Élaboration d'un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d'un vecteur viral adéno-associé recombinant

L’objectif global de cette procédure est de développer un modèle animal basé sur un vecteur viral pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique dans le système nerveux central. Cette méthode peut être utilisée pour développer des modèles animaux normaux qui permettent des tests précliniques de médicaments et peut être bénéfique dans l’étude du mécanisme moléculaire de la maladie de Parkinson ainsi que de nombreux autres troubles neurodégénératifs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour cibler spécifiquement des régions du cerveau.

Une expression cérébrale élevée peut être obtenue et peut être utilisée pour créer des modèles animaux dans des souches et des espèces animales spécifiques. Les différents systèmes vectoriels finaux ont été développés. Le choix du système vectoriel dépend de la taille de la tranchée que vous souhaitez exprimer, de la durée de l’expression des gènes, des sons que vous souhaitez cibler et des questions de biosécurité.

La démonstration de la procédure sera assurée par Annelies Aertgeerts, une technicienne de notre laboratoire. Commencez par anesthésier correctement une chatte Wistar âgée de huit semaines selon les protocoles approuvés. Vérifiez qu’un plan chirurgical d’anesthésie a été réalisé en serrant chaque patte et en notant l’absence de réflexe de retrait.

Ensuite, utilisez un implanteur de microtranspondeur pour placer un microtranspondeur sur le dos du rat. Vérifiez que le MicroTranspondeur est correctement positionné et qu’il est possible d’obtenir un affichage. Coupez maintenant les cheveux sur le cuir chevelu du rat et appliquez un anesthésique local sur le cuir chevelu et les oreilles.

Transférez le rat dans une hotte à flux laminaire et effectuez le reste de la procédure en utilisant une technique aseptique. Placez le rat dans le cadre stéréotaxique, en fixant les barres d’oreille, puis la barre buccale et nasale. Couvrez le corps du rat avec une couverture en papier pour éviter une baisse de la température corporelle.

Appliquez un lubrifiant oculaire pour éviter que les yeux ne se dessèchent. Ensuite, désinfectez le cuir chevelu selon les procédures approuvées. Un pour cent d’iode dans 70 % d’isopropyle est utilisé ici.

Après avoir fait une petite incision sur la ligne médiane du cuir chevelu, grattez doucement les membranes du crâne et rincez avec une solution saline. Après avoir laissé sécher le crâne, assurez-vous que le bregma et le lambda sont clairement visibles. Maintenant, remplissez une seringue de micro-injection de 10 microlitres, de calibre 30 et de 20 milomètres avec de l’AAV recombinant et placez-la sur la pompe de micro-injection motorisée connectée à l’instrument stéréotaxique.

Pour une transaction spécifique des neurones dopaminergiques de la substance noire, les vecteurs AV recombinants sont le premier choix en raison de leurs titres élevés et de leur efficacité à transduire les neurones dopaminergiques. Testez l’écoulement, en libérant une goutte d’AAV. Jetez tout AAV libéré dans un détergent de nettoyage polyvalent.

Vérifiez visuellement que la tête est fixée bien droite dans le cadre de la tête. Vérifiez ensuite que le crâne est plat, en déplaçant d’abord la pointe de l’aiguille vers le bregma et en mesurant la hauteur à cet endroit, en abaissant la pointe de l’aiguille dans le sens dorsal-ventral jusqu’à ce qu’elle touche le crâne. Répétez la procédure à lambda.

Après avoir ramené l’aiguille dans le bregma, déplacez l’aiguille dans la direction avant-postérieure et latérale médiale jusqu’aux coordonnées stéréotaxiques pour la microinjection. Notez les coordonnées. Au site d’injection, mesurez la hauteur du crâne comme précédemment, et assurez-vous qu’elle ne diffère pas de plus de 0,3 mm de la hauteur du bregma.

Ensuite, percez soigneusement un trou de deux millimètres dans le crâne. Une fois le trou percé, mesurez la hauteur de la dure-mère pour déterminer la référence à partir de laquelle appliquer la coordonnée dorsale-ventrale. Pénétrez la dure-mère à l’aide d’une aiguille de calibre 26.

Absorbez tout sang avec le tissu stérile et ne procédez qu’après l’arrêt de tout saignement. Abaissez maintenant lentement l’aiguille de la seringue de micro-injection préchargée dans le cerveau jusqu’à la coordonnée dorsale-ventrale. Et faites une pause d’une minute.

Injectez ensuite trois micro-litres d’AAV à raison de 0,25 micro-litres par minute. Après l’injection, laissez l’aiguille en place pendant encore cinq minutes pour éviter le reflux le long du chemin de l’aiguille avant de la retirer lentement. Cousez le cuir chevelu à l’aide de polyester tressé codé 3.0 et désinfectez la peau avec un pour cent d’iode et 70 % d’isopropyle.

Desserrer la barre du nez et de la bouche, puis les deux barres d’oreille, pour retirer délicatement l’animal de l’instrument stéréotaxique. À ce moment, administrez une analgésie et, si nécessaire, un agent d’inversion de l’anesthésie. Placez ensuite le rat dans une cage propre sur une plaque chauffante réglée à 38 degrés Celsius et surveillez de près jusqu’à ce qu’il se réveille.

Après la chirurgie, la cinétique de la neurodégénérescence peut être étudiée chez l’animal entier à l’aide de tests comportementaux et d’imagerie TEP et, après sacrifice, à l’aide de techniques immunohistochimiques. Le test du cylindre pour évaluer l’utilisation spontanée des membres antérieurs a été effectué à différents moments après la micro-injection d’AAV recombinant exprimant la mutation A53T alpha synucléine dans la substance noire. À partir de trois semaines après l’injection, une déficience motrice significative a été observée chez les rats ayant reçu la dose médiane.

Quatre semaines après l’injection, une diminution de 50 % de l’utilisation controlatérale spontanée de la patte avant a été observée. Alors que les animaux témoins injectés par eGFP n’ont montré aucune asymétrie dans l’utilisation de la patte avant. Les rats qui ont reçu une dose plus élevée de synucléine alpha recombinante AAV 2/7A53T ont montré une altération plus prononcée de l’utilisation de la patte avant 29 jours après l’injection.

Pour prouver que la déficience motrice observée était dépendante de la dopamine, une dose unique de L-doba a été administrée. Lorsque le test du cylindre a été répété 45 minutes après le traitement à la L-dopa, une récupération complète de l’utilisation de la patte avant chez les animaux recombinants injectés d’alpha synucléine AAV 2/7A53T a été observée. Pour suivre la cinétique de la neurodégénérescence dopaminergique nigrostriatale non invasive au fil du temps, chez des animaux individuels, la liaison transportée par la dopamine a été quantifiée à l’aide de la tomographie par émission de positrons chez de petits animaux avec le F-18FECT comme radioligand.

La liaison au DAT a significativement diminué dans le budiman caudé ipsilatéral de rats recombinants AAV 2/7A53T alpha synucléine injectés au fil du temps. Après 32 jours, une diminution de la liaison DAT allant jusqu’à 85 % a été observée. En tant que témoin positif, l’injection de la neurotoxine 6 OHDA dans le SN a induit une perte de 90 % de la liaison DAT en sept jours.

Des sections cérébrales de rats micro-injectées avec de la synucléine alpha recombinante AAV 2/7A53T au fil du temps ont été immunomarquées pour la tyrosine hydroxylase, un marqueur des neurones dopaminergiques. Cette figure démontre la perte progressive de neurones dopaminergiques sur une période de 29 jours après la micro-injection. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 45 minutes.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser des correspondances vectorielles finales de haute qualité. Suite à cette procédure, d’autres techniques, telles que l’imagerie TEP non invasive, l’analyse comportementale et l’analyse immunohistochimique, peuvent être effectuées afin de déterminer le niveau de neurodégénérescence et de neuropathologie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’effectuer une injection de vecteur viral dans la substance noire afin de développer des modèles animaux basés sur des vecteurs viraux pour la maladie de Parkinson.

N’oubliez pas que travailler avec des vecteurs viraux peut être dangereux et que des précautions telles que le travail sous flux laminaire et une décontamination appropriée des déchets doivent toujours être prises en suivant cette procédure.