Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance

L’objectif global de cette méthode est d’améliorer l’efficacité et la sensibilité de la chromatographie liquide à haute performance après dérivation sur colonne, ou méthode PCD, grâce à l’utilisation d’une colonne à flux réactionnel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines tels que les sciences pharmaceutiques, biomédicales et environnementales, où les composés qui ont une faible réponse aux détecteurs HPLC sont analysés. Le principal avantage de cette technique est qu’aucune bobine de réaction n’est nécessaire.

Comme le mélange de l’effluent de la colonne et du réactif de dérivation se produit plus efficacement que les méthodes conventionnelles. Cette méthode a été utilisée pour donner un aperçu des antioxydants, des acides aminés et des phénols. Il peut également être appliqué à d’autres composés de classe, tels que les thiols, les métaux, les antibiotiques et les toxines.

Bien que l’échantillon entier ne soit pas dérivé, en raison de l’élargissement de la bande plus faible, la concentration de l’analyte dans le flux d’effluent est plus élevée que dans l’analyse conventionnelle de dérivatisation post-colonne. Pour commencer cette procédure, préparez l’instrument HPLC avec 100 % d’eau sur la ligne A et 100 % de méthanol sur la ligne B comme phase mobile, en purgeant les pompes selon les exigences du fabricant. Configurez les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire.

Ensuite, réglez le détecteur UV/VIS pour analyser à une longueur d’onde de 520 nanomètres. Connectez l’entrée de la colonne de flux réactionnel, ou RF, à l’instrument HPLC. Connectez un port périphérique de sortie au détecteur UV/VIS à l’aide d’un tube de 15 centimètres de longueur et de 0,13 millimètre de diamètre intérieur.

Ensuite, connectez la conduite de pompe DPPH à un port périphérique sur la sortie de la colonne RF. Bloquez le port périphérique inutilisé sur la sortie de la colonne RF à l’aide d’un bouchon de colonne. Connectez un tube de 15 centimètres de diamètre intérieur à l’orifice central de sortie de la colonne RF

Porter le débit de la pompe HPLC à un millimètre par minute à 100 % de méthanol. Ensuite, équilibrez la colonne avec du méthanol à 100 % pendant 10 minutes. À ce stade, préparez une solution de 0,1 milligramme par millilitre de DPPH et de méthanol.

Soniquer le ballon contenant le réactif DPPH pendant 10 minutes. Purgez la pompe DPPH avec le réactif DPPH préparé conformément aux exigences du fabricant. Ensuite, prenez deux récipients secs et propres et étiquetez-les comme centraux et l’autre comme périphériques.

Recueillir l’effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pendant une minute. Après avoir pesé à nouveau le navire du port central, calculez le poids du flux du port central. Répétez les étapes précédentes pour l’effluent sortant de l’UV/VIS qui est connecté au port périphérique de la colonne RF.

Calculez le poids du navire bâbord périphérique. Ensuite, calculez le pourcentage du flux provenant des ports centraux et périphériques. Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que le rapport de débit soit correct, puis réglez le débit de la pompe DPPH à 0,5 millilitre par minute.

Une fois le cycle terminé, arrêtez le débit de la pompe de réactif de dérivatisation. Retirez la conduite de la pompe à réactif DPPH de l’orifice périphérique et bouchez l’orifice. Équilibrez la colonne avec la phase mobile dans laquelle elle doit être stockée, en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à un millimètre par minute pendant 10 minutes.

Ensuite, arrêtez le débit de la pompe à bulles sur l’instrument HPLC. Enfin, remplacez le réactif DPPH par du méthanol et purgez la pompe supplémentaire. Deux chromatogrammes d’un échantillon de café ristretto, dérivé avec un radical DPPH à l’aide d’instruments PCD conventionnels et RF-PCD, sont présentés ici.

Les limites calculées de quantification et de détection pour chacun des acides aminés analysés dans les modes RF-PCD et PCD conventionnel sont répertoriées ici. Un chromatogramme des quatre acides aminés analysés à l’aide de la méthode PCD conventionnelle, de la méthode RF-PCD et du flux non dérivé de la méthode RF-PCD est présenté ici. Une comparaison des signaux obtenus pour les pics dus à la glycine et à la leucine en utilisant à la fois les méthodes PCD conventionnelles et RF-PCD est présentée ici.

Une comparaison de la largeur du pic de tryptophane lors de l’analyse à l’aide de la méthode PCD conventionnelle, de la méthode RF-PCD et du flux non dérivé de la méthode RF-PCD est présentée ici. Un échantillon de test à 21 composants contenant des composants qui montrent une réponse au schéma de dérivatisation et d’autres qui ne le font pas ont été séparés, dérivés, détectés. Le même mélange a également été séparé et détecté non dérivé à des fins de comparaison.

Une comparaison de la forme du pic du para-crésol, à la fois dérivé à l’aide de la colonne RF-PCD et non dérivé, est présenté ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être mise en place en même temps que l’analyse classique de dérivation de poteaux-colonnes. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’être aussi proche que possible des rapports de débit prescrits.

Suite à cette procédure, d’autres réactifs de dérivation post-colonne, tels que l’OPA, la ninhydrine ou les halogènes, peuvent être utilisés afin d’analyser d’autres composés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la configuration et du réglage d’une colonne de flux de réaction.