Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4 ⁺ CD45RB ^Haute T cellules dans des souris immunodéficientes

L’objectif global de cette procédure est d’induire une inflammation intestinale par le transfert adoptif de lymphocytes T naïfs chez des souris immunodéficientes. Pour ce faire, on isole d’abord des cellules de rates de souris, on lyse les cellules sanguines, puis on enrichit la population pour les lymphocytes T positifs à la maladie de Crohn. La deuxième étape consiste à marquer ces cellules avec des anticorps CD quatre et CD 45 RB conjugués à la DI fluorescente.

Ensuite, les cellules marquées sont triées à l’aide de faits en populations CD 45, RB faible et CD 45 RB élevé. La dernière étape consiste à transférer les cellules supérieures de CD 45 RB dans des souris immunodéficientes par injection intrapéritonéale. En fin de compte, les cellules transférées sont activées et causent des lésions tissulaires locales en l’absence de cellules T régulatrices, ce qui entraîne une colite expérimentale.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin, telles que le rôle de populations cellulaires spécifiques et du microbiote gastro-intestinal dans la pathogenèse de la maladie. Après avoir euthanasié la souris donneuse, vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % pour stériliser la zone. Ensuite, faites une incision horizontale sur l’abdomen et retirez la peau pour exposer le péritoine à l’aide d’une pince.

Tenez le péritoine à l’écart des organes internes et faites une incision dans le péritoine abdominal gauche. Ensuite, excisez la rate de la souris et placez-la dans une boîte de Pétri contenant 10 millilitres de milieu complet et glacé. Broyez la rate avec deux lames de verre stériles pour former une suspension unicellulaire.

Filtrez les cellules à travers une passoire de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres, puis rincez la crépine avec cinq millilitres de déformation moyenne complète jusqu’à cinq rates dans un tube conique. Ensuite, centrifugez les cellules à 450 fois G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant dans un conteneur à déchets, puis remettez doucement les cellules en suspension dans 10 millilitres de tampon d’étiquetage glacé.

Combinez 20 microlitres de suspension cellulaire avec 180 microlitres de solution de bleu trian à 0,4 % et incubez les cellules pendant cinq minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite 10 microlitres de suspension cellulaire dans un hémocytomètre et comptez le nombre de cellules non bleues au microscope pour commencer la pastille d’enrichissement et réanimez doucement les cellules dans un tampon d’étiquetage à froid à une concentration de 20 fois 10 à six cellules par millilitre. Ajoutez cinq microlitres d’anticorps d’enrichissement des lymphocytes T CD biotinylés par un fois 10 aux six cellules, puis incubez les cellules sur de la glace avec l’anticorps pendant 15 minutes.

Ajoutez 10 fois le volume de tampon de marquage à la suspension de cellules, puis centrifugez les cellules à 450 fois G pendant sept minutes. Aspirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Ensuite, mettez en suspension les particules magnétiques conjuguées à la streptavidine par vortex et ajoutez cinq microlitres de particules par un fois 10 aux six cellules des cellules.

Mélangez les particules avec les cellules en effleurant doucement le tube, puis incubez le mélange à une température de six à 12 degrés Celsius pendant 30 minutes. Remettez les cellules en suspension à une concentration de 20 à 80 fois 10 à six cellules par millilitre avec tampon de marquage. Transférez ensuite un millilitre de cellules marquées dans un tube à essai à fond rond de 12 millimètres sur 75 millimètres et placez ce tube à fraction positive sur un aimant pendant six à huit minutes.

Avec le tube sur l’aimant, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette à pâte en verre sans déranger les cellules marquées et transférez-le dans un nouveau tube conique stérile de 50 millilitres. Cette fraction contient les quatre lymphocytes T positifs du CD. Retirez le tube à fraction positive de l’aimant et remettez les cellules en suspension dans le tampon de marquage en pipetant vigoureusement.

Remettez le tube dans l’aimant pendant encore six à huit minutes. Encore une fois, transférez soigneusement le SUP nain dans le tube de fraction enrichi. Augmentez le rendement des cellules T CD quatre positives en répétant l’enrichissement si nécessaire pour préparer les cellules au marquage : centrifugez d’abord la fraction enrichie à 450 fois G pendant sept minutes et jetez le surnageant.

Ensuite, mettez les cellules en suspension dans le tampon d’étiquetage à une concentration de 10 fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Aliquote cinq fois 10 des cinquièmes cellules dans des tubes de micro-fuge individuels pour des cellules de contrôle non colorées par des isotopes et des cellules de contrôle monocolorées. Ajoutez ensuite cinq microgrammes par millilitre de CD 4, FE et un microgramme par millilitre d’anticorps CD 45 RB PE dans le tube contenant la suspension cellulaire d’origine.

Ajouter les colorants de contrôle isotopique et les colorants simples à la même concentration aux aliquotes cellulaires appropriées. Mélangez doucement les cellules avec les anticorps, puis incubez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Couvrez les tubes pour les protéger de la lumière.

Ensuite, lavez les cellules deux fois dans le tampon d’étiquetage comme indiqué dans le protocole textuel et suspendez à nouveau les cellules à 10 fois 10 des six cellules par millilitre dans le tampon d’étiquetage. Ensuite, passez la suspension cellulaire à travers une passoire de 70 microns dans un tube de télécopie. Placez le tube sur de la glace et couvrez-le pour éviter le blanchiment photo des taches.

Utilisez les cellules de contrôle non colorées et à un étage pour calibrer la compensation sur le trieur de cellules. Excluez les cellules non viables à l’aide de portes diffusées vers l’avant et sur les côtés. Ensuite, réglez le gate pour les cellules CD quatre positives et CD quatre RB positives avec les commandes colorées aux isotopes.

Prochaine étape, la population CD quatre positive, puis triez les cellules en populations CD 45, RB élevée et CD 45 RB faible. Prélever les cellules dans des tubes contenant deux millilitres de milieu complet, puis effectuer une aliquote d’environ 10 fois 10 dans les troisièmes cellules de chaque fraction sur le trieur de cellules pour évaluer la pureté de l’échantillon, préparer les cellules CD 45 RB hautes et CD 45 RB basses pour le lavage par injection, puis les remettre en suspension dans le PBS à la densité cellulaire appropriée, comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, retenez fermement la souris receveuse et injectez 100 microlitres de suspension cellulaire intrapéritonéale dans les côtés droit et gauche de l’abdomen.

Surveillez chaque semaine les souris receveuses pour les paramètres cliniques indiqués dans le protocole textuel. La progression de la maladie après l’injection est généralement apparente à la cinquième semaine. Sacrifiez une souris à un moment prédéterminé ou lorsqu’elle a perdu 20 % de son poids corporel de départ et extrayez le côlon.

Ensuite, mesurez et notez la longueur et le poids du côlon. Cinq semaines après l’injection, des cellules T positives de CD 45 RB ont été transférées à des souris receveuses knock-out et NFIL, trois RAG, un double knockout. Les souris Double Knockout avaient perdu 10 % de leur poids corporel initial, les deux-points de Rag One Knockout et Double Knockout.

Les souris receveuses ont été épaissies et raccourcies par rapport aux côlons des souris témoins CD quatre cellules T élevées positives de CD 45 RB pour un transfert vers des souris receveuses knock-out et une souris receveuses knock-out P one 10 delta mutantes L’analyse histologique trois semaines après le transfert a indiqué une hyperplasie épithéliale, des infiltrats de cellules inflammatoires et des abcès de crypte chez les receveurs de mutants delta knock-out, mais pas de souris knock-out une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en quatre à six heures si elle est correctement exécutée.