Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance

L'objectif général de cette méthode est d'améliorer l'efficacité et la sensibilité de la dérivation en phase postcolonne par chromatographie liquide haute performance, ou méthode PCD, grâce à l'utilisation d'une colonne réactionnelle en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines tels que les sciences pharmaceutiques, biomédicales et environnementales, où des composés présentant une faible réponse aux détecteurs HPLC sont analysés. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'aucun serpentin de réaction n'est nécessaire.

Étant donné que le mélange de l'effluent de colonne et du réactif de dérivation s'effectue de manière plus efficace que les méthodes conventionnelles, cette méthode a permis d'obtenir des informations sur les antioxydants, les acides aminés et les phénols. Elle peut également être appliquée à d'autres classes de composés, tels que les thiols, les métaux, les antibiotiques et les toxines.

Bien que l'échantillon entier ne soit pas dérivatisé, en raison d'une moindre largeur de bande, la concentration de l'analyte dans le flux effluent est plus élevée que dans une analyse classique par dérivation post-colonne. Pour commencer cette procédure, préparez l'instrument de CLHP avec 100 % d'eau sur la ligne A et 100 % de méthanol sur la ligne B comme phase mobile, en purgeant les pompes conformément aux exigences du fabricant. Configurez les composants instrumentaux de la CLHP ainsi que la pompe supplémentaire de dérivation.

Ensuite, régler le détecteur UV/VIS pour analyser à une longueur d'onde de 520 nanomètres. Connecter l'entrée de la colonne à flux de réaction, ou RF, à l'instrument de CLHP. Connecter un port périphérique de sortie au détecteur UV/VIS à l'aide d'un tube de 15 centimètres de longueur et de 0,13 millimètre de diamètre intérieur.

Ensuite, reliez le tuyau de la pompe DPPH à un port périphérique située à la sortie de la colonne RF. Boucher le port périphérique inutilisé à la sortie de la colonne RF à l’aide d’un bouchon de colonne. Connectez un tube de 15 centimètres de longueur et de 0,13 millimètre de diamètre intérieur au port central de sortie de la colonne RF.

Régler le débit de la pompe de l'HPLC à un millilitre par minute avec du méthanol à 100 %. Ensuite, équilibrer la colonne avec du méthanol à 100 % pendant 10 minutes. À ce stade, préparer une solution de DPPH à 0,1 milligramme par millilitre dans du méthanol.

Soniquez le flacon contenant le réactif DPPH pendant 10 minutes. Purgez la pompe DPPH avec le réactif DPPH préparé conformément aux exigences du fabricant. Ensuite, prenez deux récipients secs et propres et étiquetez l'un comme « central » et l'autre comme « périphérique ». Pesez précisément les deux récipients.

Recueillir l'effluent sortant par le port central dans le récipient étiqueté « central » pendant une minute. Après avoir re-weighé le récipient du port central, calculer la masse du débit provenant du port central. Répéter les étapes précédentes pour l'effluent sortant du UV/VIS qui est relié au port périphérique de la colonne RF.

Calculez le poids pour le vaisseau du port périphérique. Ensuite, calculez le pourcentage du débit provenant des ports central et périphériques. Répétez les étapes précédentes jusqu'à ce que le rapport de débit soit correct, puis réglez le débit de la pompe DPPH à 0,5 millilitre par minute.

Une fois l'analyse terminée, arrêter le débit de la pompe du réactif de dérivation. Retirer la ligne de la pompe du réactif DPPH du port périphérique et boucher le port. Équilibrer la colonne avec la phase mobile dans laquelle elle doit être conservée, en laissant la phase mobile circuler à travers la colonne à raison d'un millilitre par minute pendant 10 minutes.

Ensuite, arrêtez l'écoulement de la pompe de la phase à bulles sur l'appareil de CPG. Enfin, remplacez le réactif DPPH par du méthanol et purgez la pompe supplémentaire. Deux chromatogrammes d'un échantillon de café ristretto, dérivés avec un radical DPPH à l'aide d'un appareil PCD conventionnel et d'un appareil RF-PCD, sont présentés ici.

Les limites de quantification et de détection calculées pour chacun des acides aminés analysés dans les deux modes, PCD-RF et PCD conventionnelle, sont indiquées ici. Un chromatogramme des quatre acides aminés analysés à l'aide de la méthode PCD conventionnelle, de la méthode PCD-RF et du flux non dérivatisé provenant de la méthode PCD-RF est présenté ici. Une comparaison des signaux obtenus pour les pics dus à la glycine et à la leucine, à l'aide des méthodes PCD conventionnelle et PCD-RF, est affichée ici.

Une comparaison de la largeur du pic de la tryptophane lors de l'analyse selon la méthode PCD classique, la méthode RF-PCD et le flux non dérivé de la méthode RF-PCD est présentée ici. Un échantillon témoin de 21 composants, contenant certains composants qui produisent une réponse au schéma de dérivation et d'autres qui n'en produisent pas, a été séparé, dérivé et détecté. Le même mélange a également été séparé et détecté sans dérivation, à des fins de comparaison.

Une comparaison de la forme des pics du para-crésol, dérivatisé et non dérivatisé à l'aide de la colonne RF-PCD, est présentée ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être mise en place dans un délai équivalent à celui d'une analyse classique par dérivation en post-colonne. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de veiller à respecter au plus près les rapports de débit prescrits.

Après cette procédure, d'autres réactifs de dérivation post-colonne, tels que l'OPA, la ninhydrine ou les halogènes, peuvent être utilisés afin d'analyser d'autres composés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de configurer et d'ajuster une colonne à réaction en flux.