Name: Une méthode simple pour lextraction et lanalyse glucosinolates avec haute pression chromatographie liquide (HPLC) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Découvrez une méthode simple pour extraire et analyser les glucosinolates par chromatographie liquide haute pression. Cette technique validée s'applique à divers échantillons biologiques en écologie et sciences alimentaires.

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NMvD remercie le Dr Michael Reichelt (Institut Max-Planck d’écologie chimique, Iéna, Allemagne) d’avoir fourni les premiers échantillons de référence lorsqu’elle a commencé à utiliser cette méthode il y a 16 ans. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, Pays-Bas), Sebastian Krosse (B-Ware, Nimègue, Pays-Bas) et Christian Ristok (iDiv, Leipzig) sont récompensés pour avoir amélioré le protocole au fil des ans. Mirka Macel et Martine Huberty (Université de Tübingen, Allemagne) sont remerciées pour leur autorisation d’utiliser le chromatogramme de Rorippa. Les auteurs remercient le Centre allemand de recherche intégrative sur la biodiversité (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, financé par la Fondation allemande pour la recherche (FZT 118).

1. Préparation des solutions nécessaires pour l&#39;extraction glucosinolates <ol><li> Préparer 500 ml de 70% de methanol (MeOH) dans l&#39;eau (ultrapurs) dans une bouteille en verre. Pour 100 échantillons et 5 normes, 420 ml de 70% de MeOH est nécessaire. </li><li> Préparer 20 mM d&#39; acétate de sodium (NaOAc) (pH = 5,5) en y ajoutant 0,82 g de NaOAc ou 1,36 g de NaOAc 3 x H 2 O dans 500 ml d&#39;eau; ajuster le pH avec du chlorure d&#39;hydrogène (HCl). Stocker le NaOAc dans le réfrigérateur. Pour 100 échantillons et 5 standards, 370 ml de NaOAc 20 mM (pH = 5,5) dans de l&#39;eau est nécessaire. </li><li> Pour préparer le matériau de la colonne, mélanger 10 g de gel de dextran réticulé (G-25) avec 125 ml d&#39;eau ultrapure. Stocker le mélange obtenu dans un réfrigérateur (4 ° C). </li><li> Préparation de la solution de sulfatase <ol><li> Dissoudre 10.000 unités de aryl sulfatase (Type H-1 à partir de Helix pomatia) dans 30 ml d&#39;eau ultrapure et ajouter 30 ml d&#39;éthanol absolu (EtOH). Bien mélanger la solution et le transférer à un cen 250 mltube trifuge ou plusieurs petits tubes, selon la disponibilité. </li><li> Centrifuger le mélange à 2650 xg pendant 20 min à température ambiante (RT). Transférer le surnageant (s) dans un bêcher; ajouter 90 ml de EtOH et le mélanger. Centrifuger le mélange dans un ou plusieurs tubes de centrifugation à 1 030 xg pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Jeter les surnageants. Dissoudre et mélanger les granulés dans un total de 25 ml d&#39;eau ultrapure. Vortex bien se passer dans des tubes de 1 ml, et stocker dans un congélateur à -20 ° C; ils garderont pendant au moins un an. </li></ol></li><li> Préparation de la solution de référence de sinigrine <ol><li> Peser environ 9 mg de monohydrate sinigrin avec 1 pg de précision (par exemple, 8,769 mg). Transférer dans une fiole jaugée de 10 ml et dissoudre le monohydrate sinigrine dans 10,0 mL d&#39;eau ultrapure. </li><li> Calculer la molarité de la solution mère et de préparer cinq références de sinigrine entre 50-750 uM par dilution de la solution de stock. Pour un exemple détaillé, voir<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">S1 supplémentaire du fichier</a> . </li><li> Distribuer les différentes références de sinigrine dans des tubes de réaction de 1,5 ml et les congeler à 20 ° C. Inclure une série de cinq références sinigrine dans chaque lot d&#39;extraction. Utilisez toujours les valeurs de molarité correctes pour le moment utilisé sinigrin références lors du calcul des concentrations. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de l&#39;installation d&#39;extraction <ol><li> Préparez un rack de colonne pour les colonnes de pipettes Pasteur (pour la préparation de colonnes, voir étape 3.1). Attribuer le rack ou les colonnes de garder la trace des numéros d&#39;échantillons (voir Figure 1). </li><li> Préparer un bloc tenant le même nombre de tubes à centrifuger 2 mL étiquetés (voir l&#39; étape 3.3 et la figure 1) </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Rack pour l&#39; extraction glucosinolates. Vue de face (à gauche) et vue de dessus (à droite) d&#39;un support de colonne self-made et le bloc pour l&#39;extraction de glucosinolates. Hauteur: 100 mm, distance entre les trous décalé (pour maintenir les colonnes de pipette Pasteur): 30 mm (axe x) x 15 mm (axe y). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 3. Préparation des colonnes et des tubes à centrifuger <ol><li> Préparer une colonne par échantillon et cinq colonnes supplémentaires pour les cinq échantillons de référence sinigrine. <ol><li> Dans chaque pipette en verre, placez un morceau de laine de verre d&#39;environ 1 cm x 1 cm. Utilisez un bâton en bois ou en verre pour pousser la laine de verre vers le bas au point où la pipette se rétrécit. La laine de verre doit empêcher le matériau de la colonne de courir, mais ne pas utiliser trop, car il va ralentir l&#39;élution des colonnes. Porter des gants when travaillant avec de la laine de verre. </li></ol></li><li> Placez les colonnes sur la grille de colonne (voir la figure 1). Placer la grille de colonne dans un plateau de laboratoire (bac à déchets) pour attraper les éluants utilisés pour les lavages de colonne consécutifs. </li><li> Couper les 5 premiers mm au large de la pointe d&#39;une pointe de pipette en plastique de 1 ml et pipette 0,5 ml de matériau de la colonne préparée (G-25 gel dans l&#39;eau, voir étape 1.3) dans chaque colonne. Agiter le flacon contenant le matériau de la colonne bien avant pipetage. Jeter les colonnes qui fuient (matière G-25 en cours d&#39;exécution à travers la couche de laine de verre) et les remplacer par de nouveaux. <ol><li> Après pipetage matériau de la colonne dans les colonnes, ajouter 1 ml d&#39;eau ultrapure à jeter dans le matériau. </li></ol></li><li> Préparer un tube de réaction de 2 ml par échantillon et cinq tubes pour les cinq échantillons de référence sinigrine; étiquetez-les. Utiliser une aiguille de dissection pour faire des trous dans les bouchons pour lyophilisation plus tard et placer les tubes préparés dans le bloc de tubes dans le même schéma exact que lecolonnes (étape 2.2, voir la figure 1). </li></ol> 4. Extraction des glucosinolates <ol><li> Peser lyophilisés et le matériel végétal finement broyé (habituellement de 50,0 à 100,0 mg de poids sec, les concentrations de glucosinolates finales dans l&#39;extrait devrait être dans la gamme de la courbe de référence) à 0,1 mg près dans 2 mL, étiquetés, rond des tubes de réaction -bottom. Ajouter deux petites billes métalliques (3 mm de diamètre) comme retardateurs d&#39;ébullition à chaque tube. NOTE: Le protocole peut également être appliqué à, matériaux flash-congelés frais, qui ont été broyés sous azote liquide et conservés congelés jusqu&#39;à l&#39;extraction. Augmenter la quantité de matériau pesé pour l&#39; extraction et le pourcentage de methanol dans le liquide d&#39;extraction à 85% pour compenser la dilution par l&#39;eau contenue dans les matières 19. </li><li> Pipette 1 ml de 70% de MeOH dans chaque tube et vortex brièvement. Fermer les tubes et les sceller avec des bouchons de sécurité avant de les placer le plus rapidement possible dans une chaude water bain (90-92 ° C) pendant quelques minutes (~ 5 min), jusqu&#39;à ce que le 70% de MeOH se résume simplement. Attention: Porter des lunettes de sécurité lors de cette étape! </li><li> Placer les tubes d&#39;échantillons dans un bain à ultrasons pendant 15 min. Pendant ce temps, prendre la sulfatase et les cinq échantillons de référence sinigrine hors du congélateur pour les décongeler à la température ambiante. </li><li> Après ultra-sonication, centrifuger les tubes échantillons à 2700 xg dans une centrifugeuse de paillasse pendant 10 min à température ambiante; une pastille doit former dans chaque tube. Ajouter les surnageants aux colonnes marquées et la pipette des échantillons de référence sur cinq colonnes séparées. <ol><li> Alors que pipetage les surnageants, gardez la pointe bien sur la pastille pour éviter les matières végétales de pipetage. A noter que lorsque les échantillons séchés sont utilisés, le volume de surnageant sera inférieur à 1,0 ml. </li></ol></li><li> Ajouter 1 mL de MeOH à 70% pour les granulés restants dans les tubes d&#39;échantillon et vortexer les tubes avant de les placer dans un bain à ultrasons pendant 15 min. Centrifuger les tubes à nouveau, comme dans l&#39;étape 4.4, et ajoutez le supernahabi- aux colonnes respectives; en raison des propriétés du matériau de la colonne, le groupe sulfate négativement chargé des glucosinolates sera spécifiquement retenu sur la colonne. </li><li> Laver les colonnes avec les extraits en trois étapes successives. <ol><li> Introduire à la pipette 2 x 1 ml de MeOH à 70% sur chaque colonne. Attendez que la colonne pour fonctionner à sec avant d&#39;ajouter les 1 mL prochaines; cela va éliminer les composés plus apolaires à partir des extraits (par exemple, la chlorophylle). </li><li> Rincez le MeOH en ajoutant 1 ml d&#39;eau ultrapure à chaque colonne. </li><li> Pipette 2 x 1 ml de 20 mM NaOAc tampon à chaque colonne pour créer les conditions optimales pour la réaction de sulfatase. </li></ol></li><li> Prenez le rack avec les colonnes sur le bac à déchets et sécher les pieds de la grille avec un tissu. Placer la grille sur le bloc avec des flacons et des tubes étiquetés. Assurez - vous que chaque extrémité de la colonne est dans le, étiqueté, tube 2 ml correspondant (voir la figure 1). </li><li> Ajouter 20 pi de sulfatase solutisur les colonnes. Faire en sorte que la sulfatase atteigne la surface du matériau de la colonne. Pipeter 50 ul de NaOAc tampon sur chaque colonne pour chasser en bas de la sulfatase. Couvrir les colonnes avec du papier d&#39;aluminium et laisser reposer toute la nuit. Remarque: En raison de l&#39;activité de la sulfatase, le groupe sulfate sera retiré, libérant les desulfoglucosinolates de la colonne afin qu&#39;ils puissent éluer avec de l&#39;eau. Pour une description détaillée, voir Crocoll et al. 19. </li><li> Le lendemain, éluer le desulfoglucosinolates par pipetage 2 x 0,75 ml d&#39;eau ultra-pure sur chaque colonne. Lorsque toutes les colonnes sont à sec, soulevez la grille de la colonne et le retirer des tubes de réaction. <ol><li> Boucher les tubes (assurez-vous qu&#39;il ya des trous dans les bouchons) et les congeler dans l&#39;azote liquide ou dans un congélateur à -80 ° C pendant 30 min. Lyophiliser les échantillons pendant 12-24 h (en fonction du nombre d&#39;échantillons et la capacité du lyophilisateur) pour éliminer toute l&#39;eau. </li></ol></li> &lt;li&gt; Après lyophilisation, re-dissoudre le résidu dans un volume exact (habituellement 1,0 ml) d&#39;eau ultrapure. Transférer les échantillons et les cinq références sinigrine dans des flacons de HPLC marqués. Gardez les échantillons dans un réfrigérateur (4 ° C) pour un maximum de deux semaines ou un congélateur (-20 ° C) pendant jusqu&#39;à un an avant de les analyser par HPLC. </li><li> Laissez le verre colonnes sèchent sous le capot pendant la nuit et les disposer à sec. Récupérer les billes de métal des tubes d&#39;échantillons utilisés dans l&#39;étape 4.5 pour la réutilisation et mettre les tubes dans le bac d&#39;élimination des déchets. </li></ol> 5. Mesures de CLHP des échantillons extraits <ol><li> Séparer les glucosinolates sur une colonne C18 en phase inverse (4,6 x 150 mm, 3 um, 300 Â) avec un gradient d&#39; acétonitrile-eau (voir tableau 1) et un débit de 0,75 ml / min et une température de colonne de 40 ° C . Effectuer la détection et la quantification à 229 nm. </li><li> Mesurer les références sinigrine sur la même colonne mais avec un gradient adaptéméthode pour réduire l&#39; utilisation de solvants (voir le tableau 2). Commencez avec l&#39;injection des cinq références sinigrine, en commençant par la référence à la plus faible concentration. Injecter ensuite les échantillons, y compris une injection de méthanol (blanc) après chaque dixième échantillon à nettoyer la colonne et pour empêcher le report des pics. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Time [min] </td><td> Flow [ml / min] </td><td> % De l&#39;eau </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 0,750 </td><td> 65 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Colonne Température 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tableau 1: gradient d&#39;eau Acétonitrile pour la séparation glucosinolates et analysis sur HPLC en phase inverse. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Time [min] </td><td> Flow [ml / min] </td><td> % De l&#39;eau </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dix </td><td> 0,750 </td><td> 89,3 </td><td> 10.7 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Colonne Température 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tableau 2: Raccourcissement gradient d&#39; acétonitrile dans l&#39;eau , pour la quantification des cinq références sinigrine utilisées pour la quantification des glucosinolates. 6. glucosinolates identification et la quantification <ol><li> Identification <ol><li> Comparer les temps de spectres UV et de rétention des pics dans les échantillons avec succès dans le commercecapables, des références de glucosinolates pures. Voir Figure 2 pour des exemples de spectres UV des différentes classes de glucosinolates. </li><li> Identifier glucosinolates inconnus avec les normes de référence ou LC-MS 18, 19, si possible. </li><li> Identifier glucosinolates inconnus avec la résonance magnétique nucléaire (RMN), si possible. </li><li> Comparer les temps de spectres UV et de rétention des pics avec ceux de la figure 2 et le tableau des références 3, bases de données, ou la littérature. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> La figure 2. Les spectres UV des classes de glucosinolates les plus courantes. Les spectres d&#39;absorption UV (200-350 nm) de six desulfoglucosinolates (GSL), basée sur des solutions en composés de référence disponibles dans le commerce extraites comme décrit ici, représentant les classes structurales les plus courantes. Le nom commun, snom STRUCTURELS (entre parenthèses), et la classe structurale sont donnés. (A) sinigrine (2-propényl GSL), un groupe alcényle; (B) glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinyle; (D) glucobrassicin (indol-3-yl-méthyl GSL) indole; (E) gluconasturtiine (2-phényléthyl GSL), aromatique; (F) sinalbin (4-hydroxybenzyl GSL) aromatique. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="2"><li> Quantification <ol><li> Intégrer l&#39;aire sous les pics des cinq références sinigrine et les échantillons. </li><li> Calculer une courbe d&#39;étalonnage des cinq références sinigrine mesurées en fonction de la zone intégrée. Utilisez l&#39;équation de la droite de régression (voir l&#39;équation 1) pour calculer la quantité interpolée de glucosinolates (voir équation 2).</li><li> Pour calculer la concentration des différents glucosinolates, il faut multiplier la quantité interpolée (x) par le facteur (M) de réponse pour une détection à 229 nm de CE (1990) , 16, Büchner (1987) 15, ou Brown et al. (1993) 17; les facteurs des désulfoglucosinolates plus fréquemment détectés de réponse de consensus sont donnés dans le tableau 3. NOTE: Les facteurs de réponse peuvent varier entre les systèmes-ce qui peut être la raison pour laquelle il existe différentes valeurs données par des références différentes (voir les références 15-17). Néanmoins, les valeurs sont pour la plupart assez proche et dans une gamme similaire avec les classes structurelles. Suite à la convention, régler le facteur de glucosinolates non identifiés de réponse à 1, bien que pour les glucosinolates indoles inconnus avec un spectre UV similaire à celle de glucobrassicin et d&#39; autres glucosinolates indole (Figure 2), il serait souhaitable d&#39;utiliser 0,25 en tant que facteur de réponse pour obtenirune estimation réaliste de la concentration (tableau 3). </li><li> Pour calculer le montant final de glucosinolates (x t) dans l&#39;échantillon, prendre le facteur de dilution (D) et la masse de l&#39; échantillon (w) utilisé pour l&#39;analyse en compte (voir équation 3). <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> (1) <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> (2) <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> (3) y = surface du pic m = pente de la courbe de régression de 5 points de référence c = l&#39;interception de la ligne de régression avec l&#39;axe des y x = quantité de glucosinolates dans l&#39;extrait x t = concentration de glucosinolates dans l&#39;échantillon de plante D = facteur de dilution M = facteur de réponse pour la détection à 229 nm à partir Büchner (1987) ou Brown et al. (1993) w = masse de l&#39;échantillon utilisé pour l&#39;extraction </li></ol></li></ol>

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<li>van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00049-005-0323-7">Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea.</a> Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).</li>
<li>Gols, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1439179106000892">Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions.</a> Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les plus grands avantages de cette méthode établie et largement utilisé est qu&#39;il est robuste, assez simple, et relativement faible coût par échantillon. La plupart de l&#39;équipement nécessaire pour l&#39;extraction et l&#39;analyse devraient être disponibles dans un laboratoire standard ou peut être construit soi-même, à l&#39;exception de l&#39;HPLC-PDA. Un autre avantage est que desulfoglucosinolates dissous dans l&#39;eau sont chimiquement très stables lorsqu&#39;ils sont conservés au frais et (HPLC) des flacons étanches à l&#39;air, de sorte que les extraits peuvent être facilement transportés pour l&#39;analyse HPLC ailleurs. Contrairement aux plates-formes LC-MS, qui nécessitent une formation et une expérience pratique de la gestion du logiciel et de l&#39;analyse des données spécialisées, HPLC-UV / PDA peuvent être facilement exécutés après une courte période de formation. Cela réduit non seulement les coûts de la procédure, mais rend également cette méthode plus accessible à un large éventail de scientifiques, y compris les étudiants. En règle générale, lorsque les procédures décrites ci-dessus sont suivies savoully, quelques problèmes se produisent. En général, les pics de glucosinolates sont très bien séparées dans le chromatogramme. Si cela est le cas, le programme de gradient peut être adapté en diminuant le taux d&#39;augmentation de l&#39;acétonitrile dans l&#39;éluant. Sinon, la construction d&#39;une nouvelle pré-colonne (200-500 injections) ou une colonne (1500 -2000 injections) peut résoudre le problème. De temps en temps, chromatogrammes des échantillons individuels dans un lot peuvent montrer très petit ou pas de pics. Ceci est généralement dû à des erreurs de pipetage lors de l&#39; ajout de la sulfatase (par exemple, une colonne a été sautée ou sulfatase n&#39;a pas été correctement arrosé dans la colonne). En variante, la concentration en glucosinolates dans les matériaux expérimentaux peuvent avoir été plus faible que prévu, et trop peu de matière a été utilisée pour l&#39;extraction. Si celui - ci est le cas, le volume d&#39;injection peut être augmentée jusqu&#39;à 100 pi, ou une aliquote exacte (par exemple 800 pi) de l&#39;extrait peut être concentré. Celle-ci peut être obtenue par lyophilisationtion de l&#39;extrait, en dissolvant le résidu dans un petit volume (par exemple 100 pi) de l&#39; eau, et réinjectant en utilisant la même courbe de référence. Dans les calculs de la concentration initiale de l&#39;extrait, les chiffres doivent être multipliés par le facteur de dilution. Si cela ne résout pas le problème, les matériaux doivent être extraits à nouveau en utilisant plus de matériau de départ. Si tel est supérieure à 100 mg, le volume des solvants d&#39;extraction et la taille des tubes doit être ajustée proportionnellement pour maintenir l&#39;efficacité de l&#39;extraction. Un avantage supplémentaire est que ce procédé a été bien validé. En effet , il a été décrit comme une méthode standard pour la quantification des glucosinolates dans le colza, pour lesquels les procédures et la précision ont été confirmées dans plusieurs laboratoires 16. En outre, l&#39;arrière-plan génétique, la biosynthèse et les fonctions biologiques des glucosinolates font l&#39;objet d&#39;intenses efforts de recherche dans le model espèces de plantes Arabidopsis thaliana entre autres , 4, 6, 12. Par conséquent, de nombreux facteurs de réponse pour la quantification exacte de desulfoglucosinolates par rapport à sinigrine sont bien définis et accessibles au public 15,17. Même si les protocoles basés sur LS-MS sont plus à haut débit, plus sensibles, et sont capables de (provisoirement) identifier les glucosinolates pour lesquels aucune norme sont disponibles 18, 19, 20, l&#39;absence de facteurs de réponse universelle pour LC-MS limite la quantification exacte des concentrations de glucosinolates 18. En outre, ces procédés ne comprennent habituellement pas d&#39;étape de lyophilisation, et la quantité d&#39;eau dans la matière végétale fraîche non comptabilisée dans les calculs, ce qui rend difficile la quantification exacte. Enfin, parce que notre méthode d&#39;extraction implique une base de colonnela purification et l&#39; étape de concentration, il peut également être appliquée à des échantillons &quot;sales&quot; avec de faibles concentrations de glucosinolates, tels que les sols 21. Par rapport aux méthodes basées sur la LC-MS qui extraient habituellement fraîchement matériaux congelés, utilisent des plaques à 96 puits pour l&#39; extraction, et ne comprennent pas une étape de sulfatase 18, 19, notre méthode est relativement longue et le travail intense. Avec les supports de colonne décrits dans le présent document, une seule personne peut extraire environ 100-150 échantillons en une seule journée. Elution (lendemain), lyophilisation (la nuit), et re-dissolution peut avoir lieu dans les deux jours suivants. Avec un injecteur automatique de HPLC, un temps de 40-45 minutes par injection terme et équilibration, et aucun événement imprévu, il faudrait 3-4 jours pour acquérir les données de cet ensemble d&#39;échantillons. Lorsque le logiciel de HPLC permet la quantification automatique basée sur la courbe sinigrine, une vérification manuelle des chromatogrammes et pemissions ak pour 100 échantillons ne peuvent prendre une autre 1 ou 2 h avant que les données peuvent être utilisées pour des analyses statistiques. Malgré la disponibilité croissante des normes de glucosinolates, seule une petite fraction des plus de 130 candidats peut actuellement être acheté dans le commerce. Cependant, avec quelques références supplémentaires pour chacune des classes biosynthétiques; l&#39; accès aux bases de données bibliographiques spécifiant les composés précédemment trouvé dans les espèces végétales (par exemple, Fahey et al 22.); connaissances de base des principes chromatographiques, tels que la logique de la série éluotropique (par exemple, pour un nombre croissant de Cs sur la chaîne latérale en les composés aliphatiques, les figures 3 et 4); et la validation des échantillons individuels sur LC-MS 19 ou glucosinolates isolés sur RMN 23, on peut facilement surmonter cette limitation. La plupart des protocoles pour glucosinolates analyses utiliser des courbes de référence internes( Par exemple, une certaine concentration pour l&#39;extraction de la sinigrine ou sinalbin à l&#39;extraction par solvant 16, 17, 19). Principalement, les courbes de référence internes sont plus appropriées pour corriger les erreurs individuelles de traitement des échantillons et donc théoriquement obtenir une plus grande précision. Malgré cet avantage, nous préférons utiliser une courbe de référence externe en cinq points, comme nous analysons souvent différentes espèces sauvages, dont certains contiennent des niveaux élevés de sinigrine (par exemple, Brassica nigra 24) ou sinalbin (par exemple, Sinapis alba 25), le deux références glucosinolates pour lesquelles les facteurs de réponse sont disponibles. En outre, l&#39;ajout de normes internes à chacun des échantillons augmente le coût des analyses, en tant que normes de référence en glucosinolates de haute qualité sont en général assez coûteux. En conclusion, malgré les étapes qui prennent du temps, ce protocolefournit une méthode simple et accessible à extraire et à quantifier les glucosinolates dans des échantillons de plantes. Cependant, il est important de considérer que la teneur en glucosinolates eux - mêmes ne sont qu&#39;une indication de l&#39;activité biologique potentielle, vu que la nécessité de réagir avec la myrosinase, et les variations dans les produits de la réaction peuvent provenir d&#39;une seule glucosinolates 11. des essais de validation doivent être effectués pour confirmer la pertinence biologique.

On estime que les plantes produisent plus de 200 000 différents types de composés chimiques 1. Seule la minorité de ces composés semble jouer un rôle dans le métabolisme primaire des plantes, ce qui alimente la croissance et la reproduction; la majorité sont dits métabolites secondaires. Malgré leur nom, les métabolites secondaires sont souvent critiques pour la survie des plantes et de la reproduction, car ils servent à attirer les pollinisateurs ou pour défendre la plante contre les agents pathogènes et les herbivores 1. Les glucosinolates sont une classe très variée de métabolites secondaires qui ont été étudiés depuis plus de 150 ans 2. À ce jour, plus de 130 glucosinolates structurellement différents ont été identifiés 3. De manière générale, les glucosinolates peuvent être divisés en différentes classes en fonction de l&#39;acide aminé à partir duquel ils sont synthétisés. glucosinolates indoliques, par exemple, sont synthétisés à partir de l&#39;acide aminéle tryptophane, la phénylalanine alors que fournit le squelette de base pour la synthèse de glucosinolates de 4 aromatiques. À l&#39;intérieur des classes, il existe une grande diversité structurelle, qui est provoquée par séquentielles étapes d&#39;allongement de chaîne dans les voies biosynthétiques, tels que la classe de glucosinolates aliphatiques, ou par des modifications de chaînes latérales (par exemple, hydroxylation) 4, 5. Une espèce végétale glucosinolates peuvent contenir jusqu&#39;à 37 glucosinolates différents appartenant à différentes classes structurales 6. Même si les espèces végétales ont des profils typiques de glucosinolates, variation intraspécifique pour les types de glucosinolates est fréquente chez les individus et les populations 6, 7. Glucosinolates intacts sont stockés dans les vacuoles des cellules végétales et peuvent être trouvés dans tout organe ou hors sol hypogée 7, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. Lors de la rupture des cellules (par exemple, par herbivorie), glucosinolates sont libérés et sont mélangés avec l&#39;enzyme myrosinase, déclenchant une bombe à l&#39; huile de moutarde 10. En raison de l&#39;activité de la myrosinase, et en fonction de la structure du glucosinolate, les conditions de réaction, et la présence d&#39;enzymes de modification, les différents composés âcres, toxiques ou nocives sont formés, tels que les nitriles et les (iso) 11 isothiocyanates. Les produits de réaction ont des activités biologiques élevées; par exemple, ils servent de répulsifs d&#39;insectes herbivores généralistes 12. Les héritabilité et biosynthétiques voies de glucosinolates sont bien étudiés, principalement en raison de leur importance pour herbivore et la résistance aux pathogènes, leur valeur en tant que composants de saveur dans les moutardes et les choux, et le négatif (progoitrine) et (glucoraphanin) les effets sur la santé humaine 5 positifs, </sup&gt; 13, 14. En raison du grand intérêt pour les glucosinolates en tant que composés, des procédés d&#39;extraction et de détection biologiquement actifs à base de Chromatographie en phase liquide à haute pression en phase inversée (HPLC) munie d&#39;ultraviolets (UV) ou un réseau de photodiodes (PDA) détecteurs ont été couramment utilisés depuis les années 1980 15 . Sur la base de cette méthode, les Communautés européennes ont publié un protocole standard qui a été testé et validé dans plusieurs laboratoires pour l&#39;analyse des glucosinolates dans les graines oléagineuses (Brassica napus, colza, canola 16). D&#39; autres ont ajouté à cette méthode (par exemple, en déterminant les facteurs de réponse supplémentaires pour les glucosinolates qui ne sont pas présents dans le colza) 17. Malgré la disponibilité croissante de liquide spectrométrie de chromatographie de masse (LC-MS) des plates - formes et de protocoles à haut débit pour l&#39; analyse de glucosinolates 18 <sup&gt;, 19, la méthode HPLC-UV / PDA d&#39; origine est encore largement utilisé par les scientifiques. Les principales raisons sont que cette méthode est simple, rentable et relativement accessible aux laboratoires sans une vaste infrastructure de connaissances en chimie analytique. Pour servir cette communauté, nous voici en détail le protocole pour l&#39;extraction de glucosinolates à partir de matières végétales et l&#39;analyse de leurs desulfo-formes par HPLC-PDA.

<table><tbody><tr><td>Méthanol HiPerSolv CHROMANORM&reg ; grade gradient pour grade HPLC</td><td>VWR</td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl VWR</td><td></td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>(&minus ;)-Hydrate de sinigrin de raifort&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Aryl Sulfatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>Laine de verre</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>Bâtonnet verre/bois</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>2 mL tubes de réaction</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de dissection</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de laboratoire Rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>Bac à déchets</td></tr><tr><td>Clips d’étanchéité Rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisateur Freezone 12 L</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitril super gradient</td><td>grade VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>Bain à ultrasons</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>Électrode PH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2115</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Pré-colonne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>Colonne C18 (4,6 x 10 mm, 5 & micro ; m, 300 &Aring ;)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Colonne Acclaim 300</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>C18 colonne (4,6 x 150 mm, 3 & micro ; m, 300 &Aring ;)&nbsp ;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>avec four à colonne et détecteur UV ou PDA</td></tr><tr><td>Flacon 1 000 mL</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>Composés de référence glucosinolates</td><td>Phytoplan</td><td>divers</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

une méthode simple pour l&#39;extraction et l&#39;analyse glucosinolates avec haute pression chromatographie liquide (hplc)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

<classe p='jove_content'>Les glucosinolates sont une classe bien étudiée et très diversifiée de composés végétaux naturels. Ils jouent un rôle important dans la résistance des plantes, la qualité de l’huile de colza, les arômes alimentaires et la santé humaine. L’activité biologique des glucosinolates est libérée lors de lésions tissulaires, lorsqu’ils sont mélangés à l’enzyme myrosinase. Cela entraîne la formation de produits de dégradation piquants et toxiques, tels que les isothiocyanates et les nitriles. À l’heure actuelle, plus de 130 glucosinolates de structure différente ont été identifiés. La structure chimique du glucosinolate est un déterminant important du produit qui se forme, qui à son tour détermine son activité biologique. Ces derniers peuvent être préjudiciables (par exemple, la progoitrine) ou bénéfiques (par exemple, la glucoraphanine). Chaque espèce végétale contenant des glucosinolates a son propre profil glucosinolate. Pour cette raison, il est important d’identifier correctement et de quantifier de manière fiable les différents glucosinolates présents dans les feuilles, les graines et les plantes-racines des brassicacées ou, pour les études écologiques, dans leurs parents sauvages. Ici, nous présentons une méthode bien validée, ciblée et robuste pour analyser les profils de glucosinolates dans un large éventail d’espèces et d’organes végétaux. Les glucosinolates intacts sont extraits de matières végétales broyées avec un mélange de méthanol et d’eau à haute température pour désactiver l’activité de la myrosinase. Ensuite, l’extrait obtenu est amené sur une colonne d’échange d’ions pour la purification. Après le traitement à la sulfatase, les désulfoglucosinolates sont élués avec de l’eau et l’éluat est lyophilisé. Le résidu est absorbé dans un volume exact d’eau, qui est analysé par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) avec un réseau de photodiodes (PDA) ou un détecteur ultraviolet (UV). La détection et la quantification sont réalisées en comparant les temps de rétention et les spectres UV des étalons de référence commerciaux. Les concentrations sont calculées sur la base d’une courbe de référence sinigrine et de facteurs de réponse bien établis. Les avantages et les inconvénients de cette méthode simple, par rapport aux méthodes plus rapides et plus avancées sur le plan technologique, sont discutés ici.

Cette méthode permet la détection et la séparation des desulfoglucosinolates on trouve couramment dans toutes les classes structurales (figure 3). Le préjudiciable 2-hydroxyglucosinolate progoitrine vient relativement tôt dans le chromatogramme et est clairement séparée de la glucoraphanin glucosinolates bénéfique, la seule methylsulfinylglucosinolate dans cet échantillon. Sinigrine, gluconapin et glucobrassicanapin forment une série de glucosinolates éluotropique alcényle avec une longueur croissante de la chaîne latérale (C3, C4 et C5, respectivement). Une série logique similaire est visible pour les deux glucosinolates methylthioalkenyl, glucoiberverin (C3) et glucoerucin (C4). Les sommets des trois glucosinolates indoles, glucobrassicin et ses dérivés 4-hydroxy et 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), sont également clairement séparés. Il convient de noter que les pics de neoglucobrassicin et glucoerucin, ainsi que gluconasturtiine, le seul gluco aromatiquesinolate dans cet échantillon, sont particulièrement élevés dans cet extrait de Brassica en raison de l&#39;ajout d&#39;extraits de racines au mélange 9. <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> Figure 3: Chromatogramme d&#39;un extrait de glucosinolates. Détail (1-32 min) d&#39;un chromatogramme HPLC résultant de l&#39;analyse des racines et des pousses échantillons combinés de Brassica nigra, B. rapa et B. oleracea. Les étiquettes de pic indiquent le temps de rétention et les abréviations desulfoglucosinolates identifiés (GSL). PRO = progoitrine (2-OH-3-butényl GSL); RAPH = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrine (2-propényl GSL), GNA = gluconapin (3-butényl GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-méthylthiopropyle GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentényle GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC glucobrassicin = (indol-3-yl-méthyl GSL); NAS = gluconasturtiine (2-phényléthyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Plus longs glucosinolates méthylsulfinyle de la chaîne, qui sont généralement trouvés dans la plante modèle Arabidopsis, montrent également une série éluotropique, comme on le voit dans un extrait de racine de Rorippa austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8) et glucoarabin (C9) apparaissent à intervalles réguliers sur le chromatogramme (figure 4). Ensemble avec les spectres UV des pics, une telle série logique éluotropique peut être utilisée pour classer, et provisoirement identifier, glucosinolates inconnus. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> Figure 4: Chromatogramme (frame 9-30 min) Des desulfoglucosinolates dans un extrait austriaca racine Rorippa. Les étiquettes de pic indiquent le temps de rétention et les abréviations desulfoglucosinolates identifiés (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC glucobrassicin = (indol-3-yl-méthyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nom commun </td><td> Structure de chaîne latérale </td><td> Rt (min) * </td><td> 229 nm </td><td> référence# </td></tr><tr><td> aliphatic glucosinolates </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> glucocapparine </td><td> méthyle </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> marron </td></tr><tr><td> sinigrine </td><td> 2-propényl </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> Brown, CE </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3-butényle </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4-pentényle </td><td> 13.5 </td><td> 1.15 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3-méthylthiopropyle </td><td> 10.9 </td><td> 0,8 </td><td> marron </td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4-methylthiobutyl </td><td> 14,0 </td><td> 0,9 </td><td> marron </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3-méthylsulfinylpropyle </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> marron </td></tr><tr><td> glucoraphanine </td><td> 4-méthylsulfinylbutyle </td><td> 4.9 </td><td> 0,9 </td><td> marron </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5 methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0,9 </td><td> marron </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6-methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> marron </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7-methylsulfinylheptyl </td><td> 13.5 </td><td> 1 </td><td> marron </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8-methylsulfinyloctyl </td><td> 16,8 </td><td> 1.1 </td><td> marron </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9-methylsulfinylnonyl </td><td> 20.5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3-methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0,9 </td><td> marron </td></tr><tr><td> progoitrine </td><td> 2 (R) -OH-3-butényl </td><td> 4.5 </td><td> 1.09 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH-5-pentényle </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> CE </td&gt; </tr><tr><td> glucosinolates indoles </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4-hydroxyglucobrassicin </td><td> 4-hydroxyindole-3-ylméthyl </td><td> 11.2 </td><td> 0,28 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> glucobrassicin </td><td> indol-3-ylméthyl </td><td> 15.3 </td><td> 0,29 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> 4-Methoxyglucobrassicin </td><td> 4-méthoxy indol-3-ylméthyl </td><td> 18.2 </td><td> 0,25 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1-méthoxy indol-3-ylméthyl </td><td> 22.5 </td><td> 0,2 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> glucosinolates aromatiques </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinalbin </td><td> 4-hydroxybenzyle </td><td> 8.1 </td><td> 0,5 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH-2-phényléthyl </td><td> 12.1 </td><td&gt; 0,95 </td><td> voir la prochaine </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH-2-phényléthyl </td><td> 12.7 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> glucotropaeoline </td><td> benzyle </td><td> 13.8 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> gluconasturtiine </td><td> 2-phényléthyl </td><td> 18,0 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> inconnu - aliphatique / aromatique comme spectre UV </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> CE </td></tr><tr><td> inconnu - indole comme spectre </td><td></td><td></td><td> 0,25 </td><td> CE </td></tr><tr><td colspan="5"> * Approximative temps de rétention (Rt) arrondi au plus proche 0,1 min (± 0,3 min en fonction de la colonne, la qualité de l&#39;éluant). Les temps de rétention sont déterminés sur les plates - formes ThermoFisher / Dionex ultime CLHP équipée d&#39;une colonne C 18 (150 x 4,6 mm, la taille des particules de 3 micromètres) plus C 18 </sub&gt; pré - colonne (10 x 4,6 mm, taille de particule 5 micromètres) avec un programme de gradient comme dans le tableau 1. </td></tr><tr><td colspan="5"> # Références pour les facteurs de réponse: Buchner, R. dans glucosinolates dans le colza (ed JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. &amp; Gershenzon, J. Variation de l&#39;accumulation glucosinolates entre les différents organes et les stades de développement d&#39;Arabidopsis thaliana. Phytochimie. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6, (2003); CE. Graines oléagineuses - Détermination de glucosinolates chromatographie liquide haute performance. Journal officiel des Communautés européennes. L 170/28. Annexe VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> Tableau 3: Facteurs de réponse le plus couramment trouvés desulfo-glucosinolates dans des extraits de plantes et leurs temps de rétention approximatifs sur C 18 colonnes. Eluants, gradient, la température de la colonne et du débit comme dans le tableau 1.

Ici, nous décrivons en détail un protocole établi et robuste pour l’extraction des glucosinolates à partir de matières végétales broyées. Après un traitement à la sulfatase sur colonne des extraits, les désulfoglucosinolates sont élués et analysés par chromatographie liquide à haute pression.

Une méthode simple pour l&#39;extraction et l&#39;analyse glucosinolates avec haute pression chromatographie liquide (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

L'objectif général de ce protocole est de réaliser une analyse simple et directe des glucosinolates présents dans les plantes et d'autres échantillons biologiques. Cette méthode, permettant d'extraire et d'analyser les glucosinolates, peut être utilisée pour répondre à des questions essentielles en écologie plante-insecte, en phytopathologie, en amélioration des plantes et en sciences des aliments. Le principal avantage de cette technique réside dans sa bonne validation et son applicabilité étendue à un large éventail d'échantillons biologiques.Bien que cette méthode soit principalement utilisée pour quantifier les glucosinolates dans les matériaux végétaux, elle peut également être appliquée aux sols ou aux aliments préparés. Cette procédure d'extraction peut être réalisée dans presque tous les laboratoires, car elle utilise principalement du matériel de laboratoire standard. En général, les personnes novices dans cette méthode effectueront les analyses et les inspections plus efficacement lorsqu'elles auront lu et observé la vidéo au moins une fois.Pour commencer la procédure, mélanger 10 grammes de gel de dextrine réticulée G-25 avec 125 millilitres d'eau ultra-pure. Conserver le mélange dans un flacon bouché à 4 degrés Celsius. Ensuite, dissoudre 10 000 unités d'arylsulfatase de type H-1 dans 30 millilitres d'eau ultra-pure.Ajouter à cela 30 millilitres d'éthanol absolu et bien mélanger le mélange. Centrifuger le mélange à 2 650 ×g pendant 20 minutes à température ambiante. Combiner le surnageant avec 90 millilitres d'éthanol absolu dans un bécher.Mélanger et verser dans de nouvelles tubes de centrifugation. Centrifuger le mélange à 1 030 × g pendant 15 minutes à température ambiante. Éliminer le surnageant.Dissoudre et combiner les pastilles dans un volume total de 25 millilitres d'eau ultra-pure. Agiter soigneusement le mélange par vortex, puis transférer le mélange dans des tubes de 1 millilitre. Conserver les échantillons de sulfatate à 20 degrés Celsius pendant une durée maximale d'un an.Ensuite, peser environ 90 milligrammes de sinogramme et noter la masse avec une précision de 1 microgramme. Puis, dissoudre le sinogramme monohydraté dans 10 millilitres d'eau ultrapure. Préparer à partir de cette solution mère de sinogramme cinq solutions étalons dont les concentrations varient de 50 à 750 micromolaires.Conserver les solutions de référence dans des tubes de 1,5 millilitre à 20 degrés Celsius. Ensuite, pour chaque échantillon et chaque référence, étiqueter un tube de microcentrifugeuse de 2 millilitres dans une position de rack en colonne. Percer le bouchon de chaque tube de microcentrifugeuse avec une aiguille de dissection en vue de la lyophilisation ultérieure.Placer les tubes étiquetés dans un bloc selon la même configuration et le même espacement que les colonnes étiquetées. Pour préparer les colonnes de pipettes en verre, utiliser une tige en bois ou en verre pour insérer délicatement un morceau de ouate de verre de 1 centimètre sur 1 centimètre dans la pipette. Tasser la ouate de verre au niveau de la jonction entre le corps de la pipette et son embout.Placer une colonne de pipette dans chaque position étiquetée sur le support. Positionner le support au-dessus d'un bac de déchets. Couper l'extrémité d'une pipette en plastique de 1 millilitre.Agiter soigneusement le gel de dextrine préparé. Ensuite, utiliser une pipette à embout élargi pour charger 0,5 millilitre de gel de dextrine préparé dans chaque colonne. Vérifier les fuites de gel de dextrine au niveau des colonnes et remplacer les colonnes présentant des fuites.Une fois que toutes les colonnes ont été chargées avec du gel de dextrine, rincer chaque colonne avec 1 millilitre d’eau ultrapure. Peser entre 50 et 100 milligrammes de matériau végétal finement broyé, libre de tout déplacement, dans un tube réaction de 2 millilitres avec bouchon de sécurité, et noter la masse avec une précision de 0,1 milligramme. Placer deux sphères métalliques de 3 millimètres de diamètre dans chaque tube.Ajouter à chaque tube 1 millilitre de méthanol à 70 % dans de l'eau ultrapure, puis vortexer brièvement chaque mélange. Fermer les tubes avec des bouchons de sécurité supplémentaires, puis les placer immédiatement dans un bain-marie à une température de 90 à 92 degrés Celsius. Chauffer les tubes jusqu'à ce que le contenu commence à bouillir.Transférez les tubes dans un bain ultrasonique et soumettez les échantillons à une chaleur par ultrasons pendant 15 minutes. Pendant la sonication, commencez à décongeler l'échantillon de sulfatate et les références de sinogramme. Après la sonication, centrifugez les échantillons à 2 700 × g pendant 10 minutes à température ambiante.Chargez les surnageants et les références de sinogramme décongelées dans les colonnes correspondantes, en prenant soin de ne pas aspirer de matière végétale dans la pipette. Ajoutez 1 millilitre de méthanol à 70 % dans chaque tube. Vortexez les mélanges.Puis chauffer les mélanges par ultrasons pendant 15 minutes. Centrifuger à nouveau les tubes dans les mêmes conditions qu'auparavant. Déposer les surnageants sur les colonnes correspondantes.Ajouter deux portions de 1 millilitre de méthanol à 70 % sur chaque colonne, en laissant s’écouler complètement chaque portion avant l’ajout suivant. Éliminer le méthanol résiduel de chaque colonne à l’aide de 1 millilitre d’eau ultrapure. Puis, laver chaque colonne avec deux portions de 1 millilitre de tampon d’acétate de sodium à 20 millimolaire, pH 5,5.Une fois que les dernières portions de tampon acétate de sodium ont été évacuées vers le plateau de rebut, retirez le plateau du bac de récupération et séchez les pieds du plateau avec du papier absorbant. Placez le plateau au-dessus du bloc de tubes microcentrifuges étiquetés, de sorte que les extrémités des colonnes se trouvent au-dessus des tubes correspondants. Ajoutez 20 microlitres de solution de sulfatate sur chaque colonne, en veillant à ce que la solution atteigne la surface du matériau de la colonne.Éluez la solution de sulfatate dans le matériau de colonne à l’aide de 50 microlitres de tampon d’acétate de sodium. Il est très important que le sulfatate soit entraîné dans la colonne. L’enzyme doit se trouver sur la colonne pour réagir avec les glucosinolates intacts liés à celle-ci.Une fois la solution de sulfatate transférée par lavage dans chaque colonne, recouvrez les colonnes de papier d'aluminium. Laissez les colonnes en repos toute la nuit. Ensuite, éluerez les désulfo-glucosinolates de chaque colonne à l'aide de deux portions de 0,75 millilitre d'eau ultrapure.Une fois que les colonnes sont complètement épuisées, retirez le support de colonnes et bouchonnez chaque tube. Congelez les tubes dans de l'azote liquide ou à -80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Lyophilisez les échantillons de 12 à 24 heures.Dissoudre chaque résidu dans 1 millilitre d'eau ultra-pure. Ensuite, transférer chaque échantillon et témoin dans des vials d'HPLC étiquetés. Séparer les extraits sur une colonne CAT en phase inverse.Utilisez une longueur d'onde de détection de 229 nanomètres. Une fois séparées par HPLC, les glucosinolates peuvent être identifiées par comparaison des temps de rétention et des spectres UV avec des étalons connus de glucosinolates. Les concentrations de glucosinolates dans l'échantillon sont calculées à partir d'une courbe d'étalonnage sinogramme et des valeurs de la littérature pour les facteurs de réponse.À partir de cela, on peut déterminer les concentrations de glucosinolates dans l'échantillon végétal d'origine. Dans les conditions de CPG utilisées, le progoitrin nocif élué assez tôt et est séparé du glucoraphanin bénéfique sur le plan biologique. Les endo-glucosinolates sont également bien séparés.Des séries lyotropes sont observées avec l'augmentation du nombre de chaînes latérales pour l'alconol, le méthylfol-alconol et les glucosinolates méthyl-solfinol à chaîne plus longue. Les glucosinolates inconnus peuvent donc être classés de manière préliminaire selon ces séries lyotropes, combinées aux spectres UV. Avec une préparation adéquate, une personne peut extraire de 150 à 200 échantillons en une journée de travail.Il faudra encore une journée pour faire référence aux colonnes lyophilisant les échantillons, et les préparer pour la CPG. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la CLSV, peuvent être appliquées pour identifier les desulfo-glucosinolates inconnus dans votre chromatogramme. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'extraire les glucosinolates à partir de vos échantillons biologiques et de les analyser par CPG.N'oubliez pas que le travail avec le méthanol peut être extrêmement dangereux et doit toujours être effectué sous la hotte de ventilation.

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