Tuning une colonne sectorielle écoulement parallèle et Activation de la détection multiplexée

L'objectif général de cette procédure de CLHP est d'ajuster une colonne à flux segmenté parallèle afin de permettre une détection multiplexe. Cette méthode répond à des questions essentielles dans les domaines de la santé et du bien-être, des sciences de l'environnement, de la criminalistique, ainsi que dans tous les domaines nécessitant l'analyse d'échantillons complexes, comme la découverte biomoléculaire. Cette technique permet une analyse complète des échantillons tout en fournissant des informations sur les caractéristiques chimiques et bioactives des substances présentes dans des mélanges complexes.

Les protocoles de détection multiple permettent également une analyse rapide. Cette méthode permet d'élaborer des stratégies visant à définir l'empreinte chimique de mélanges complexes, comme le café et le vin, permettant ainsi aux fabricants de distinguer leurs produits des contrefaçons bon marché. Au départ, il peut sembler peu orthodoxe de ne pas envoyer l'échantillon entier vers un seul détecteur pour une analyse précise.

Cependant, la concentration de l'analyte dans chaque flux est supérieure à celle du flux total d'une colonne conventionnelle. Commencez par configurer l'appareil de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) avec de l'eau à 100 % UE et du méthanol pur comme phases mobiles A et B respectivement. Si un détecteur de spectrométrie de masse (MS) est utilisé, ajoutez 0,1 % d'acide formique aux deux phases mobiles, puis purgez les pompes de l'HPLC conformément aux instructions du fabricant.

Assemblez les détecteurs MS UV VS et DPPH. Conformément aux instructions du fabricant. Veillez à ce que les composants soient disposés de manière appropriée, de sorte que le volume mort dans les lignes des détecteurs soit minimal.

Ensuite, régler la longueur d'onde du détecteur UV VISTA sur la longueur d'onde spécifique à l'échantillon ici. 280 nanomètres pour le détecteur MS. Utiliser le mode positif pour le comptage total des ions ou l'analyse TIC avec la méthode de détection par balayage complet.

Équilibrez la température et le débit de gaz du détecteur de spectrométrie de masse (MS) aux valeurs suivantes : température du vaporisateur à 500 degrés Celsius, température du capillaire à 350 degrés Celsius, débit de gaz auxiliaire de 40 unités, débit de gaz de balayage de cinq unités, débit de gaz de protection de 60 unités, et tension de pulvérisation de 3,5 kilovolts. Pour préparer le réactif radicalaire DPPH, commencez par dissoudre 25 milligrammes de radical DPPH dans 250 millilitres de méthanol dans une fiole jaugée.

Ajouter 250 microlitres d'acide formique à la solution et soniquer la solution pendant 10 minutes. Ensuite, couvrir le flacon avec du papier d'aluminium pour éviter l'exposition à la lumière. Puis, purger la pompe avec la solution du radical DPPH conformément aux recommandations du fabricant afin de mettre en place le système radicalaire DPPH.

Veillez à ce que la ligne de pompe soit fixée à l'entrée d'un raccord en T, puis reliez la bobine réactionnelle de 100 microlitres à la sortie du raccord en T. Fixez le détecteur à l'autre extrémité du boîtier ENC de la bobine réactionnelle, la bobine réactionnelle et un chauffe-colonne. Enfin, réglez le détecteur UV de radical DPPH sur 520 nanomètres.

Pour construire la colonne à flux segmenté parallèle (PSF), reliez d'abord l'entrée de la colonne à l'appareil HPLC. Ensuite, utilisez un morceau de tuyau pour relier le port central au détecteur de spectrométrie de masse (MS). Utilisez un tuyau de mêmes dimensions pour relier un port périphérique de la colonne au détecteur UV-VIS et un autre au raccord en T du système de détection du radical DPPH.

Bloquez tous les ports périphériques inutilisés avec des bouchons de colonne. Réglez le débit de la CLHP à un millilitre par minute de phase mobile B à 100 % pour une colonne de 4,6 millimètres de diamètre interne et de 250 millimètres de longueur. Équilibrez pendant 20 minutes.

Pour commencer le réglage du système PSF, commencez par remplir des récipients de collecte vides. Utilisez ces flacons pour collecter séparément la phase mobile provenant des ports UV VS et DPPH. Notez la période de collecte et recueillez au moins 500 milligrammes de solvant dans chaque récipient.

Ensuite, peser les récipients de collecte afin de déterminer la masse de la phase mobile, puis diviser cette masse par la densité du méthanol pour calculer le volume de phase mobile collecté à partir de chaque sortie. Enfin, déterminer le débit vers le détecteur de spectrométrie de masse (MS) et calculer les proportions de débit de tous les détecteurs en pourcentage du débit total, comme indiqué dans le protocole écrit. Si les proportions de débit s'écartent sensiblement des valeurs idéales, ajouter un tube supplémentaire si nécessaire afin d'ajuster la pression arrière, puis répéter les opérations de collecte et de calcul.

Enfin, réglez le débit de la pompe du réactif radicalaire DPPH afin qu'il corresponde au débit du port de sortie relié au détecteur. Une analyse HPLC multiplexée a été réalisée sur un échantillon de café. La possibilité d'enregistrer simultanément les chromatogrammes UV et MS du radical DPPH permet d'associer facilement les composés de l'échantillon réagissant positivement au radical DPPH avec les profils UV.

Et les réponses MS, basées sur l'alignement du temps de rétention, pour lesquelles une réponse positive était observée sur le détecteur TIC du MSS, ont permis d'enregistrer la masse moléculaire du pic. La facilité de mise en correspondance des pics entre différents procédés de détection permet un criblage et une caractérisation rapides et plus efficaces d'un échantillon complexe tel que le café. Une fois maîtrisée, cette technique peut être mise en place en environ une heure et être prête pour l'analyse des échantillons selon cette procédure. D'autres détecteurs, tels que l'indice de réfraction ou la fluorescence, ainsi que des méthodes de détection chimique comme la chimiluminescence, peuvent être utilisés afin d'obtenir des informations supplémentaires sur l'échantillon.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez reconnaître l'importance du multiplexage des processus de détection pour mieux comprendre un échantillon complexe. En outre, la détection multiplexe à l'aide de colonnes parallèles à flux segmenté constitue un moyen extrêmement efficace d'effectuer l'exploration biologique.