Induction de la mère Immune Activation chez la souris à mi-gestation scène avec Viral Mimic Poly (I: C)

L'objectif général de cette procédure est d'induire une activation immunitaire maternelle, ou MIA, chez la souris par injection intrapéritonéale du poly I:C, un analogue viral, au stade embryonnaire médian de la gestation. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-immunologie, telles que la manière dont un dysfonctionnement immunitaire peut entraîner des perturbations du développement cérébral et du comportement. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est spécifiquement conçue pour les chercheurs intéressés par l'étude de la MIA comme facteur de risque environnemental dans l'autisme et la schizophrénie.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car de légères différences dans la méthode d'induction de l'AMI peuvent modifier considérablement la réponse ultérieure chez la descendance. Pour mettre en place un accouplement synchronisé, commencez par loger cinq souris femelles par cage, placées côte à côte dans des cages standard pour souris afin de synchroniser leurs cycles œstraux, et utilisez une perforation à l’oreille pour identifier chaque animal. Entre zéro et deux heures avant le début du cycle d’obscurité, logez les souris femelles deux par cage, pesez-les et enregistrez le poids corporel de chaque souris, puis ajoutez une souris mâle par cage contenant deux souris femelles.

De zéro à quatre heures après la fin du cycle d’obscurité, soulevez délicatement chaque souris femelle par la base de la queue, en lui permettant d’agripper la grille de la cage avec ses pattes antérieures, afin de déterminer la présence d’une masse blanchâtre à l’orifice vaginal. Si un bouchon n’est pas visible, insérez délicatement une pointe de pipette de 200 microlitres dans l’orifice vaginal. Une résistance due à la coagulation confirme la formation d’un bouchon.

Regrouper les souris pluguées dans une nouvelle cage, car la présence d'un bouchon vaginal confirme uniquement qu'une copulation a eu lieu. Aux jours embryonnaires 10,5 à 11,5, soulever chaque souris femelle pluguée par la base de la queue et rechercher une protubérance abdominale, puis peser les souris pour confirmer la grossesse, et loger les animaux gestants dans des cages propres individuelles. Peser la poudre de poly(I:C) dans un tube conique de 50 millilitres.

Au jour embryonnaire 12,5, ajouter le volume approprié de chlorure de sodium à 0,9 % au volume correspondant de poly(I:C) dans un tube conique, puis fermer le bouchon. Rouler doucement la goutte de solution saline sur la poudre jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Ensuite, centrifuger le tube et transférer la solution de poly(I:C) dans un tube microcentrifuge.

Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer le rapport 260 à 280 de la solution de poly(I:C). Ce rapport doit se situer entre 1,54 et 1,82, comme indiqué par le fabricant. Ensuite, pesez la première souris et chargez une seringue à insuline de 0,3 millilitre avec le volume calculé correspondant de solution de poly(I:C).

Ensuite, prenez la souris par la queue, placez-la sur le dessus de la cage et maintenez-la fermement par la nuque. Insérez maintenant l'aiguille, côté biseau vers le haut, au centre des deux mamelons supérieurs selon un angle d'environ 20 degrés par rapport à la souris, puis administrez la solution de poly(I:C). Replacez ensuite la souris dans la cage.

Une fois que toutes les souris ont été injectées, placer les cages dans une pièce calme et peu fréquentée afin d'éviter d'autres effets perturbateurs, et peser les souris le lendemain matin. Au moins trois jours avant les tests comportementaux, changer la litière des cages des souris adultes issues d'une activation immunitaire maternelle (MIA) âgées de huit à douze semaines. Acclimater les souris à la salle de test pendant 30 minutes avant le test.

Pour un test d'inhibition de la réponse pré-impulsionnelle, immobilisez les souris dans des cylindres en plexiglas placés sur un capteur piézoélectrique. Habituez la souris à la chambre d'inhibition de la réponse pré-impulsionnelle pendant cinq minutes, avec six essais de bruit blanc à 120 décibels. Ensuite, exposez les souris à des mélanges aléatoires de sons, comme indiqué dans le tableau, et comparez les résultats à la réponse de sursaut de base, afin de déterminer l'inhibition de la réponse pré-impulsionnelle chez les animaux MIA.

Pour un test en champ ouvert, placez une souris dans un coin d'une arène carrée ouverte, comportant une zone centrale définie de 17 sur 17 centimètres, et enregistrez la trajectoire de la souris pendant 10 minutes à l'aide d'une caméra fixée au plafond. Quantifiez ensuite le nombre d'entrées dans la zone centrale ainsi que le temps passé dans cette zone. Pour un test d'enfouissement de billes, habituez une souris à une cage d'essai contenant une litière de sciure de pin blanc compressée d'une profondeur de cinq centimètres pendant 10 minutes, puis replacez la souris dans sa cage d'origine et disposez délicatement 20 billes en verre bleu marine de 1,5 centimètre de diamètre selon une grille de quatre par cinq dans la cage d'essai.

Replacer maintenant la souris dans la cage de test pendant 10 minutes, puis remettre l’animal dans sa cage d’origine et compter le nombre de billes enterrées pendant la période de test. L’injection de poly(I:C) au jour embryonnaire 12,5 peut provoquer une réponse inflammatoire aiguë dans l’axe maternel-placentaire-fœtal et entraîner un effet chronique sur le développement cérébral et les phénotypes comportementaux. En effet, le poly(I:C) induit une expression plus élevée du gène Il6 dans la rate maternelle, le placenta et le cerveau fœtal, trois heures après l’injection.

En général, par rapport aux descendants adultes traités par solution saline, les descendants adultes issus de l'IMA présentent moins d'entrées dans la zone centrale et une durée de séjour plus courte dans la zone centrale lors du test du champ ouvert. Les animaux injectés avec du poly(I:C) affichent également des comportements d'enfouissement plus fréquents lors du test d'enfouissement de billes, ainsi qu'une inhibition pré-pulsion plus faible. La perte de cellules de Purkinje dans le lobe sept du cervelet constitue un autre critère caractéristique des descendants issus de l'IMA, avec un nombre réduit de cellules de Purkinje positives pour la calbindine observé dans le lobe sept du cervelet de ces animaux, comparé aux témoins injectés avec une solution saline.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas déranger les souris gestantes après l'induction de l'IMA. Par la suite, des facteurs supplémentaires tels que le stress postnatal ou une infection peuvent être induits afin d'étudier d'autres interactions environnementales.