de reticulation, tandis que le rendement était d'actionnement dépend de la quantité de déformation appliquée durant la programmation.

Synthèse de la chaîne principale programmable élastomères à cristaux liquides à l&#39;aide d&#39;un thiol-acrylate de réaction en deux étapes

Ici, nous décrivons en détail un protocole établi et robuste pour l’extraction des glucosinolates à partir de matières végétales broyées. Après un traitement à la sulfatase sur colonne des extraits, les désulfoglucosinolates sont élués et analysés par chromatographie liquide à haute pression.

Une méthode simple pour l&#39;extraction et l&#39;analyse glucosinolates avec haute pression chromatographie liquide (HPLC)

Nous présentons une commode extraction en phase solide couplée à la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) avec détection électrochimique (DCE) pour la détermination simultanée de trois neurotransmetteurs de monoamine et deux de leurs métabolites dans les urines des enfants en bas âge. Nous identifions également le métabolite MHPG comme un biomarqueur potentiel pour le diagnostic précoce des lésions cérébrales chez les nourrissons.

Une méthode pratique pour l’Extraction et analyse par chromatographie liquide à haute pression des neurotransmetteurs catécholamines et de leurs métabolites

Apprenez la dérivatisation post-colonne en HPLC à l'aide de colonnes à flux réactionnel pour améliorer la sensibilité et l'efficacité de détection des composés. Cette méthode élimine les bobines de réaction et s'applique aux sciences pharmaceutiques, biomédicales et environnementales.

Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance

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