Une méthode simple pour l'extraction et l'analyse glucosinolates avec haute pression chromatographie liquide (HPLC)

L’objectif général de ce protocole est d’effectuer une analyse simple et directe des glucosinolates dans les plantes et autres échantillons biologiques. Cette méthode, qui permet d’extraire et d’analyser les glucosinolates, peut être utilisée pour répondre à des questions clés en écologie des plantes et des insectes, en phytopathologie, en sélection végétale et en sciences alimentaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est bien validée et largement applicable à un large éventail d’échantillons biologiques.

Bien que cette méthode soit principalement utilisée pour quantifier les glucosinolates dans les matières végétales, elle peut également être appliquée aux sols ou aux aliments préparés. Cette procédure d’extraction peut être effectuée dans presque tous les laboratoires, car vous utilisez principalement des équipements de laboratoire standard. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode effectueront mieux les analyses et l’inspection lorsqu’elles liront et observeront le film au moins une fois.

Pour commencer la procédure, mélangez 10 grammes de gel de dextrine réticulée G-25 avec 125 millilitres d’eau ultra-pure. Conservez le mélange dans une bouteille bouchée à 4 degrés Celsius. Ensuite, dissolvez 10 000 unités d’arylsulfatase de type H-1 dans 30 millilitres d’eau ultra-pure.

Ajoutez à cela 30 millilitres d’éthanol absolu et mélangez bien. Centrifugez le mélange à 2, 650 fois G pendant 20 minutes à température ambiante. Combinez le surnageant avec 90 millilitres d’éthanol absolu dans un bécher.

Mélangez et versez dans de nouveaux tubes à centrifuger. Centrifugez le mélange à 1 030 fois G pendant 15 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant.

Dissoudre et combiner les granulés dans un total de 25 millilitres d’eau ultra-pure. Mélangez bien le mélange, puis transférez-le dans des tubes de 1 millilitre. Conservez les échantillons de sulfatate à 20 degrés Celsius pendant une période pouvant aller jusqu’à un an.

Ensuite, pesez environ 90 milligrammes de sinogramme et enregistrez le poids avec une précision de 1 microgramme. Ensuite, dissolvez le sinogramme monohydrate dans 10 millilitres d’eau ultra-pure. Préparez à partir de cette solution mère de sinogramme cinq solutions de référence avec des concentrations allant de 50 à 750 micromolaires.

Conservez les solutions de référence dans des tubes de 1,5 millilitre à 20 degrés Celsius. Ensuite, pour chaque échantillon et référence, étiquetez un tube de microcentrifugation de 2 millilitres en position de rack de colonne. Percez chaque capuchon de tube de microcentrifugation avec une aiguille de dissection pour une lyophilisation ultérieure.

Placez les tubes étiquetés dans un bloc dans la même configuration et le même espacement que les colonnes étiquetées. Pour préparer les colonnes de pipette en verre, utilisez une tige en bois ou en verre pour enfoncer doucement un morceau de laine de verre de 1 centimètre sur 1 centimètre dans la pipette. Tassez la laine de verre à la transition entre le corps de la pipette et la tige.

Placez une colonne de pipette dans chaque position étiquetée sur le rack. Placez le support au-dessus d’un bac à déchets. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette en plastique de 1 millilitre.

Agitez bien le gel de dextrine préparé. Ensuite, utilisez la pointe de pipette élargie pour charger 0,5 millilitre de gel de dextrine préparé dans chaque colonne. Vérifiez que les colonnes ne fuient pas de gel de dextrine et remplacez les colonnes qui fuient.

Une fois que toutes les colonnes ont été chargées de gel de dextrine, lavez chaque colonne avec 1 millilitre d’eau ultrapure. Pesez entre 50 et 100 milligrammes de matière végétale finement broyée dans un tube de réaction de 2 millilitres avec capuchon de sécurité, et notez le poids avec une précision de 0,1 milligramme. Placez deux sphères métalliques de 3 millimètres de diamètre dans chaque tube.

Ajouter à chaque tube 1 millilitre de méthanol à 70 % dans de l’eau ultra-pure, et agiter brièvement chaque mélange. Fermez les tubes avec des capuchons de sécurité supplémentaires et placez-les immédiatement dans un bain-marie de 90 à 92 degrés Celsius. Faites chauffer les tubes jusqu’à ce que la scie commence à bouillir.

Transférez les tubes dans un bain à ultrasons et chauffez les échantillons pendant 15 minutes. Pendant la sonication, commencez à décongeler l’échantillon de sulfatate et les références du sinogramme. Après sonication, centrifuger les échantillons à 2 700 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.

Chargez les surnageants et les références de sinogrammes décongelés sur les colonnes correspondantes, en prenant soin de ne pas aspirer de matière végétale dans la pipette. Ajouter 1 millilitre de méthanol à 70 % dans chaque tube. Vortex les mélanges.

Et les ultrasons chauffent les mélanges pendant 15 minutes. Centrifugez à nouveau les tubes dans les mêmes conditions que précédemment. Chargez les surnageants sur les colonnes correspondantes.

Ajoutez deux portions de 1 millilitre de méthanol à 70 % dans chaque colonne, en laissant les colonnes fonctionner à sec entre chaque portion. Lavez le méthanol résiduel de chaque colonne avec 1 millilitre d’eau ultrapure. Ensuite, lavez chaque colonne avec deux portions de 1 millilitre de tampon d’acétate de sodium de 20 millimolaires, pH 5,5.

Une fois que les dernières portions de tampon d’acétate de sodium se sont écoulées dans le support à déchets, retirez le support du bac à déchets et séchez les pieds du support avec un mouchoir en papier. Positionnez le rack sur le bloc de tubes de microcentrifugation étiquetés, de sorte que les pointes de la colonne soient dans les tubes correspondants. Chargez 20 microlitres de solution de sulfatate sur chaque colonne, en veillant à ce que la solution atteigne la surface du matériau de la colonne.

Rincer la solution de sulfatate dans le matériau de la colonne avec 50 microlitres de tampon d’acétate de sodium. Il est très important que le sulfatate soit lavé dans la colonne. L’enzyme doit se trouver sur la colonne pour réagir aux glucosinolates intacts liés à la colonne.

Une fois que la solution de sulfatate a été lavée sur chaque colonne, couvrez les colonnes de papier d’aluminium. Laissez les colonnes reposer toute la nuit. Ensuite, faites allusion aux de-sulfo-glucosinolates de chaque colonne avec deux portions de 0,75 millilitre d’eau ultrapure.

Une fois que les colonnes sont sèches, retirez le support de colonne et bouchez chaque tube. Congelez les tubes dans de l’azote liquide, ou à 80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Lyophiliser les échantillons pendant 12 à 24 heures.

Dissoudre chaque résidu dans 1 millilitre d’eau ultra-pure. Ensuite, transférez chaque échantillon et chaque référence dans des flacons d’échantillons HPLC étiquetés. Séparez les extraits sur une colonne CAT en phase inverse

Utilisez une longueur d’onde de détection de 229 nanomètres. Une fois séparés par HPLC, les glucosinolates peuvent être identifiés en comparant les temps de rétention et les spectres UV avec des étalons de glucosinolates connus. Les concentrations de glucosinolates dans l’échantillon sont calculées à partir d’une courbe d’étalonnage de sinogramme et des valeurs publiées pour les facteurs de réponse.

À partir de là, les concentrations de glucosinolates dans l’échantillon de plante d’origine peuvent être déterminées. Dans les conditions HPLC utilisées, la progoitrine malsaine fait allusion assez tôt et est séparée de la glucoraphanine biologiquement bénéfique. Les endoglucosinolates sont également bien séparés.

Des séries lyotropiques sont observées avec une augmentation des maillons de la chaîne latérale pour l’alconol, le méthylfol-alconol et les glucosinols de méthyl-solfinol à chaîne plus longue. Des glucosinolates inconnus peuvent donc être provisoirement classés sur la base de ces séries lyotropes en combinaison avec des spectres UV. Avec une bonne préparation, 150 à 200 échantillons peuvent être extraits par une seule personne en une journée de travail.

Il faudra un autre jour pour faire allusion aux colonnes, lyophiliser les échantillons et les préparer pour la HPLC. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que le LCMS, peuvent être appliquées pour identifier les désulfo-glucosinolates inconnus dans votre chromatogramme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire les glucosinolates de vos échantillons biologiques et de les analyser via HPLC.

N’oubliez pas que travailler avec du méthanol peut être extrêmement dangereux et doit toujours être effectué sous la hotte.