Name: Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4 + CD45RB Haute T cellules dans des souris immunodéficientes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez l'induction d'inflammation intestinale chez la souris par transfert adoptif de cellules T CD4+ CD45RBhigh. Cette méthode reproduit les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin humain pour étudier la pathogenèse et tester de nouvelles thérapies.

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Ce travail a été soutenu par American Gastroenterological Association (AGA) Scholars Research Award et la maladie de Crohn et la colite Foundation of America (CCFA) Award développement de carrière (à SPR), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS), et l&#39;Université de Centre de la Caroline du Nord pour la biologie gastro- et les maladies Grant P30 DK34987 (histologie). Le Fonds pour l&#39;UNC cytométrie en flux de base est financé en partie par une subvention de soutien de base NCI Center (P30CA016086) à l&#39;UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Nous remercions Luc B. Borst de North Carolina State University College de médecine vétérinaire pour son aide à l&#39;analyse histopathologique et immunohistochimie.

REMARQUE: Assurez-vous que tous les protocoles d&#39;animaux sont approuvés par et en conformité avec institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation du Comité (IACUC) règlements et le Guide du Conseil national de recherches pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Les souris donneuses peuvent être soit mâle ou femelle, mais les souris receveuses doivent être de sexe masculin. Si les bénéficiaires de sexe féminin doivent être utilisés, les souris les donateurs doivent être des femmes 5. Maintenir colonies utilisant régulière, literie non stérile et l&#39;eau non acidifié, car ils peuvent affecter la microflore intestinale, et, par conséquent, le phénotype de la colite de la souris 5,6. 1. Préparation expérimentale <ol><li> Utiliser les médias et les tampons glacées. Gardez cellules sur la glace pendant toute l&#39;expérience. </li><li> Réaliser l&#39;expérience dans le capot de risque biologique stérile en utilisant une technique stérile. </li></ol> 2. Isolement des cellules T spléniques <ol><li> Euthanasier souris donneuse / souris de CO 2 chambre suivies par dislocatio col de l&#39;utérusn. Pulvériser abdomen avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Faire une incision horizontale dans l&#39;abdomen et décoller la peau pour exposer péritoine. Tenez péritoine loin des organes internes avec la pince et faire une incision dans le péritoine abdominal gauche pour exposer et exciser la rate. </li><li> Placez la rate dans 10 ml de médias complète dans une boîte de Petri. Retirez et jetez l&#39;excès de tissu de la rate. </li><li> Utilisez deux lames de verre stérilisés pour écraser et de démêler la rate en suspension à cellule unique. suspension de cellules de filtre à travers un tamis de 70 um dans un tube conique de 50 ml et rincer filtre avec 5 ml de milieu complet. Placez jusqu&#39;à 5 rates dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Centrifuger les cellules à 450 g pendant 7 min. Rejeter le surnageant en versant à pied ou par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets. </li><li> Resuspendre doucement les cellules dans 5 ml par rate de tampon de lyse pour lyser les globules rouges pendant 10 minutes à température ambiante. Ajouter un volume égal de milieu complet (5 ml par rate) au tube. </li><li&gt; centrifuger les cellules à 450 g pendant 7 min. Rejeter le surnageant en versant à pied ou par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets. </li><li> Resuspendre doucement les cellules dans 10 ml de Labeling Buffer. </li><li> Compter les cellules par exclusion au bleu trypan. <ol><li> Retirer 20 ul de suspension cellulaire et ajouter 180 ul bleu trypan à un tube de centrifugeuse et bien mélanger. Après 5 min, ajouter 10 ul cellules hémocytomètre et compter les cellules non-bleu sous le microscope étiquetés. Déterminer le nombre total de cellules viables. Jeter cellules / trypan bleu mix. </li></ol></li><li> Centrifuger les cellules dans 10 ml de Labeling Buffer à 450 g pendant 7 min. Rejeter le surnageant en versant à pied ou par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets. </li></ol> 3. Enrichissement de cellules T CD4 + REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour des produits spécifiques utilisés dans cette section. <ol><li> Resuspendre doucement les cellules à une suspension à cellule unique de 20 x 10 6 cellules / ml dans du froid ÉtiquetteBuffer ing. </li><li> Ajouter 5 ul par 1 x 10 6 cellules d&#39;anticorps d&#39;enrichissement de cellules T CD4 biotinylé. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min. </li><li> Ajouter 10x volume de Labeling Buffer. Centrifuger les cellules à 450 g pendant 7 min. Aspirer soigneusement tout le surnageant par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets. </li><li> Bien agiter au vortex particules magnétiques de streptavidine conjugué. Ajouter 5 ul de particules par 1 x 10 6 cellules. </li><li> Mélanger soigneusement mais doucement. Gardez mélange à 6-12 ° C pendant 30 min. </li><li> Ajouter étiquetage tampon à une concentration de 20 à 80 x 10 6 cellules / ml. Transfert jusqu&#39;à 1,0 ml des cellules marquées par 12 x 75 mm tube à essai à fond rond (dénommé &quot;tube-positif fraction»). </li><li> Placez chaque tube positif fraction sur l&#39;aimant pour les 6-8 min. </li><li> Avec les tubes positif fraction encore sur l&#39;aimant, transférer soigneusement surnageant à partir du tube positif fraction avec pipette Pasteur en verre à une nouvelle stériles 50 ml tube conique (referred pour que la &quot;fraction enrichie»). Cette fraction enrichie contient des cellules T CD4 +. Veillez à ne pas perturber les cellules marquées attirés par l&#39;aimant. </li><li> Resuspendre les cellules laissées dans les tubes positif fraction dans le même volume de Labeling Buffer comme dans l&#39;étape 3.6 par aspiration et vigoureusement vers le bas. Placez le tube positif fraction de retour sur aimant pour les 6-8 min. </li><li> Avec tubes positif fraction encore sur l&#39;aimant, transférer soigneusement surnageant (fraction enrichie, CD4 +) du tube positif fraction de verre Pasteur pipette pour stérile de 50 ml tube conique de l&#39;étape 3.8 sans perturber les cellules attachées à l&#39;aimant. </li><li> Répéter les étapes 3.9 à 3.10 pour augmenter le rendement en cellules T CD4 + obtenues. Continuer protocole utilisant fraction enrichie (CD4 + cellules). </li></ol> 4. L&#39;étiquetage et le tri des cellules 7 <ol><li> Centrifugeuse enrichi cellules à 450 g pendant 7 min. Rejeter le surnageant en versant hors tension ou sous vide SUCTions dans un conteneur à déchets. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml de Labeling Buffer. Retirer aliquote de cellules pour compter et pour évaluer la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan comme à l&#39;étape 2.9. </li><li> Ajouter un volume de Labeling Buffer à 10 x 10 6 cellules / ml; si les cellules sont déjà &lt;10 x 10 6, centrifuger à 450 g pendant 7 min, éliminer le surnageant en versant off ou d&#39;aspiration sous vide dans un conteneur à déchets, et d&#39;ajouter volume de Labeling Buffer à 10 x 10 6 cellules / ml. <ol><li> Mettre en place des portions séparées d&#39;environ 5 à 10 x 10 5 cellules chacune des cellules de contrôle non colorées, isotype teinté et simples teinté dans des microtubes. </li></ol></li><li> Ajouter 5 ug / ml de CD4-FITC et 1 ug / ml de CD45RB-PE aux cellules. Ajouter taches de contrôle isotypique et les taches simples à la même concentration se approprier aliquotes dans des microtubes. Mélangez bien mais doucement et incuber sur de la glace abri de la lumière pendant 30 min. </li><li> Ajouter 10x volume de Labeling Buffer aux cellules et le contrôles. Centrifugeuse 450 xg pendant 7 min. Rejeter le surnageant par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets. </li><li> Remettre en suspension dans Labeling Buffer au volume à l&#39;étape 4.5. Centrifugeuse 450 xg pendant 7 min. Rejeter le surnageant par aspiration sous vide dans un conteneur à déchets. </li><li> Remettre en suspension dans Labeling Buffer à 10 x 10 6 cellules / ml. Passez cellules à 70 um passoire dans FACS tube. Garder sur la glace abri de la lumière jusqu&#39;au moment de FACS. </li><li> Mettre en place et déterminer la rémunération appropriée sur le trieur de cellules avec des cellules non colorées et des contrôles simples teinté. </li><li> Exclure les cellules non viables avec déclenchement prospectifs et dispersion latérale (figure 1A). Mettre en place gating pour CD4 + et + CD45RB cellules avec contrôles isotypiques teinté. Cellules porte sur la population CD4 +. </li><li> Trier cellules CD4 + dans CD45RB élevé et CD45RB faibles populations en utilisant un histogramme simple pour les cellules de PE teinté dans des tubes avec 2 ml de milieu complet. Le CD45RB haute </sup&gt; population représente le plus haut de 40% des CD4 + CD45RB + cellules (CD45RB haute), et de la faible densité de population est la plus faible CD45RB 20% des cellules CD4 + CD45RB + (CD45RB bas, figure 1B). </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig1.jpg" /> Figure 1: flux Représentant cytométrie parcelles de populations de cellules CD4 + CD45RB T lors de l&#39;analyse FACS (A - C) FITC CD4 et PE CD45RB-taché splénocytes de donneurs C57BL / 6 ont été triées par FACS en CD4 + CD45RB élevé et CD4 +. populations de cellules T CD45RB bas. Événements (A) Doublet ont été exclus sur le nuage de points avant. (B) Les lymphocytes ont été bloqués dans le complot de l&#39;avant et la diffusion latérale. (C) CD4 + </sup&gt; cellules T ont été bloqués, et les cellules (D) CD4 + CD45RB + T ont été reportées sur un PE par rapport Events histogramme. Cellules CD4 + CD45RB faibles ont été considérés comme la plus faible de 20% des cellules CD45RB +. Cellules CD4 + CD45RB élevés ont été définis comme la plus haute de 40% des cellules CD45RB +. <ol start="11"><li> Exécuter une aliquote de chaque population de cellules sur la machine FACS pour évaluer la pureté des populations. </li><li> Centrifugeuse triée cellules à 450 g pendant 7 min. Remettre en suspension dans 1 ml de PBS. Retirer aliquote de cellules pour compter et pour évaluer la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan comme à l&#39;étape 2.9. </li></ol> 5. injection de cellules dans des receveurs <ol><li> Remettre en suspension les cellules triées à 4 x 10 6 cellules / ml (CD45RB haut) ou 2 x 10 6 cellules / ml (CD45RB bas) dans du PBS. </li><li> Transférer 100 ul de cellules de haute CD45RB par bénéficiaire dans un nouveau tube stérile. Ajouter 100 ul de PBS pardestinataire de ce tube. Ainsi, le volume total d&#39;injection par animal est de 200 pi, et le montant total de cellules par bénéficiaire est de 4 cellules T naïves élevés x 10 5 CD4 + CD45RB. </li><li> Si groupe expérimental recevant cellules régulatrices T est souhaitée, transférer 100 pi de cellules élevées CD45RB par bénéficiaire dans un nouveau tube stérile. Ajouter 100 pi de cellules par CD45RB faible destinataire dans le même tube. Volume d&#39;injection total par animal est de 200 pi; rapport de CD45RB haute: CD45RB cellules faibles est de 2: 1. </li><li> Injecter 100 ul de CD45RB élevé ou CD45RB high / low CD45RB cellules CD4 + par voie intrapéritonéale dans le droit et le côté gauche de l&#39;abdomen (total de 200 pi) de chaque destinataire. </li></ol> 6. Suivi de progression de la maladie chez les animaux receveurs <ol><li> Pour évaluer l&#39;état clinique des animaux receveurs, attribuer des notes cliniques globales pour la paramete suivanters 8 le jour de l&#39;injection, toutes les semaines par la suite, et au moment du sacrifice: <ol><li> Déterminer perdre en mesurant la perte de poids: 0 - aucune perte de poids; Perte de poids corporel initial de 0,1 à 10% de - 1; 2 - La perte de plus de 10% du poids corporel initial (figure 2A). </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" width="650" /> Figure 2: signes pathologiques cliniques et bruts de l&#39;inflammation se produisent après le transfert de cellules de haute T CD4 + CD45RB de type sauvage dans Rag1 - / - et NRDKO souris receveuses 11 (A) bénéficiaires NRDKO perdu en moyenne 10% de leur poids corporel initial de 5. semaines après le transfert, alors que Rag1- / - Les destinataires ne ont pas présenté de signes cliniques de la maladie à ce moment. Chaque point représente le pourcentage moyen de poids corporel initial pour la cohorte ± SEM. **, P &lt;0,005. (B) Certaines souris ont développé une inflammation intestinale sévère, comme en témoigne la présence d&#39;un prolapsus rectal. Ce est une image représentative de prolapsus rectal chez un receveur souris NRDKO. (C) Grossièrement, deux points à la fois Rag1 - / - et les souris receveuses NRDKO sont épaissies et raccourci par rapport à deux points de Rag1 - / - et souris sans NRDKO cellules T transfert adoptif. Colons de souris receveuses NRDKO montrent une inflammation sévère et le poids du côlon augmentation (données non présentées). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol><li><ol start="2"><li> Déterminer la qualité des selles en plaçant l&#39;animal dans un récipient propre jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait passéselles: 0 - aucun; 1 - selles molles; 2 - selles liquides et / ou sanglante. </li><li> Déterminer la santé générale de l&#39;animal par la présence des signes de maladie suivants: 0 - pas une posture voûtée, poils de fourrure, la peau ou des lésions; 1 - l&#39;un quelconque des présents suivante: posture voûtée, fourrure à poils, ou des lésions de la peau. </li><li> Déterminer la présence d&#39;un prolapsus rectal: 0 - absent; 1 - présente (figure 2B). </li></ol></li><li> Sacrifier des animaux par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale quand ils ont perdu 20% de leur poids corporel de départ ou au point de temps désiré, selon la première éventualité. Maladie clinique est habituellement apparente à partir de 5 semaines post-réplétion. </li><li> Évaluer la gravité de la maladie, comme décrit précédemment 5,7. <ol><li> Attribuer des notes cliniques que dans l&#39;étape 6.1 8. </li><li> Mesurer la longueur du côlon et du poids (figure 2C). </li><li> Effectuer l&#39;analyse histologique de l&#39;inflammation5. </li><li> Déterminer l&#39;expression de cytokine spontanée dans les cultures d&#39;explants intestinaux de tissu 9, 10 nœuds lymphatiques mésentériques, et / ou le sérum 11. <ol><li> En bref, pour les cultures d&#39;explants neuf, retirer deux points après le sacrifice, ouverte longitudinalement, et propre avec du PBS. Incuber deux points sur un agitateur orbital réglé à 250 rpm dans un milieu complet pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Hacher le tissu en petits morceaux et incubées à 37 ° C dans un milieu complet pendant 24 heures. Recueillir le surnageant et utiliser pour la quantification de cytokines par 100 mg de tissu par ELISA. </li></ol></li><li> Effectuer la caractérisation ex vivo des phénotypes et / ou de la fonction 10 cellules T. </li></ol></li></ol>

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<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons ici un protocole étape par étape induisant une inflammation du côlon chez la souris par transfert adoptif de cellules T CD4 + CD45RB + T dans des souris immunodéficientes. Nous avons utilisé des rates C57BL / 6 donateurs et Rag1 syngénique - / - souris receveuses, bien que d&#39;autres souches (par exemple, BALB / c, 129S6 / SvEv, diabétiques non obèses (NOD)) modèles et génétiques de l&#39;immunodéficience (par exemple, SCID, Rag2 ...

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI) La maladie de Crohn et la colite ulcéreuse résultent d’une interaction complexe et incomplètement définie entre les réponses immunitaires de l’hôte, la susceptibilité génétique, les facteurs environnementaux et le contenu luminal entérique1. De récentes études d’association à l’échelle du génome font état d’associations entre les gènes régulateurs des cellules immunitaires et la susceptibilité aux MII2,3. Les gènes intrinsèques des cellules immunitaires innées et adaptatives sont représentés dans ces études, ce qui indique un rôle central pour ces populations cellulaires dans la pathogenèse des MICI.
Il existe actuellement plus de 50 modèles animaux de MICI humaines. Bien qu’aucun modèle ne phénocopie parfaitement les MICI humaines, beaucoup sont utiles pour étudier divers aspects des maladies humaines, y compris l’apparition et la progression de la maladie et la réponse à la cicatrisation des plaies. Dans la méthode décrite ici, l’inflammation intestinale est initiée par un transfert adoptif syngénique de lymphocytes Tspléniques élevés CD4+CD45RB dans des souris receveuses déficientes en lymphocytes T et B4. La population de lymphocytes TCD4+CD45RB élevée contient principalement des lymphocytes T naïfs prêts à l’activation qui sont capables d’induire une inflammation chronique de l’intestin grêle et du côlon. Cette méthode permet au chercheur de modifier des variables expérimentales clés, y compris les populations de cellules immunitaires innées et adaptatives, afin de répondre à des questions biologiquement pertinentes relatives à la pathogenèse de la maladie. De plus, cette méthode permet d’amorcer précisément l’apparition de la maladie et d’obtenir une évolution temporelle expérimentale bien caractérisée. Cela permet l’étude cinétique des caractéristiques cliniques de la progression de la maladie chez la souris. L’inflammation intestinale induite par cette méthode partage de nombreuses caractéristiques avec les MICI humaines, notamment l’inflammation transmurale chronique du gros et de l’intestin grêle, la pathogenèse induite par des cytokines telles que le TNF et l’IL-12, et des symptômes systémiques tels que l’émaciation5. Il s’agit donc d’un système modèle idéal pour étudier la pathogenèse des MICI humaines.
La méthode décrit en détail le protocole d’induction de la colite expérimentale par transfert adoptif de lymphocytes TCD4+CD45RB élevés chez des souris Rag1-/-. Nous abordons les étapes techniques clés, les résultats attendus, l’optimisation et le dépannage. Nous abordons les éléments nécessaires au développement réussi de ce modèle murin d’inflammation intestinale à des fins de recherche.

<table><tbody><tr><td>Nom du réactif/de l’équipement</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires/Description</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm tube à fond rond</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conique</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 Aiguille</td><td>BD Biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conique</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>70 &#956 ; m Filtre cellulaire</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BD IMagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>35602</td><td></td></tr><tr><td>CD4-FITC IgG2b</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td></td></tr><tr><td>CD45RB-PE IgG2a</td><td>BD Pharminogen</td><td>553101</td><td></td></tr><tr><td>Média</td><td></td><td></td> complet <td>RPMI-1640, 1 % Stylo/streptocoque, 10 % FBS, 0,0004 % &beta ;-ME</td></tr><tr><td>Tube FACS + crépine</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr>FBS <td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> inactivé à la chaleur <td>1x PBS, 0,5 % BSA, 2 mM</td></tr><tr><td>EDTA Tampon</td><td></td><td></td> de lyse <td>0,08 % NH4Cl, 0,1 % KHCO3, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris CD4 Kit d’enrichissement des lymphocytes T - DM</td><td>BD Biosciences</td><td>558131</td><td></td></tr><tr><td>souris IgG2a-PE</td><td>BD Pharminogen</td><td>553457</td><td></td></tr><tr><td>souris IgG2b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine, 100X</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705-HC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Média</td><td></td><td></td> de lavage <td>RPMI-1640, 1 % stylo/streptocoque, 0,0004 % &beta ;-ME</td></tr></tbody></table>

induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur cd4<sup&gt; +</sup&gt; cd45rb<sup&gt; haute</sup&gt; t cellules dans des souris immunodéficientes

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Il ya beaucoup de différents modèles animaux disponibles pour étudier la pathogenèse des maladies humaines inflammatoires de l&#39;intestin (MICI), chacun avec ses propres avantages et inconvénients. Nous décrivons ici un modèle de colite expérimentale qui est initié par transfert adoptif de cellules de haute T CD4 + spléniques syngéniques CD45RB dans les souris receveuses déficientes cellules T et B. La haute T population de cellules CD4 + CD45RB qui se compose essentiellement de cellules effectrices naïfs est capable d&#39;induire une inflammation intestinale chronique, ressemblant étroitement à des aspects clés de l&#39;IBD humaine. Cette méthode peut être manipulé pour étudier les aspects apparition et la progression de la maladie. En outre, il peut être utilisé pour étudier la fonction de innée et adaptative, et les populations immunitaires de régulation cellulaire, et le rôle des expositions environnementales, ce est à dire, le microbiote, dans l&#39;inflammation intestinale. Dans cet article, nous illustrons la méthode pour induire une colite avec un protocole étape par étape. Ce incLudes une vidéo de démonstration des aspects techniques clés nécessaires pour développer avec succès ce modèle murin de colite expérimentale à des fins de recherche.

Environ 10 x 10 6 cellules CD4 + CD45RB de 10 rates de souris donneuses adultes C57BL / 6 de haute T sont fiable isolé. Ce nombre varie en fonction de l&#39;âge et de la souche de la souris entre les donateurs et les compétences du chercheur. Lorsque 4 x 10 5 C57BL / 6 cellules CD4 + CD45RB haute T sont transférés dans C57BL / 6 Rag1 - / - souris receveuses, des signes cliniques de la maladie apparaissent autour de la semaine 5 post-ré...

Ici, nous présentons un protocole pour induire une inflammation colique chez la souris par transfert adoptif de lymphocytes Tsyngéniques à haute teneur en CD4+CD45RB dans des receveurs déficients en lymphocytes T et B. Les caractéristiques cliniques et histopathologiques imitent les maladies inflammatoires de l’intestin humain. Cette méthode permet d’étudier l’initiation de l’inflammation colique et la progression de la maladie.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire une inflammation intestinale par transfert adoptif de lymphocytes T naïfs chez des souris immunodéficientes. Cela est réalisé en isolant d'abord des cellules à partir de spléens de souris, en lysant les cellules sanguines, puis en enrichissant la population en lymphocytes T CD four positifs. La deuxième étape consiste à marquer ces cellules avec des anticorps fluorescents DI conjugués anti-CD four et anti-CD 45 RB.Ensuite, les cellules marquées sont triées à l'aide d'un cytomètre en flux en populations CD 45, RB faible et CD 45 RB élevée. La dernière étape consiste à transférer les cellules CD 45 RB élevées dans des souris immunodéficientes par injection intrapéritonéale. En fin de compte, les cellules transférées s'activent et provoquent des lésions tissulaires locales en l'absence de cellules T régulatrices, entraînant une colite expérimentale.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude des maladies inflammatoires de l'intestin, comme le rôle de populations cellulaires spécifiques et de la microflore gastro-intestinale dans la pathogenèse de la maladie. Après l'euthanasie de la souris donneur, vaporisez l'abdomen avec de l'éthanol à 70 % pour stériliser la zone. Ensuite, effectuez une incision horizontale dans l'abdomen et retirez la peau à l'aide d'une pince pour exposer le péritoine.Tenez le péritoine éloigné des organes internes et pratiquez une incision dans le péritoine abdominal gauche. Ensuite, excisez la rate de la souris et placez-la dans une boîte de Pétri contenant 10 millilitres de milieu complet glacé. Écrasez la rate à l’aide de deux lames de verre stériles afin d’obtenir une suspension monocellulaire.Filtrer les cellules à travers un tamis de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres, puis rincer le tamis avec cinq millilitres de milieu complet. Tamiser jusqu'à cinq spléens dans un seul tube conique. Ensuite, centrifuger les cellules à 450 ×g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer le surnageant dans un récipient pour déchets, puis redisperser délicatement les cellules dans 10 millilitres de tampon de marquage glacé.Combiner 20 microlitres de la suspension cellulaire avec 180 microlitres de solution de bleu de trypan à 0,4 % et incuber les cellules pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, ajouter 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un hémocytomètre et compter le nombre de cellules non colorées au microscope pour commencer le culot d'enrichissement, puis resuspendre délicatement les cellules dans du tampon d'étiquetage glacé à une concentration de 20 × 10⁶ cellules par millilitre. Ajouter 5 microlitres d'anticorps d'enrichissement des lymphocytes T CD4 biotinylé par 1 × 10⁶ cellules, puis incuber les cellules sur glace avec l'anticorps pendant 15 minutes.Ajoutez un volume de tampon de marquage 10 fois supérieur à celui de la suspension cellulaire, puis centrifugez les cellules à 450 ×g pendant sept minutes. Aspirez soigneusement le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Ensuite, remettez en suspension les particules magnétiques conjuguées à la streptavidine par vortexage, puis ajoutez cinq microlitres de particules par 1 × 10⁶ cellules aux cellules.Mélangez les particules avec les cellules en tapotant doucement le tube, puis incubez le mélange à une température de six à douze degrés Celsius pendant 30 minutes. Resuspendez les cellules à une concentration de 20 à 80 fois 10⁶ cellules par millilitre dans du tampon d'étiquetage. Ensuite, transférez un millilitre de cellules marquées dans un tube à fond rond de 12 millimètres sur 75 millimètres et placez ce tube contenant la fraction positive sur un aimant pendant six à huit minutes.Avec le tube sur l'aimant, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre sans perturber les cellules marquées, puis transférez-le dans un nouveau tube conique stérile de 50 millilitres. Cette fraction contient les lymphocytes T CD4 positifs. Retirez le tube de la fraction positive de l’aimant et remettez les cellules en suspension dans le tampon de marquage en pipetant vigoureusement.Replacer le tube sur l'aimant pendant six à huit minutes supplémentaires. Transférer à nouveau soigneusement le SUP nain dans le tube contenant la fraction enrichie. Augmenter le rendement des cellules T CD4 positives en répétant l'enrichissement selon les besoins afin de préparer les cellules pour le marquage. Centrifuger d'abord la fraction enrichie à 450 ×g pendant sept minutes et éliminer le surnageant.Ensuite, resuspendre les cellules dans du tampon d'étiquetage à une concentration de 10 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre. Répartir 5 fois 10 à la puissance 5 cellules dans des tubes microfuge individuels pour les cellules témoins non marquées, marquées à l'isotope et simplement marquées. Puis ajouter 5 microgrammes par millilitre d'anticorps CD4-FE et 1 microgramme par millilitre d'anticorps CD45RB-PE dans le tube contenant la suspension cellulaire initiale.Ajoutez les colorations témoins isotopiques et les colorations simples aux aliquotes cellulaires appropriées, à la même concentration. Mélangez délicatement les cellules avec les anticorps, puis incubez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Couvrez les tubes afin de les protéger de la lumière.Ensuite, laver les cellules deux fois dans le tampon de marquage comme indiqué dans le protocole et resuspendre les cellules à une concentration de 10 fois 10 puissance 6 cellules par millilitre dans le tampon de marquage. Puis passer la suspension cellulaire à travers un tamis de 70 micromètres dans un tube FACS. Placer le tube sur de la glace et le couvrir pour éviter le photoblanchiment des colorants.Utilisez les cellules témoins non colorées et à un stade unique pour étalonner la compensation sur le trieur de cellules. Excluez les cellules non viables à l’aide du fenêtrage en diffusion avant et latérale. Ensuite, définissez le fenêtrage pour les cellules positives pour CD quatre et les cellules positives pour CD quatre RB à l’aide des témoins colorés à l’isotope.Porte suivante, la population positive pour le CD4, puis trier les cellules en populations CD45, RB élevée et CD45, RB faible. Récupérer les cellules dans des tubes contenant deux millilitres de milieu complet, puis analyser un aliquot d'environ 10 fois 10 à la puissance 3 cellules de chaque fraction sur le trieur cellulaire pour évaluer la pureté de l'échantillon. Préparer les cellules CD45 RB élevée et CD45 RB faible pour l'injection, les laver et les resuspendre dans du PBS à la densité cellulaire appropriée, comme indiqué dans le protocole écrit. Ensuite, immobiliser fermement la souris receveuse et injecter 100 microlitres de la suspension cellulaire par voie intrapéritonéale dans les côtés droit et gauche de l'abdomen.Surveiller les souris receveuses pour les paramètres cliniques indiqués dans le protocole textuel chaque semaine. La progression de la maladie après l'injection est généralement apparente à la cinquième semaine. Sacrifier une souris à un moment prédéterminé ou lorsqu'elle a perdu 20 % de son poids corporel initial et extraire le côlon.Ensuite, mesurez et enregistrez la longueur et le poids du côlon. Des cellules T CD4 positives CD45RB élevées ont été transférées à des souris receveuses knock-out pour rag1 et double knock-out pour NFIL3 et RAG1, cinq semaines après l'injection. Les souris double knock-out avaient perdu 10 % de leur poids corporel initial, ainsi que les côlons des souris knock-out pour rag1 et des souris double knock-out.Les souris receveuses présentaient des colonnes épaissies et raccourcies par rapport à celles des souris témoins CD4 positives CD45RB élevées transférées chez des souris receveuses knock-out rag1 et chez des souris receveuses knock-out rag1 P110δ mutantes. Une analyse histologique réalisée trois semaines après le transfert a révélé une hyperplasie épithéliale, des infiltrats de cellules inflammatoires et des abcès cryptiques chez les receveuses knock-out rag1 mutantes δ, mais pas chez les souris knock-out rag1. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à six heures si elle est effectuée correctement.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous détaillons une méthode pour l'isolement rapide des cellules dendritiques de souris intestinales (DCS) et les macrophages. Caractérisation phénotypique des CD intestinales et les macrophages est effectuée en utilisant plusieurs couleurs d'écoulement analyse cytométrique tandis magnétique enrichissement bourrelet suivie par tri cellulaire est utilisé pour donner des populations de grande pureté pour des études fonctionnelles.

L&#39;isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de l&#39;intestin de souris

Cette vidéo démontre l’induction de la maladie du greffon intestinal contre l’hôte, GvHD, chez une souris receveuse irradiée létalement à l’aide de cellules souches hématopoïétiques allogéniques allogéniques et de lymphocytes T alloréactifs spléniques induisant la GvHD. Ce protocole permet d’établir un modèle de GvHD intestinale aiguë sévère afin de comprendre le mécanisme de la maladie et de développer des options thérapeutiques innovantes.

Induction de la maladie du greffon contre l’hôte dans des modèles murins par greffe allogénique de moelle osseuse et de cellules spléniques

Nous fournissons une méthode reproductible pour induire un diabète de type 1 (DT1) chez la souris dans les deux semaines par le transfert adoptif de l'îlot spécifiques de l'antigène, CD4 + primaires des cellules T.

Accélération de diabète de type 1 chez la souris par induction transfert adoptif de lymphocytes CD4 + T Cells diabétogéniques

Dans ce modèle de colite induite par antigène, les lymphocytes T CD4+ OT-II exprimant une protéine fluorescente rouge ont été transférés adoptivement dans des souris RAG-/- qui expriment une protéine fluorescente verte dans des phagocytes mononucléaires (MP). Les hôtes ont été mis au défi par Escherichia coli (E. coli) exprimant la protéine ovalbumine (OVA) fusionnée à une protéine fluorescente cyan (CFP).

Développement d&#39;un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d&#39;antigènes aux cellules T

Nous décrivons ici un modèle de souris rapporteure transgénique pour visualiser les cellules productrices d’IL-22 à l’intérieur de différents tissus de souris. Cette méthode peut être utilisée pour suivre l’emplacement d’autres cytokines ou protéines de secrétaire chez la souris.

Visualisation de l&#39;IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

Nous présentons ici un protocole qui décrit l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et permet répétitives évaluations mini-endoscopique du côlon distal in situ pour la présence, les caractéristiques et gravité de l’inflammation du côlon dans live souris souffrant d’intestinal graft - versus - host disease.

Induction of Intestinal Graft - versus - host Disease and son évaluation endoscopique Mini souris vivantes

Dans ce protocole, un modèle de colite adoptive de transfert de lymphocytes T spécifiques à l’antigène du microbiote intestinal est décrit. Les lymphocytes T CD4+ sont isolés à partir de souris transgéniques TCR CBir1. Ceux-ci sont spécifiques pour un antigène immunodominant du microbiote intestinal CBir1 flagellin, qui est transféré dans les souris Rag1-/- receveuses, entraînant une inflammation intestinale.

Induction de l’inflammation intestinale par transfert adoptif de lymphocytes T CD4+ transgéniques CBir1 TCR à des souris immunodéficientes

L’interaction de la susceptibilité génétique, de l’immunité muqueuse et de l’environnement microécologique intestinal est impliquée dans la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Dans cette étude, nous avons appliqué la transplantation de microbiote fécal à des souris déficientes en IL-10 et étudié son impact sur l’inflammation colique et la fonction cardiaque.

Évaluation thérapeutique de la transplantation de microbiote fécal dans un modèle murin déficient en interleukine 10

L’étude démontre le rôle de la peau dans la modulation des réponses immunitaires chez la souris par l’immunisation épicutanée (EC). L’immunisation par EC avec un antigène protéique peut supprimer les réponses immunitaires en cas d’hypersensibilité de contact ou inverser la suppression induite par la peau lorsqu’elle est associée à des profils moléculaires associés à des agents pathogènes. L’immunisation EC est prometteuse en tant qu’approche efficace et sans aiguille de l’immunothérapie.

Modèle murin d’immunomodulation induite par l’épi-peau

Ici, nous rapportons un protocole établissant un modèle murin de polyarthrite rhumatoïde (PR) par transfert adoptif de lymphocytes T CD4+ de souris SKG, fournissant un outil expérimental rapide et fiable pour étudier les mécanismes immunologiques, la progression pathologique et le développement de nouveaux traitements pour la PR.

Un modèle de transfert adoptif de la polyarthrite rhumatoïde chez la souris

Découvrez l'induction d'inflammation intestinale chez la souris par transfert adoptif de cellules T CD4+ CD45RBhigh. Cette méthode reproduit les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin humain pour étudier la pathogenèse et tester de nouvelles thérapies.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4 + CD45RB Haute T cellules dans des souris immunodéficientes (Vidéo) | JoVE Journal

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4

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