Name: Induction de la mère Immune Activation chez la souris à mi-gestation scène avec Viral Mimic Poly (I: C) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Apprenez à induire l'activation immunitaire maternelle chez la souris en utilisant le mimétique viral poly(I:C) à la mi-gestation. Cette méthode permet d'étudier les effets des dysfonctionnements immunitaires sur le développement cérébral et les comportements liés à l'autisme et à la schizophrénie.

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Nous tenons à rendre hommage à feu le Dr Paul H. Patterson pour sa contribution à l&#39;avancement du modèle MIA, l&#39;autisme et la recherche sur la schizophrénie. Nous reconnaissons Sarkis K. Mazmanian pour son grand soutien sur ce protocole; Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni et Leslie A. Neumann d&#39;assistance administrative; Ali Khoshnan et Jan C. Ko pour l&#39;assistance sur le tournage; Elaine Y. Hsiao et Natalia Malkova pour leurs conseils sur MIA induction; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, et Natalie A. Verduzco pour leur élevage expert. Ce travail a été soutenu par le Conte Centre Award NIH (NIH 5P50MH086383-04, Paul H. Patterson); Autism Speaks (# 7670, à Paul H. Patterson); Fondation Simons (# 322839, à Sarkis K. Mazmanian); Subvention de formation NIH (NIH / NRSA T32GM07616 K.-HC); Caltech Summer Undergraduate Research Fellowship (SURF) (à ZY); Amgen Scholars Program à Caltech (à ZY); et postdoctorale from National Science Council, Taiwan (NSC 101-2917-I-564-039, à W.-LW).

Tous les protocoles ont été réalisées sous l&#39;approbation du California Institute of Care Committee et l&#39;utilisation des animaux Institutionnel Technologie (IACUC). 1. Préparation des paires Timed-accouplement <ol><li> Utilisez au moins 6 barrages pour des expériences comportementales et 3 pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes. REMARQUE: Utilisez le double du nombre de souris femelles estimés, puisque seulement environ 50% des souris sera branché du chronométré-accouplement. </li><li> Utilisez la souris femelle sans grossesse préalable et à 8-16 semaines d&#39;âge. NOTE: Des souris femelles qui ont une exposition sexuelle avant les souris mâles, mais ne l&#39;ont pas été enceintes sont acceptables. </li><li> Maison les souris femelles ensemble et placer les cages à côté de l&#39;autre afin de synchroniser leur cycle oestral. Utilisez une cage de souris standard avec une hauteur de plus de 5,5 pouces et un plancher intérieur de 75 pouces carrés pour permettre le logement de 5 souris adultes. Étiquetez chaque souris femelle en utilisant un poinçon de l&#39;oreille. </li></ol> 2. Mise en place Timed-mating pair <ol><li> Mettre en place le chronométré-accouplement 0-2 heures avant le début du cycle d&#39;obscurité. Placez deux souris femelles dans chaque cage. Sortez les souris et les peser individuellement. Enregistrer le poids corporel de chaque souris femelle. </li><li> Placez une souris mâle dans chaque cage avec les deux souris femelles. Utilisez trio accouplement pour réduire au minimum l&#39;effet paternel confondant. </li></ol> 3. Vaginal Plug-Check (E0.5) <ol><li> Vérifiez la femelle souris 0-4 h après la fin du cycle d&#39;obscurité. Soulevez doucement la souris femelle de la base de la queue et laissez la souris pour attraper la grille métallique, haut de la cage, ou le bord de la cage. </li><li> Rechercher des signes de bouchon vaginal: bouchon vaginal est une masse blanchâtre visible dans l&#39;ouverture vaginale. Si la fiche est pas évident, insérez délicatement une pointe de pipette 200 pi dans l&#39;ouverture vaginale. La résistance de la coagulation confirme la formation d&#39;un bouchon vaginal. Vérifiez le bouchon vaginal une fois par jour. NOTE: bouchon vaginal est seulement une indication que la copulation a eu lieu, et donc ne pas ggrossesse arantie. bouchon vaginal peut être difficile d&#39;identifier dans certaines souches de souris. Demander de l&#39;aide d&#39;un soignant de souris expérimenté pour augmenter la précision de l&#39;identification de la fiche. </li><li> Déplacez les souris branchés à une nouvelle cage et le groupe loger eux. Définir le jour de vaginal apparition de fiche embryonnaire 0,5 jours (E0.5). </li></ol> 4. Sur E10.5-11.5, Vérifiez la grossesse <ol><li> Soulevez doucement la base de la queue et laissez la souris pour attraper la grille métallique, haut de la cage, ou le bord de la cage. Observez la région de l&#39; abdomen pour vérifier les signes de la grossesse, par exemple, un renflement dans l&#39;abdomen (Figure 1). NOTE: Le signe de grossesse est toujours plus évidente à E11.5 qu&#39;à E10.5. </li><li> Peser les souris pour vérifier la grossesse. La souris enceinte pèse généralement environ 20% plus lourd à E10.5 et 30% plus lourd à E12.5 par rapport à une souris non enceintes (Figure 2). Maison de la souris enceintes dans des cages propres. </li></ol> 5. 20 mg /kg Poly (I: C) Préparation <ol><li> Utilisez au moins 6 barrages par groupe pour des expériences comportementales et 3 par groupe pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes. Préparer la quantité correspondante de poly (I: C) solution. </li><li> Peser le poly (I: C) en poudre dans un tube conique de 50 ml pour obtenir une concentration finale de 40 mg / ml. Afin de minimiser et de normaliser le stress causé par le volume d&#39;injection, injecter 5 ul de poly (I: C) une solution pour chaque gramme de poids corporel de souris (5 ul / g, soit 5 ml / kg). Pour induire MIA, on injecte 20 mg de poly (I: C) par kg. Remarque: la concentration de poly (I: C) est une solution nécessaire (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Étant donné que le poly (I: C) de poudre contient 10% de poly (I: C), nous avons besoin de faire une concentration finale de (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml de poly (I: C) solution. ATTENTION: Le poly (I: C) la poudre est très léger. Veillez à ne pas perdre de poudre pendant le transfert de la spatule pour le tube conique. </li><li> Ajouter le volume correspondant de chlorure de sodium à 0,9% (solution saline) dans la cuve coniquee et fermer le bouchon. Dissoudre la poudre en faisant rouler délicatement la gouttelette de solution saline dans le poly (I: C) jusqu&#39;à ce que la poudre la solution est limpide. Centrifuger le tube conique à 800 g pendant 1 min (figure 3C). Filtrer le poly (I: C) une solution de filtre de 0,22 um. Transférer le poly (I: C) solution à un tube de 1,5 ou 2 ml microcentrifugeuse. Facultatif: Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer le rapport 260/280 du poly (I: C) solution. Assurer que le rapport est compris entre 1,54 à 1,82 (figure 3) comme décrit par le fabricant. NOTE: La solution saline utilisée pour dissoudre le poly (I: C) poudre et servir injection de contrôle doit être de qualité stérile et pharmaceutique. </li></ol> 6. Saline ou poly (I: C) Injection sur E12.5 <ol><li> Peser la souris sur l&#39;échelle et le mettre dans la cage. Utiliser la formule suivante pour calculer le volume de l&#39;injection à la fois du sérum physiologique et le poly (I: C) chez la souris: Poids corporel (g), multiplié par 5 = volume d&#39;injection désirée (pi). Utilisez un 0,3 ml isolen seringue pour établir le volume calculé de solution saline ou 20 mg / kg de poly (I: C) solution, par exemple, 150 pl pour une souris de 30 g. </li><li> ramasser délicatement la souris par la base de la queue et le placer sur le dessus de la cage. Manipulez la souris doucement pour éviter les effets de confusion induits par le stress. Insérer l&#39;aiguille biseau vers le haut, à environ 20 ° par rapport à la souris dans le centre de ses deux tétons supérieurs (figure 4), et injecter le sérum physiologique ou le poly (I: C) la solution. REMARQUE: L&#39;aiguille doit être remplacé pour chaque souris après l&#39;injection. </li><li> Placez la souris à sa cage. Placer les cages dans un quartier calme, chambre basse du trafic pour éviter les autres effets confondants. </li></ol> 7. The Day After Poly (I: C) Injection (E13.5) <ol><li> Vérifiez les souris injectées le lendemain matin. Utilisez une échelle pour mesurer le poids corporel. NOTE: Poly (I: C) injecté les souris enceintes gagnent habituellement moins de poids que la solution saline injectée souris le jour après injection. </li><li> Ne pas déranger les souris jusqu&#39;à ce que la progéniture est née. </li></ol> 8. Jauge de MIA Offspring <ol><li> Afin de minimiser les effets confondants de MIA induction, suivez les instructions ci-dessous pour évaluer l&#39;utilisation de MIA progéniture. <ol><li> Exclure les portées de prématuré ou la naissance tardive, ou si la taille de la portée est inférieure à 5. </li><li> Euthanasier les chiots excessifs par CO 2 si la taille de la portée est plus grande que 10. </li></ol></li></ol> 9. Facultatif: Examiner la réponse inflammatoire aiguë Après MIA <ol><li> Sacrifiez l&#39;enceinte souris 3 h après une solution saline ou de poly (I: C) injection en utilisant la méthode décrite dans le protocole approuvé par le Comité de protection des animaux de l&#39;institution. NOTE: La dislocation cervicale est souvent préférée car elle minimise l&#39;effet du CO 2 médicaments / d&#39;euthanasie sur le barrage et de l&#39; embryon. </li><li> Collecter la rate des souris enceintes adultes et d&#39;isoler le placenta et soutien-gorge foetaldans le cadre du stéréomicroscope. <ol><li> Pour la collecte de la rate, poser la souris sur la plaque de dissection et pulvériser éthanol à 70% sur la région abdominale des souris enceintes. Utilisez une paire de ciseaux stériles pour faire une coupe verticale dans le centre de la zone abdominale en dessous de la cage thoracique à travers la peau. </li><li> La rate se trouve dans le quadrant supérieur gauche abdominale. Utilisez une pince pour isoler la rate. Rouler la rate sur essuie-glaces de tâches délicates pour éliminer le tissu adipeux autour de l&#39;organe. Recueillir approximativement 50 mg de tissu splénique et de les placer individuellement dans des tubes Eppendorf avec 500 ul d&#39;ARN ou de stabiliser le tampon TRIzol pour empêcher la dégradation des acides nucléiques. Conserver les échantillons à -80 ° C congélateur jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pour la collecte du placenta, tirez doucement sur les cornes utérines du corps. Placez les cornes utérines dans une boîte de Pétri remplie de sérum physiologique phosphate autoclavée tamponnée (PBS) et laisser le plat sur la glace. Utilisez deux pinces pour déchirer la paroi utérine et d&#39;exposer le sac amniotique. <ol><li>Soigneusement utiliser la pince pour ouvrir le sac amniotique sans endommager le placenta et le foetus. Séparer le placenta du fœtus et couper le cordon ombilical au plus près du placenta que possible. Éliminer les débris sac amniotique à partir du placenta. Placez le placenta individuellement dans des tubes Eppendorf avec 500 ul ARN stabilisent tampon ou TRIzol. Conserver l&#39;échantillon à -80 ° C congélateur jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Pour la collecte du cerveau du fœtus, stocker le fœtus dans l&#39;ARN stabiliser le tampon de l&#39;étape 9.2.2 jusqu&#39;à la dissection. Démêler de la membrane piale du ventricule du cerveau à l&#39;aide de pinces fines no 5 sous la loupe binoculaire. Retirez soigneusement toute la membrane du cerveau du fœtus. Placez le cerveau du fœtus individuellement dans des tubes Eppendorf avec 500 ul ARN stabilisent tampon ou TRIzol. Conserver l&#39;échantillon à -80 ° C congélateur jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Extraire l&#39;ARN à partir du tissu et de convertir l&#39;ARN en ADNc. Analyser l&#39;expression du gène IL6 dans l&#39;ADNc par real-time PCR. </li><li> Extraire l&#39;ARN à partir de tissus en suivant le protocole de fabrication de TRIzol. Si les tissus sont stockés dans un tampon de stabilisation de l&#39;ARN. Décongeler l&#39;échantillon et centrifuger le tampon. Transférer le tissu en pointe à un autre Eppendorf avec 500 ul TRIzol et poursuivre l&#39;extraction de l&#39;ARN. </li><li> Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la concentration, 260/280 et 260/230 rapport de l&#39;ARN. Vérifiez que les ratios sont supérieurs à 2,0. </li><li> Éliminer la contamination de l&#39;ADN par l&#39;ARN traité à la DNase I. Mélanger 1 pg d&#39;ARN, 1 ul de tampon 10X de réaction, 1 ul de DNase sans RNase, et de l&#39;eau sans nuclease à un volume final de 10 ul. Incuber le mélange maître à 37 ° C pendant 30 min. Ajouter 1 pi de solution d&#39;arrêt de la DNase pour terminer la réaction. Laisser incuber le mélange à 65 ° C pendant 10 min. </li><li> Transcription inverse de l&#39;ARN en ADNc. 20 ul en utilisant les réactions et jusqu&#39;à 1 ug d&#39;ARN total par réaction. Mélanger 4 pi 5x inverse tampon transcription (RT) de mélange de réaction, 1 pl reverse transcriptase 11 matrice d&#39;ARN ul après le traitement par la DNase I et 4 ul sans nucléase H 2 O pour obtenir une solution finale de 20 ul. Programmer les conditions du cycleur thermique pour RT. Une condition générique comprend: Étape 1: 25 ° C pendant 5 min; Etape 2: 42 ° C pendant 30 min; Étape 3: 85 ° C pendant 5 min; Étape 4: maintenir à 4 ° C. Diluer l&#39;ADNc 5 fois. Pour le stockage à court terme, stocker l&#39;ADNc à 4 ° C. Pour le stockage à long terme, de geler l&#39;ADNc à -20 ° C. </li><li> Analyser l&#39;expression du gène IL6 dans l&#39;ADNc par PCR en temps réel et pour normaliser l&#39;expression du gène IL6 à la ß-actine de l&#39; expression génique. <ol><li> Faites un mélange maître pour IL6 et la détection de β-actine. Utilisez 25 réaction de pi, le mélange maître pour chaque gène comprend 12,5 pi SYBR Green Mix, 0,5 pi de 10 pM amorce avant, 0,5 pi de 10 pM amorce inverse et 6,5 pi sans nucléase H 2 O. </li><li> Placer 5 pi d&#39;ADNc dilué 5x unt le fond du puits de la plaque de réaction à 96 puits optiques. Pipette 20 pi de mélange maître à chaque puits pour faire un mixage final de 25 ul PCR. Triplicata chaque gène pour chaque échantillon. Sceller la plaque à l&#39;aide d&#39;un film adhésif optique. Isoler la plaque à 800 xg pendant 3 min à 4 ° C Utiliser le programme standard de PCR en temps réel: Etape 1: 50 ° C pendant 2 minutes; Etape 2: 95 ° C pendant 10 min; Étape 3: 40 cycles de 95 ° C pendant 15 s et une température de 60 ° C pendant 1 min. Ajouter une étape supplémentaire pour la courbe de dissociation. </li></ol></li></ol> 10. Examiner les anomalies comportementales chez Offspring MIA Adulte (Facultatif): <ol><li> Effectuer les tests de comportement à l&#39;âge de 8-12 semaines. Changer la litière de la cage au moins 3 jours avant le test. Acclimate les souris à la salle de tests de comportement au moins 30 minutes avant le test. </li><li> Pour l&#39;inhibition pré-impulsion (PPI), retiennent les souris dans un cylindre en Plexiglas avec un capteur piézo-électrique au-dessous de lui. Acclimate les souris à l&#39;IPPla chambre pendant 5 min. Exposer les souris avec 6 essais de 120 dB de bruit blanc (startle). </li><li> Ensuite, exposer la souris avec des mélanges aléatoires de 14 essais de bruit de fond, 14 essais de saisissement, 14 essais de prepulse 5 dB (5 dB plus élevé que le bruit de fond) + Startle (PPI5), et 14 essais de pré-pulse 15 dB (15 dB plus élevé que le bruit de fond + Startle (PPI15). </li><li> Moyenne, la réponse de sursaut pour les 6 premiers essais de 120 essais dB. Moyenne, la réponse de sursaut pour les autres stimulations individuelles. Covert la valeur à l&#39;inhibition par pré-impulsion (Sursaut - PPI5 ou PPI15) / Startle. </li><li> Pour l&#39; essai en plein champ, placez la souris dans le coin d&#39;une arène carrée ouverte (50 x 50 x 50 cm 3). Enregistrer la trajectoire de la souris pendant 10 min à travers une caméra montée au plafond. Définir le centre de l&#39;arène que la zone centrale (17 x 17 cm2). Quantifier la distance parcourue, les entrées de la zone centrale, et le temps passé dans la zone centrale manuellement ou par un logiciel d&#39;analyse automatique basée sur l&#39;image. </li&gt; <li> Pour le test d&#39;enfouissement de marbre, acclimater la souris dans une cage de test avec 5cm comprimé profond, propre, Aspen literie de pin pendant 10 min. Retour de la souris à son homecage. Placez délicatement 20 bleu marine 1,5 cm billes de verre de diamètre dans le mode de 4 x 5 arrangement. Placez la souris vers la cage de test avec des billes pendant 10 min. Compter les billes qui ont été enterrés dans la durée d&#39;essai de 10 minutes. </li></ol> 11. Examiner la cérébelleuse neuropathologie dans Offspring MIA Adulte (facultatif): <ol><li> Euthanasier la solution saline et MIA descendants adultes par anesthésie. Perfuser la souris avec 50 ml de PBS, puis 50 ml de paraformaldehyde à 4% dans le système cardio-vasculaire. </li><li> Retirez le cerveau soigneusement et postfix le cerveau paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C. Rincer le cerveau avec du PBS trois fois et stocker le cerveau dans du PBS avec de l&#39;azoture de sodium à 0,02% dans un réfrigérateur à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. NOTE: Le cerveau postfixé peut être stocké dans du PBS avec 0,02% du gazonazoture ium dans le réfrigérateur pendant jusqu&#39;à un mois. </li><li> Section du cerveau en 50 um tranches minces sagittale utilisant vibratome. Ramassez les sections du cerveau à l&#39;aide d&#39;un pinceau doux. Mettre fin à l&#39;activité de peroxydase endogène par incubation des sections de 0,6% de peroxyde d&#39;hydrogène pendant 30 minutes à la température ambiante. </li><li> Incuber les sections dans l&#39;anticorps anti-calbindin dilué dans le tampon de blocage (sérum de chèvre à 10% avec 0,1% de Triton X-100 et 0,02% d&#39;azoture de sodium dans du PBS) pendant une nuit à température ambiante. Puis incuber les sections dans l&#39;anticorps secondaire biotinylé dilué dans du tampon de blocage pendant 2 heures à la température ambiante correspondante. </li><li> Incuber les sections dans avidine DH - Tampon biotinylé complexe H peroxydase pour détecter la biotine pendant 1 h à température ambiante. Développer les sections en utilisant le substrat de la peroxydase pour visualiser l&#39;antigène. Laver les coupes avec du PBS trois fois entre les étapes. Monter les sections sur des lames de microscope. Image sections sous le microscope. </li></ol&gt;

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<li>Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+inflammation+promotes+fetal+microglial+activation+and+increased+cholinergic+expression+in+the+fetal+basal+forebrain%3A+role+of+interleukin-6%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6.</a> Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).</li>
<li>Schwartzer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+immune+activation+and+strain+specific+interactions+in+the+development+of+autism-like+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice.</a> Transl Psychiatry. 3, e240(2013).</li>
<li>Khan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+maternal+immune+activation+on+depression-like+behavior+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse.</a> Transl Psychiatry. 4, e363(2014).</li>
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<li>Abazyan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+interaction+of+mutant+DISC1+and+immune+activation+produces+adult+psychopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology.</a> Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).</li>
<li>Meyer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+behavioral+and+pharmacological+dysfunctions+following+disruption+of+the+fetal+brain+balance+between+pro-inflammatory+and+IL-10-mediated+anti-inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling.</a> Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).</li>
<li>Vuillermot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+immune+activation+interacts+with+genetic+Nurr1+deficiency+in+the+development+of+attentional+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments.</a> J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).</li>
<li>Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Litter+size+predicts+adult+stereotypic+behavior+in+female+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).</li>
<li>Harvey, L., Boksa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereological+comparison+of+GAD67+and+reelin+expression+in+the+hippocampal+stratum+oriens+of+offspring+from+two+mouse+models+of+maternal+inflammation+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy.</a> Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

MIA induction à différentes fenêtres de temps perturbe différents événements de développement du cerveau chez les rongeurs, et conduit par conséquent à différentes anomalies comportementales et neuropathologies chez la progéniture. Ici, nous avons décrit un protocole pour induire MIA chez la souris avec le poly (I: C) injection à E12.5. Cette méthode de MIA conduit à l&#39; induction de comportement, neurologiques, immunologiques et des anomalies gastro - intestinaux associés à l&#39; autisme et la schizophrénie chez la...

Le concept de l&#39; activation immunitaire maternelle (MIA) provient des études épidémiologiques sur l&#39;association de l&#39; infection maternelle avec l&#39; autisme et la schizophrénie 1. En raison de l&#39;absence d&#39;agents pathogènes viraux replication détectables dans le placenta ou le cerveau du fœtus après l&#39; infection virale de la mère 2,3, l&#39;effet de l&#39;infection sur la descendance est supposée être provoquée par l&#39;activation du système immunitaire maternel plutôt que les agents pathogènes eux - mêmes . Pour élucider la relation et de cause à effet entre MIA et les troubles psychiatriques, l&#39;injection de synthétisé chimiquement, viral mimique à double polyinosinique ARN brin: acide polycytidylique (poly (I: C)) dans les rongeurs enceintes a été largement utilisé comme modèle animal pour MIA 4,5. Poly (I: C) est reconnu par Toll-like récepteur 3 (TLR3), et l&#39;administration systémique de poly (I: C) induit une réponse inflammatoire aiguë de type viral. L&#39;un des mécanismes par lesquels le poly (I: C) produces anomalies comportementales et neuropathologies chez la progéniture est en provoquant un déséquilibre de cytokines pro - inflammatoires et anti dans l&#39;axe de la mère-placentaire-foetal 6. Plusieurs groupes ont adopté le modèle MIA pour comprendre l&#39;étiologie des troubles psychiatriques 7, et en raison de la diversité des intérêts entre les groupes de recherche, divers points de temps d&#39;activation immunitaire ont été utilisés pour réaliser différentes perturbations sur le développement du cerveau et les comportements 7. Le laboratoire Paul H. Patterson à l&#39;Institut de Technologie de Californie adopte la stratégie d&#39;injection de poly (I: C) dans des souris enceintes à embryonnaires 12,5 jours (E12.5), qui a démontré avec succès que MIA est capable d&#39;induire des comportements, neurologique, et des modifications immunologiques chez la progéniture qui sont associés à l&#39; autisme et la schizophrénie 11/08. Nos travaux antérieurs montrent que MIA progéniture afficher des anomalies du comportement (par exemple, impairmen sociauxt, le déficit de communication, comportement répétitif, le comportement à l&#39; anxiété, et latente déficit d&#39;inhibition 8,10,12), immunitaire dysrégulation et cytokines déséquilibre 8,13,14, altération de l&#39; expression des gènes du cerveau du fœtus 15, la perte de cellules de Purkinje dans lobule VII du cervelet 11, altération des propriétés synaptiques dans l&#39; hippocampe 9, gène x environnement interaction 13, altération de la perméabilité intestinale, et la composition du microbiote intestinal 16. En outre, des stratégies thérapeutiques et prophylactiques sont également développés à partir de ce 13,16,17 système modèle. En induisant MIA à E12.5, d&#39; autres ont montré que MIA produit l&#39; activation du fœtus microglie et l&#39; altération du développement cholinergique cerveau antérieur basal 18, souche spécifique interaction 19, le cerveau synaptosomiques cérébrale anomalies ultrastructurales, cérébrales mitochondriales respiratoires abnormalties chaîne hyperfonctionnement, la régulation négative de molécules synaptosomiques cérébrales 17 ,comportements dépressifs-like, déficience de la cognition et hippocampique potentialisation à long terme (LTP), et le déficit de la neurogenèse hippocampique adulte 20. Ici, nous fournissons une méthode détaillée de la façon d&#39;induire MIA à E12.5 par poly (I: C), ainsi que les paradigmes de la façon d&#39;appliquer ce modèle pour étudier l&#39;étiologie de l&#39;autisme et la schizophrénie. Il est important de noter que la MIA est un facteur de risque pour une variété de troubles 4, et ses résultats sont extrêmement sensibles au temps et un procédé d&#39;induction ainsi que l&#39;élevage des femelles gravides. En tant que tel, même des incohérences mineures entre les laboratoires aboutissent souvent à faible reproductibilité et / ou différents phénotypes de la progéniture. Notre méthode est spécifiquement conçu pour les personnes intéressées à étudier MIA comme un facteur de risque environnemental pour l&#39;autisme et la schizophrénie, et la description détaillée fournie aidera les chercheurs à améliorer la reproductibilité de leurs données.

<table><tbody><tr><td>Polyinosinique&ndash ; sel de potassium d’acide polycytidylique</td><td>SIGMA</td><td>P9582</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % chlorure de sodium INJ. USP</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2"</td><td>COVIDIEN</td><td>8881600145</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes coniques à vis</td><td>USA SCIENTIFIC</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop 1000</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>1000</td><td>Stéréomicroscope en option</td></tr><tr><td></td><td>Wild Heerbrugg</td><td>M5A</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5 en option Taille de la pointe .10 x .06 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td>en option</td></tr><tr><td>Réactif de stabilisation de l’ARN ARNlater</td><td>en option Qiagen</td><td>76104</td><td></td></tr><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>en option Life Technologies</td><td>15596-026&nbsp ;</td><td>optionnel</td></tr><tr><td>DNase sans RNASE RQ1</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc iScript</td> en option <td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>FastStart universal SYBR green master mix en option avec ROX&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td>en option</td></tr><tr><td>PCR en temps réel</td><td>ABI</td><td>7300</td><td>Introduction en option</td></tr><tr><td>: Il6 forward</td><td>Life Technologies</td><td>TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC</td><td>Entrée en option</td></tr><tr><td>: Il6 Reverse</td><td>Life Technologies</td><td>TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC</td><td>Amorce en option</td></tr><tr><td>: bêta-actine forward</td><td>Life Technologies</td><td>AGAGGGAAATCGTGCGTGAC</td><td>En option</td></tr><tr><td>Amorce : bêta-actine Reverse</td><td>Life Technologies</td><td>CAATAGTGATGACCTGGCCGT</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de réaction optique à 96 puits MicroAmp</td> en option Life <td>Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>Optionl MicroAmp film adhésif optique&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>4311971</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>EthoVision</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Appareil SR-LAB (PPI)</td><td>San Diego Instruments&nbsp ;</td><td>SR-LAB</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Marbres</td><td>PENN-PLAX</td><td>Pierres précieuses bleues marbres</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>21600-069</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>MACRON</td><td>2621-59</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma</td><td>18312</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Rabbit anti-calbindine</td><td>anticorps Abcam</td><td>ab11426</td><td>Optionl</td></tr><tr><td>Chèvre biotinlysée anti-lapin IgGantibody</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td>Option</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>Option</td></tr></tbody></table>

induction de la mère immune activation chez la souris à mi-gestation scène avec viral mimic poly (i: c)

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Le modèle d’activation immunitaire maternelle (AMI) est de plus en plus apprécié comme modèle de rongeur pour le facteur de risque environnemental de divers troubles psychiatriques. De nombreuses études ont démontré que le modèle MIA est capable de montrer la valeur faciale, conceptuelle et prédictive qui sont pertinentes pour l’autisme et la schizophrénie. Pour modéliser l’AIM, les chercheurs utilisent souvent l’imitation virale polyinosinique :acide polycytidylique (poly(I :C)) pour activer le système immunitaire chez les rongeurs enceintes. Généralement, la progéniture de la digue activée par le système immunitaire présente des anomalies comportementales et des altérations physiologiques associées à l’autisme et à la schizophrénie. Cependant, l’injection poly(I :C) avec différents dosages et à différents moments pourrait conduire à des résultats différents en perturbant le développement du cerveau à différents stades. Nous présentons ici une méthode détaillée pour induire une MIA par injection intrapéritonéale (i.p.) de 20 mg/kg de poly(I :C) à 12,5 jours embryonnaires au milieu de la gestation (E12.5). Il a été démontré que cette méthode induit une réponse inflammatoire aiguë dans l’axe mère-placentaire-fœtal, ce qui entraîne finalement les perturbations cérébrales et les phénotypes comportementaux associés à l’autisme et à la schizophrénie.

<html> L&#39; injection de 20 mg / kg de poly (I: C) à E12.5 pourrait provoquer une réponse inflammatoire aiguë dans l&#39;axe de la mère-placentaire fœtal et précipiter un effet chronique au développement du cerveau et de phénotypes comportementaux 12,13. Des niveaux élevés d&#39;une cytokine pro-inflammatoire, l&#39;interleukine (IL) -6, est un indicateur fiable de la réponse inflammatoire aiguë après MIA. Le temps de pointe pour l&#39; expression du gène IL6 dans le...

L’activation immunitaire maternelle (MIA) est un modèle pour un facteur de risque environnemental de l’autisme et de la schizophrénie. L’objectif de cet article est de fournir une procédure étape par étape sur la façon d’induire une MIA chez les souris enceintes afin d’améliorer la reproductibilité de ce modèle.

Induction de la mère Immune Activation chez la souris à mi-gestation scène avec Viral Mimic Poly (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire une activation immunitaire maternelle, ou MIA, chez la souris par injection intrapéritonéale du poly I:C, un analogue viral, au stade embryonnaire médian de la gestation. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-immunologie, telles que la manière dont un dysfonctionnement immunitaire peut entraîner des perturbations du développement cérébral et du comportement. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est spécifiquement conçue pour les chercheurs intéressés par l'étude de la MIA comme facteur de risque environnemental dans l'autisme et la schizophrénie.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car de légères différences dans la méthode d'induction de l'AMI peuvent modifier considérablement la réponse ultérieure chez la descendance. Pour mettre en place un accouplement synchronisé, commencez par loger cinq souris femelles par cage, placées côte à côte dans des cages standard pour souris afin de synchroniser leurs cycles œstraux, et utilisez une perforation à l’oreille pour identifier chaque animal. Entre zéro et deux heures avant le début du cycle d’obscurité, logez les souris femelles deux par cage, pesez-les et enregistrez le poids corporel de chaque souris, puis ajoutez une souris mâle par cage contenant deux souris femelles.De zéro à quatre heures après la fin du cycle d’obscurité, soulevez délicatement chaque souris femelle par la base de la queue, en lui permettant d’agripper la grille de la cage avec ses pattes antérieures, afin de déterminer la présence d’une masse blanchâtre à l’orifice vaginal. Si un bouchon n’est pas visible, insérez délicatement une pointe de pipette de 200 microlitres dans l’orifice vaginal. Une résistance due à la coagulation confirme la formation d’un bouchon.Regrouper les souris pluguées dans une nouvelle cage, car la présence d'un bouchon vaginal confirme uniquement qu'une copulation a eu lieu. Aux jours embryonnaires 10,5 à 11,5, soulever chaque souris femelle pluguée par la base de la queue et rechercher une protubérance abdominale, puis peser les souris pour confirmer la grossesse, et loger les animaux gestants dans des cages propres individuelles. Peser la poudre de poly(I:C) dans un tube conique de 50 millilitres.Au jour embryonnaire 12,5, ajouter le volume approprié de chlorure de sodium à 0,9 % au volume correspondant de poly(I:C) dans un tube conique, puis fermer le bouchon. Rouler doucement la goutte de solution saline sur la poudre jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Ensuite, centrifuger le tube et transférer la solution de poly(I:C) dans un tube microcentrifuge.Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer le rapport 260 à 280 de la solution de poly(I:C). Ce rapport doit se situer entre 1,54 et 1,82, comme indiqué par le fabricant. Ensuite, pesez la première souris et chargez une seringue à insuline de 0,3 millilitre avec le volume calculé correspondant de solution de poly(I:C).Ensuite, prenez la souris par la queue, placez-la sur le dessus de la cage et maintenez-la fermement par la nuque. Insérez maintenant l'aiguille, côté biseau vers le haut, au centre des deux mamelons supérieurs selon un angle d'environ 20 degrés par rapport à la souris, puis administrez la solution de poly(I:C). Replacez ensuite la souris dans la cage.Une fois que toutes les souris ont été injectées, placer les cages dans une pièce calme et peu fréquentée afin d'éviter d'autres effets perturbateurs, et peser les souris le lendemain matin. Au moins trois jours avant les tests comportementaux, changer la litière des cages des souris adultes issues d'une activation immunitaire maternelle (MIA) âgées de huit à douze semaines. Acclimater les souris à la salle de test pendant 30 minutes avant le test.Pour un test d'inhibition de la réponse pré-impulsionnelle, immobilisez les souris dans des cylindres en plexiglas placés sur un capteur piézoélectrique. Habituez la souris à la chambre d'inhibition de la réponse pré-impulsionnelle pendant cinq minutes, avec six essais de bruit blanc à 120 décibels. Ensuite, exposez les souris à des mélanges aléatoires de sons, comme indiqué dans le tableau, et comparez les résultats à la réponse de sursaut de base, afin de déterminer l'inhibition de la réponse pré-impulsionnelle chez les animaux MIA.Pour un test en champ ouvert, placez une souris dans un coin d'une arène carrée ouverte, comportant une zone centrale définie de 17 sur 17 centimètres, et enregistrez la trajectoire de la souris pendant 10 minutes à l'aide d'une caméra fixée au plafond. Quantifiez ensuite le nombre d'entrées dans la zone centrale ainsi que le temps passé dans cette zone. Pour un test d'enfouissement de billes, habituez une souris à une cage d'essai contenant une litière de sciure de pin blanc compressée d'une profondeur de cinq centimètres pendant 10 minutes, puis replacez la souris dans sa cage d'origine et disposez délicatement 20 billes en verre bleu marine de 1,5 centimètre de diamètre selon une grille de quatre par cinq dans la cage d'essai.Replacer maintenant la souris dans la cage de test pendant 10 minutes, puis remettre l’animal dans sa cage d’origine et compter le nombre de billes enterrées pendant la période de test. L’injection de poly(I:C) au jour embryonnaire 12,5 peut provoquer une réponse inflammatoire aiguë dans l’axe maternel-placentaire-fœtal et entraîner un effet chronique sur le développement cérébral et les phénotypes comportementaux. En effet, le poly(I:C) induit une expression plus élevée du gène Il6 dans la rate maternelle, le placenta et le cerveau fœtal, trois heures après l’injection.En général, par rapport aux descendants adultes traités par solution saline, les descendants adultes issus de l'IMA présentent moins d'entrées dans la zone centrale et une durée de séjour plus courte dans la zone centrale lors du test du champ ouvert. Les animaux injectés avec du poly(I:C) affichent également des comportements d'enfouissement plus fréquents lors du test d'enfouissement de billes, ainsi qu'une inhibition pré-pulsion plus faible. La perte de cellules de Purkinje dans le lobe sept du cervelet constitue un autre critère caractéristique des descendants issus de l'IMA, avec un nombre réduit de cellules de Purkinje positives pour la calbindine observé dans le lobe sept du cervelet de ces animaux, comparé aux témoins injectés avec une solution saline.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas déranger les souris gestantes après l'induction de l'IMA. Par la suite, des facteurs supplémentaires tels que le stress postnatal ou une infection peuvent être induits afin d'étudier d'autres interactions environnementales.

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