Name: Élaboration dun modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique dun vecteur viral adéno-associé recombinant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Découvrez comment créer un modèle de rat pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique de vecteur viral AAV dans la substantia nigra. Cette méthode permet l'expression ciblée de l'alpha-synucléine et facilite les tests précliniques de thérapies.

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Les auteurs remercient Joris Van Asselberghs et Ann Van Santvoort pour leur excellente assistance technique. La recherche a été financée par l&#39;IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), le FWO Vlaanderen (G.0768.10), par le programme CE-FP6 &#39;DiMI&#39; (LSHB-CT-2005-512146), le projet FP7 MEFOPA RTD (SANTÉ -2009 à 241791), le programme FP7 &#39;inmind&#39; (SANTÉ-F2-2011-278850), la KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), et le Fondation MJFox (validation Cible 2010). A. Van der Perren et C. Casteels sont un des boursiers postdoctoraux du Fonds flamand de la recherche scientifique. K. Van Laere est un compagnon clinique principal du Fonds flamand de la recherche scientifique.

Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées conformément aux Communautés européennes Directive du Conseil du 24 Novembre 1986 (86/609 / CEE) et approuvés par le Comité de bioéthique de l&#39;Université de Louvain (Belgique). 1. AAV recombinant Production et purification Remarque: la production du vecteur rAAV et la purification a été effectuée par le Leuven vecteur viral de base (LVVC) comme décrit précédemment 17. <ol><li> En bref, transfecter subconfluent faible (&lt;50), le passage des cellules HEK 293T adhérentes au moyen d&#39;un 25kD linéaire polyéthylènimine 150 de solution de transfection nM de NaCl et trois plasmides différents dans un rapport de 1: 1: 1 dans du milieu DMEM 2% de sérum bovin foetal. Après 24 heures d&#39;incubation à 37 ° C dans 5% de CO 2, remplacer le milieu par du milieu DMEM frais 2% de sérum de fœtus bovin. Nota: Les plasmides comprennent les produits d&#39;assemblage pour le sérotype VAA7, le plasmide de transfert de l&#39;AAV codant pour le mutant A53T humain α SYN sous le contrôle de l&#39;CMVIE renforcée synapspromoteur in1 et pAdvDeltaF6 adénoviral plasmide auxiliaire 17. </li><li> Récolter les 5 moyennes jours après transfection transitoire et on concentre en utilisant une filtration à flux tangentiel 17. </li><li> Purifier le vecteur rAAV particules du milieu concentré en utilisant un iodixanol étape gradient 17. </li><li> Utilisez des techniques standard de PCR en temps réel pour la copie génomique (GC) détermination. Dans ce protocole, un titre de vecteur de 3,0 E11 GC / ml a été utilisée pour développer un modèle de rat en fonction α-SYN pour PD 17. </li></ol> 2. Injection stéréotactique de rAAV α-SYN dans le vecteur SN du rat (figure 2) <ol><li> Maison huit semaines vieux rats Wistar femelles pesant environ 200-250 g sous 12 h cycle lumière / obscurité normale avec un accès libre à la nourriture et à granulés l&#39;eau du robinet. </li><li> Soumettre le rat par voie intrapéritonéale (ip) une anesthésie contenant un mélange de kétamine (60 mg / kg) et de médétomidine (0,4 mg / kg). Une fois que le rat est anesthésié et ne réagit pasquand serrant les différentes pattes, administrer une voie sous-cutanée micro-transpondeur sur le dos du rat pour une reconnaissance supplémentaire en utilisant un implanteur micro-transpondeur. Vérifiez si le micro-transpondeur est positionné correctement et peut être lu par le dispositif de lecture. </li><li> Couper les cheveux sur le dessus du cuir chevelu. Appliquer un anesthésique local à la fois sur le cuir chevelu et les oreilles. Effectuer le reste de la procédure chirurgicale sous un flux laminaire en utilisant des techniques aseptiques. </li><li> Placez les rats dans un cadre de tête stéréotaxique utilisant deux barres d&#39;oreilles, une bouche et une barre de nez. Recouvrir le corps du rat avec une couverture en papier pour éviter une baisse de la température corporelle. Appliquer un lubrifiant oculaire pour empêcher les yeux de sécher. </li><li> Désinfecter le cuir chevelu avec jodium 1% dans de l&#39;isopropanol 70% et faire une petite incision sur la ligne médiane du cuir chevelu. racler délicatement pour enlever les membranes sur le crâne et rincer avec une solution saline. Laissez le crâne sec pendant plusieurs minutes. Observer les sutures crâniennes et les deux points de référence: bregma et Lambda. </li&gt; <li> Pour injecter le vecteur rAAV dans le SN, définir les coordonnées vers bregma (antéropostérieur: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm et dorso-ventral: 7,2 mm calculées à partir de la dure-mère). Remarque: Les coordonnées tridimensionnelles pour chaque région d&#39;intérêt peuvent être calculées à l&#39;aide d&#39;un atlas stéréotaxiques du cerveau de rat, en appliquant Bregma comme point de référence anatomique. </li><li> Remplir une seringue de microinjection 10 ul (30 gauge 20 mm) avec un vecteur de rAAV et le placer dans l&#39;instrument stéréotaxique relié à une pompe à micro-injection motorisée. Contrôlez le volume en libérant une goutte de vecteur et d&#39; éliminer dans un détergent de nettoyage polyvalent pH 9 (par exemple RBS). </li><li> vérifier visuellement si la tête est fixée directement dans le cadre de la tête et d&#39;évaluer l&#39;axe gauche-droite. Soigneusement définir visuellement les coordonnées antéropostérieur et médio pour bregma et Lambda et mesurer leur hauteur à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 30 à 20 mm dans le bras dorso-ventral du cadre stéréotaxique. <ol><li> Autoriser amaximum de 0,3 mm de différence de hauteur entre bregma et Lambda. Placez l&#39;aiguille sur bregma et appliquer la face et coordonnées médio en déplaçant le antéropostérieur et le bras mediolateral du cadre stéréotaxique. </li></ol></li><li> A l&#39;endroit de l&#39;injection, mesurer la hauteur du crâne et veiller à ce qu&#39;elle ne diffère pas de plus de 0,3 mm de la hauteur du bregma. Percer un trou dans le crâne avec un diamètre d&#39;environ 2 mm. Mesurer la hauteur de la dure, cela va servir de référence pour appliquer la dorso-ventral de coordonnées. Vous pouvez soustraire une épaisseur fixe pour le crâne (0,9 mm). </li><li> Pénétrer la dure en utilisant une aiguille de calibre 26 et d&#39;absorber le sang avec un tissu stérile. Attendre jusqu&#39;à ce que tout saignement a cessé avant de poursuivre. </li><li> Insérez lentement la microinjection seringue de 10 ul pré-chargé avec une solution de vecteur dans le cerveau à la profondeur prédéterminée (dorso-ventral de coordonnées). Attendre 1 min avec l&#39;aiguille en place. Injecter 3 pide la solution de vecteur (3,0 E11 génome copies / ml (dose de vecteur moyen) ou 1,0 E12 GC / ml (dose élevée de vecteur) de rAAV2 / 7 α-SYN ou eGFP vecteur de contrôle) en utilisant la pompe de microinjection motorisé avec un débit de 0,25 ul / min. </li><li> Après l&#39;injection, maintenir l&#39;aiguille en place pendant 5 min avant de le retirer lentement. Piquez le cuir chevelu en utilisant enduit polyester tressé 3.0, désinfecter avec 1% jodium dans 70% d&#39;isopropanol et retirez délicatement l&#39;animal de l&#39;instrument stéréotaxique. Tout d&#39;abord desserrer la barre de nez et la bouche, puis les deux barres d&#39;oreilles. </li><li> Pour inverser l&#39;anesthésie, injecter le rat par voie intrapéritonéale avec 0,5 mg / kg atipamezole et placer le rat dans une cage propre sur une plaque de chauffage de 38 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il se réveille. Couvrir le rat avec une couverture en papier pour empêcher une chute de la température corporelle. </li><li> Fournir un accès facile à la nourriture et de l&#39;eau pendant les premières heures. Surveiller le rat pendant les premiers jours. Si nécessaire, appliquer une analgésie. Remarque: Il n&#39;y a pas besoin d&#39;enlever les points de suture de til crâne. Après 1-2 semaines, le crâne est complètement réparé et les stiches se détacher. </li></ol> 3. Évaluation des rAAV2 / 7 α-SYN Rats injecté à l&#39;aide non-invasive PET Imaging, Tests du comportement et de l&#39;analyse immunohistochimique <ol><li> Pour faire suite à la cinétique de dopaminergique nigro neurodégénérescence effractive non au fil du temps chez les animaux individuels, quantifier transporteur de la dopamine (DAT) de liaison utilisant la tomographie petits animaux tomographie par émission (PET) et un traceur de DA Transporter par exemple [18 F] -Fect 16 . </li><li> Pour examiner si le niveau de dopaminergique neurodégénérescence est suffisante pour induire une déficience motrice chez les rats, les rats soumettre à l&#39;épreuve de la bouteille pour évaluer l&#39;utilisation de forelimb spontanée. <ol><li> Placez le rat dans une largeur de 20 cm clair cylindre de verre et de filmer le comportement lors des mouvements verticaux le long du mur et à l&#39;atterrissage après une arrière. Note le nombre de contacts établis par chaque patte pour un total de 20Contacts. Pour une description détaillée des critères de notation voir Schallert et al. 18 exprimer le nombre de contacts forelimb avec facultés affaiblies (par exemple des pattes avant gauche) en pourcentage de contacts de forelimb totaux ( de gauche , plus forepaw droite). Remarque: les rats témoins non lésés à l&#39;aide de deux pattes aussi devraient marquer environ 50% dans ce test. </li></ol></li><li> Effectuer histochimie (IHC), une analyse immunohistochimique pour évaluer le niveau d&#39;expression du transgène et la perte de cellules dopaminergiques. <ol><li> A différents stades finaux, sacrifiez les rats avec une dose excessive de pentobarbital sodique (60 mg / kg, ip) et effectuer une perfusion intracardiaque avec du sérum physiologique froid suivi de 4% de paraformaldehyde dans du PBS 19. Fixer les cerveaux nuit à 4 ° C et couper 50 um sections coronales de cerveau épais en utilisant un microtome vibrant. </li><li> Effectuer la coloration IHC sur les sections flottantes utilisant des anticorps contre α-SYN et de la tyrosine hydroxylase pour analyser les niveaux d&#39;expression α-SYN et le chiervel de neurodégénérescence 16. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;il n&#39;y a pas de conflit réel ou potentiel d&#39;intérêt.

Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. Le titre du vecteur, ainsi que la pureté du vecteur influence directement le résultat phénotypique du modèle. Les titres de vecteur excessifs ou lots de vecteurs insuffisamment purifiés peuvent entraîner une toxicité non spécifique. Par conséquent, l&#39;utilisation de lots de vecteurs de haute qualité et des vecteurs de contrôle appropriés est indispensable. En outre, le positionnement exact de la tête du rat dans le cadre stéréotaxique et une détermination précise d...

Pour étudier la physiopathologie de PD et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il y a un besoin urgent de modèles animaux qui ressemblent étroitement les symptômes neuropathologie, physiologie et moteur de PD humaine. La valeur prédictive plus élevée, mieux nous pouvons traduire de nouvelles thérapies de modèles animaux pour les patients. La découverte de l&#39;alpha-synucléine (α-SYN) comme premier gène PARK en 1997 a conduit au développement des premiers modèles pharmacodynamiques génétiques. Beaucoup de souris transgéniques surexprimant humain de type sauvage (WT) ou mutant (A30P, A53T) α-SYN ont été générés au cours de la dernière décennie. Les niveaux d&#39;α-SYN surexpression se sont révélés être crucial dans le développement de la pathologie. Aussi la souche de souris, la présence ou l&#39; absence de endogène α-SYN et si la longueur totale ou une forme tronquée est exprimée, joue un rôle (examen détaillé par Magen et Chesselet 1). La surexpression à la fois de type sauvage et des mutants de plusieurs cliniques humains et# 945; SYN chez des souris transgéniques induit l&#39; accumulation pathologique de α-SYN et un dysfonctionnement neuronal 2-6. Cependant, jusqu&#39;à ce que les modèles les plus maintenant transgéniques de souris α-SYN échoué à afficher une perte de cellules dopaminergiques claire et des déficits comportementaux dopamine-dépendante. Cet obstacle a été surmonté par le ciblage direct de la substantia nigra (SN) avec des vecteurs viraux surexprimant α-SYN. Les vecteurs viraux sont dérivés de virus qui peuvent infecter des cellules facilement, d&#39;introduire du matériel génétique dans leur génome hôte et la force de la cellule hôte de répliquer le génome viral afin de produire de nouvelles particules virales. Les virus peuvent être modifiés pour des vecteurs non répliquants viraux qui conservent leur capacité à pénétrer dans les cellules et introduire des gènes. En supprimant des parties du génome viral et de les remplacer par des gènes d&#39;intérêt, l&#39;application du vecteur résultera en une seule infection ronde sans se répliquer dans la cellule hôte, désigné comme «transduction». vecteurs viraux cun être utilisé pour les deux surexpression et le silençage génique. Le transgène exprimé peut être une protéine rapporteur (par exemple des protéines vert fluorescent ou la luciférase de luciole) 7, une protéine thérapeutique pour des applications de thérapie génique 8-10 ou, comme nous allons nous concentrer dans ce papier, une protéine liée à la maladie utilisé pour la modélisation de la maladie 11 -14. la livraison de gènes médiée par un vecteur viral constitue un autre moyen d&#39;exprimer des transgènes dans le SNC avec plusieurs avantages. Utilisation de la prestation de transgène locale, des régions cérébrales spécifiques peuvent être ciblés. En outre, l&#39;expression du transgène peut être induite à l&#39;âge adulte pour diminuer le risque de mécanismes de compensation au cours du développement. En outre, les modèles peuvent être créés en différentes espèces et souches. Et enfin, les différents transgènes peuvent facilement être combinés. En utilisant des vecteurs viraux, des niveaux élevés d&#39;expression du transgène peut être atteint, ce qui peut être crucial puisque l&#39;apparition et la gravité de la maladie dépendent souvent du niveau de OVEREXPression. Plusieurs systèmes de vecteurs à base de virus ont été développés. Le choix du système de vecteur dépend de la taille du gène d&#39;intérêt, la durée requise de l&#39;expression génique, la cellule cible et des problèmes de biosécurité. Pour un transfert de gène stable dans le cerveau, lentivirus (LV) et du virus adéno-associé recombinant (rAAV) des vecteurs sont maintenant considérés comme des systèmes de vecteurs de choix car ils conduisent à une expression de gène efficace et à long terme dans le cerveau des rongeurs. Pour le ciblage spécifique des neurones dopaminergiques (DN) de la SN, vecteurs rAAV ont progressivement surpassés vecteurs LV en raison de leurs titres plus élevés et l&#39;efficacité de transduction de DN. Les modèles de rongeurs à base meilleures α-SYN actuellement disponibles ont été élaborées à partir d&#39; une approche combinée en utilisant les nouveaux sérotypes d&#39;AAV (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) et optimisé des constructions de vecteur, des titres, et la pureté 15,16. Le titre du vecteur, ainsi que la pureté du vecteur influence directementle résultat phénotypique du modèle. Les titres de vecteur excessifs ou lots de vecteurs insuffisamment purifiés peuvent entraîner une toxicité non spécifique. Par conséquent, les vecteurs de contrôle appropriés sont indispensables. investissement de temps considérable dans la production de vecteur, upscaling, et les procédures de purification virale ont également révélé essentiel pour obtenir des lots de vecteurs reproductibles et de qualité.

<table><tbody><tr><td>Rats Wistar femelles de 8 semaines</td><td>Janvier</td><td>/</td><td>200-250 g</td></tr><tr><td>Kétamine (Nimatek)</td><td>Eurovet santé animale</td><td>804132</td><td></td></tr><tr><td>Médétomidine (Dormitor)</td><td>Orion-Pharma/ Janssen Santé Animale</td><td>1070-499</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Anesthésie locale du cuir chevelu et des oreilles : Xyloca&iuml ; Gel à 2 %</td><td>Astrazeneca</td><td>0137-547</td><td></td></tr><tr><td>Terramycine</td><td>Pfizer</td><td>0132-472</td><td></td></tr><tr><td>Bupr&eacute ; norphine (Vetergesic)</td><td>Ecuphar</td><td>2623-627</td><td></td></tr><tr><td>Jodium 1 % isopropanol</td><td>VWR</td><td>0484-0100</td><td></td></tr><tr><td>cadre de tête stéréotaxique</td><td>Stoeling</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Seringue (calibre 30 -20 mm -pst 2)</td><td>Hamilton/ Filter Service</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>atipamézole (Antisedan)</td><td>Orion-Pharma/Elanco</td><td>1300-185</td><td></td></tr><tr><td>rAAV A53T & vecteur alpha ;-SYN</td><td>LVVC, KU Leuven</td><td>/</td><td>https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/</td></tr> <tr><td>pentobarbital sodique (Nembutal)</td><td>Ceva Sant&eacute ;</td><td>0059-444</td><td></td></tr><tr><td>microtome</td><td>Microm</td><td>HM650</td><td></td></tr><tr><td>polyclonal de lapin synucléine Ab</td><td>Chemicon</td><td>5038</td><td>1:5 000</td></tr><tr><td>polyclonal de lapin TH Ab</td><td>Chemicon</td><td>152</td><td>1:1 000</td></tr><tr><td>Détecteur d’oxyorthosilicate de lutécium basé sur tomographe FOCUS 220</td><td>Siemens/ Concorde Microsystems</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>radioligand : 18F-FECT</td><td>En interne</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>L-dopa : Prolopa 125</td><td>Roche</td><td></td><td>6 mg/kg i.p.</td></tr><tr><td>DMEM, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg ; 31331-093</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg ; 10270-106</td><td></td></tr><tr><td>25 kD polyéthylénimine linéaire (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Gradient de densité Medium : Iodixanol</td><td>Sigma</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Optimen</td><td>Life Technologies</td><td>N&deg ; 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Paxinos 1 watston steretactic atlas, quatrième édition</td><td>Elsevier</td><td>/</td><td></td></tr></tbody></table>

Élaboration d&#39;un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de parkinson par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral adéno-associé recombinant

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

Afin d&#39;étudier les voies moléculaires de la maladie de Parkinson (PD) et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, les chercheurs scientifiques reposent sur des modèles animaux. L&#39;identification des gènes PD-associé a conduit à l&#39;élaboration de modèles PD génétiques. La plupart des modèles transgéniques de souris α-SYN développer progressivement la pathologie α-SYN, mais ne parviennent pas à afficher une perte de cellules dopaminergiques claire et des déficits comportementaux dopamine-dépendante. Cet obstacle a été surmonté par le ciblage direct de la substantia nigra avec des vecteurs viraux surexprimant les gènes PD-associés. la livraison de gènes local en utilisant des vecteurs viraux fournit un moyen attrayant pour exprimer des transgènes dans le système nerveux central. Des régions cérébrales spécifiques peuvent être ciblés (par exemple , le locus niger), l&#39; expression peut être induite dans le cadre des adultes et des niveaux d&#39;expression élevés peuvent être atteints. En outre, des systèmes de vecteurs différents en fonction de différents virus peuvent être utilisés. Le protocole décrit toutes les étapes cruciales pour effectuer un vecteur virall&#39;injection dans la substance noire de rat pour développer un modèle animal vecteur viral à base d&#39;alpha-synucléine dans la maladie de Parkinson.

Le schéma d&#39; ensemble de l&#39;expérience est représenté sur la figure 1 surexpression de rAAV 07/02 à médiation A53T α-SYN induit des déficits moteurs dopamine-dépendante. Pour examiner si le niveau d&#39;α-SYN surexpression est suffisante pour induire une déficience motrice chez les rats, nous avons soumis les rats à l&#39;épreuve du cylindre pour...

Ce manuscrit décrit comment l’administration locale de gènes par vecteur viral offre un moyen attrayant d’exprimer des transgènes dans le système nerveux central. Le protocole décrit toutes les étapes cruciales pour effectuer une injection de vecteur viral dans la substance noire du rat afin de développer un modèle animal basé sur un vecteur viral pour la maladie de Parkinson.

Élaboration d&#39;un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral adéno-associé recombinant

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

L'objectif général de cette procédure est de développer un modèle animal basé sur un vecteur viral pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique dans le système nerveux central. Cette méthode peut être utilisée pour créer des modèles animaux normaux permettant les tests précliniques de médicaments et s'avérer utile pour l'étude des mécanismes moléculaires de la maladie de Parkinson ainsi que de nombreuses autres affections neurodégénératives. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à cibler spécifiquement des régions cérébrales.Une forte expression cérébrale du gène inséré peut être obtenue, et celle-ci peut être utilisée pour créer des modèles animaux dans des souches et espèces animales spécifiques. Différents systèmes vectoriels finaux ont été développés. Le choix du système vectoriel dépend de la taille du gène que vous souhaitez exprimer, de la durée de l'expression génique, des régions que vous souhaitez cibler et des considérations de biosécurité.La procédure sera démontrée par Annelies Aertgeerts, une technicienne de notre laboratoire. Commencez par anesthésier correctement un rat Wistar femelle âgé de huit semaines conformément aux protocoles approuvés. Vérifiez qu’un niveau chirurgical d’anesthésie a été atteint en serrant chaque patte et en notant l’absence du réflexe de retrait.Ensuite, utilisez un implantateur MicroTransponder pour placer un MicroTransponder sur le dos du rat. Vérifiez que le MicroTransponder est correctement positionné et qu'une lecture peut être obtenue. Coupez maintenant les poils du cuir chevelu du rat, puis appliquez un anesthésique local sur le cuir chevelu et les oreilles.Transférez le rat dans une hotte à flux laminaire et effectuez le reste de la procédure en utilisant une technique aseptique. Placez le rat dans le cadre stéréotaxique en fixant d'abord les barres auriculaires, puis la barre buccale et nasale. Recouvrez le corps du rat d'une couverture en papier afin d'éviter une chute de la température corporelle.Appliquer un lubrifiant oculaire pour éviter que les yeux ne s'assèchent. Ensuite, désinfecter le cuir chevelu selon les procédures approuvées. On utilise ici de l'iode à 1 % dans de l'isopropanol à 70 %.Après avoir pratiqué une petite incision dans la ligne médiane du cuir chevelu, grattez délicatement les membranes présentes sur le crâne et rincez à l'aide de sérum physiologique. Une fois le crâne sec, vérifiez que la bregme et le lambda sont clairement visibles. Remplissez ensuite une microsyringe de 10 microlitres, aiguille de calibre 30 et longueur de 20 millimètres, avec l'AAV recombinant, puis fixez-la sur la pompe micro-injectable motorisée reliée à l'instrument stéréotaxique.Pour une transduction spécifique des neurones dopaminergiques de la substance noire, les vecteurs AV recombinants sont le choix privilégié en raison de leurs titres élevés et de leur efficacité à transduire les neurones dopaminergiques. Vérifiez l'écoulement en libérant une goutte d'AAV. Jetez tout AAV libéré dans un détergent nettoyant polyvalent.Vérifiez visuellement que la tête est fixée droit dans le cadre crânien. Ensuite, vérifiez que le crâne est plat en déplaçant d'abord la pointe de l'aiguille vers le bregma et en mesurant la hauteur en ce point, en abaissant la pointe de l'aiguille dans le sens dorso-ventral jusqu'à ce qu'elle touche le crâne. Répétez la procédure au niveau du lambda.Après avoir ramené l'aiguille au bregma, déplacer l'aiguille dans la direction antéro-postérieure et médio-latérale jusqu'aux coordonnées stéréotaxiques pour la microinjection. Noter les coordonnées. Sur le site d'injection, mesurer la hauteur du crâne comme précédemment, et s'assurer qu'elle ne diffère pas de plus de 0,3 mm par rapport à la hauteur du bregma.Ensuite, percez soigneusement un trou de deux millimètres dans le crâne. Une fois le trou percé, mesurez la hauteur de la dure-mère afin de déterminer la référence à partir de laquelle appliquer la coordonnée dorso-ventrale. Pénétrez la dure-mère à l’aide d’une aiguille de calibre 26.Absorbez tout sang avec le tissu stérile, et poursuivez uniquement lorsque tout saignement a cessé. Abaissez maintenant lentement l'aiguille de la seringue de microinjection préchargée dans le cerveau jusqu'à la coordonnée dorso-ventrale. Et faites une pause d'une minute.Ensuite, injectez trois microlitres d'AAV à un débit de 0,25 microlitre par minute. Après l'injection, laissez l'aiguille en place pendant cinq minutes supplémentaires afin d'éviter tout reflux le long du trajet de l'aiguille, puis retirez-la lentement. Suturez le cuir chevelu à l'aide d'un polyester tressé codé 3,0 et désinfectez la peau avec de l'iode à 1 % et de l'isopropanol à 70 %.Pour desserrer la barre nasale et buccale, puis les deux barres auriculaires, afin de retirer délicatement l'animal de l'instrument stéréotaxique. À ce moment, administrer un analgésique, et si nécessaire, un agent de renversement de l'anesthésie. Ensuite, placer le rat dans une cage propre sur une plaque chauffante réglée à 38 degrés Celsius, et surveiller attentivement jusqu'à son réveil.Après la chirurgie, la cinétique de la neurodégénérescence peut être étudiée chez l'animal entier à l'aide de tests comportementaux et d'imagerie par tomographie par émission de positons (TEP), puis après sacrifice, à l'aide de techniques d'immunohistochimie. Le test du cylindre, destiné à évaluer l'utilisation spontanée des membres antérieurs, a été réalisé à différents moments après l'injection intracérébrale d'un AAV recombinant exprimant la mutation A53T de l'alpha-synucléine dans la substance noire. À partir de trois semaines après l'injection, un déficit moteur significatif a été observé chez les rats ayant reçu la dose médiane.Quatre semaines après l'injection, une diminution de 50 % de l'utilisation spontanée de la patte antérieure controlatérale a été observée. Alors que les animaux contrôles ayant reçu l'injection d'eGFP ne présentaient aucune asymétrie dans l'utilisation de la patte antérieure. Les rats ayant reçu une dose plus élevée d'AAV recombinant 2/7A53T de l'alpha-synucléine ont montré une altération plus marquée de l'utilisation de la patte antérieure à 29 jours après l'injection.Pour démontrer que l'atteinte motrice observée était dépendante de la dopamine, une dose unique de L-dopa a été administrée. Lorsque le test du cylindre a été répété 45 minutes après le traitement par la L-dopa, une récupération complète de l'utilisation de la patte antérieure chez les animaux injectés avec l'AAV recombinant 2/7A53T de l'alpha-synucléine a été observée. Afin de suivre de manière non invasive, au fil du temps et chez des animaux individuels, la cinétique de la neurodégénérescence dopaminergique nigrostriatale, la fixation du transporteur de la dopamine a été quantifiée à l'aide de la tomographie par émission de positons chez de petits animaux, en utilisant le F-18FECT comme radioligand.La liaison au DAT a significativement diminué au fil du temps dans le noyau caudé homolatéral des rats ayant reçu une injection de l'AAV recombinant 2/7A53T de l'alpha-synucléine. Après 32 jours, une diminution de la liaison au DAT atteignant 85 % a été observée. En tant que contrôle positif, l'injection de la neurotoxine 6-OHDA dans la SN a induit une perte de 90 % de la liaison au DAT en sept jours.Des sections cérébrales de rats microinjectés avec un AAV recombinant 2/7A53T de l'alpha-synucléine ont été immunomarquées pour la tyrosine hydroxylase, un marqueur des neurones dopaminergiques. Cette figure illustre la perte progressive des neurones dopaminergiques sur une période de 29 jours suivant la microinjection. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 45 minutes.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'utiliser des vecteurs finaux de haute qualité. Après cette procédure, d'autres techniques, telles que l'imagerie TEP non invasive, l'analyse comportementale et l'analyse immunohistochimique, peuvent être effectuées afin de déterminer le degré de neurodégénérescence et de neuropathologie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'effectuer une injection de vecteur viral dans la substance noire afin de développer des modèles animaux basés sur des vecteurs viraux pour la maladie de Parkinson.N'oubliez pas que le travail avec des vecteurs viraux peut être dangereux et que des précautions telles que le travail sous flux laminaire et la décontamination appropriée des déchets doivent toujours être prises en suivant cette procédure.

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Source : Tagliafierro, L., et al. Plateforme de vecteurs lentiviraux pour l’administration efficace d’outils d’édition d’épigénome dans des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre la transduction lentivirale des cellules progénitrices neurales (NPC) pour la modification épigénétique ciblée de l’alpha-synucléine, une protéine clé de la maladie de Parkinson. Le protocole permet la méthylation de l’ADN médiée par la...

Transduction lentivirale de cellules progénitrices neurales pour la régulation épigénétique de l’expression de l’alpha-synucléine

Cette vidéo montre une procédure permettant de créer un modèle de rat de la maladie de Parkinson en injectant la neurotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans le cerveau. La perfusion de neurotoxines dans le faisceau médial du cerveau antérieur (MFB) cible spécifiquement les neurones dopaminergiques responsables du contrôle moteur, conduisant à leur destruction et à la réplication des symptômes de la maladie de Parkinson.

Génération du modèle rat 6-hydroxydopamine de la maladie de Parkinson

Cette vidéo montre le processus d'injection d'un vecteur viral dans la substance noire du rat pour modéliser la maladie de Parkinson. Il décrit les étapes de préparation du rat, de micro-injection du vecteur viral dans la substance noire et la procédure de récupération.

Injection d’un vecteur viral dans la substance noire du rat pour la modélisation de maladies neurodégénératives

Méthodes pour une livraison de gène à grande échelle du système nerveux central chez le rat sont couvertes. Dans cet exemple, le but consiste à mimer une maladie qui affecte l’ensemble de la moelle épinière. La transduction généralisée peut être utilisée pour fournir une protéine thérapeutique à la CNS d’une administration unique, périphérique.

Méthodes et conseils pour l’Administration intraveineuse de Virus Adeno-associé à des Rats et d’évaluation de la Transduction du système nerveux Central

Le but du présent protocole est de fournir un système de base de cellules qui réplique la formation d’alpha-synucléine aggregates in vivo. Des inclusions intracellulaires alpha-synucléine sont ensemencées dans des neurones primaires par l’internalisation et propagation d’exogène administrée natif associées aux microsomes alpha-synucléine agrégats isolés de souris transgénique alpha-synucléine malades.

Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

L’objectif de cet article est de décrire les étapes requises pour la génération de fibrilles à partir de l’alpha-synucléine monomère, le contrôle de qualité ultérieur, et l’utilisation des fibrilles préformées in vivo.

Génération de fibrilles préformées alpha-synucléine à partir de monomères et utilisation in vivo

Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.

Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

Ce travail analyse la dose vectorielle et le temps d’exposition nécessaires pour induire la neuroinflammation, la neurodégénérescence et la déficience motrice dans ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson. Ces vecteurs codant pour la α-synucléine humaine sont introduits dans la substantia nigra pour récapituler la pathologie de la synucléine associée à la maladie de Parkinson.

Analyse du modèle murin de la maladie de Parkinson induit par des vecteurs viraux adéno-associés codant pour la α-synucléine humaine

Dans cet article, nous décrivons l'identification du virus adéno-associé de sérotype 3 (AAV3) comme le vecteur le plus efficace pour cibler les cellules humaines de cancer du foie.

Haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 Vecteurs

Un protocole pour effectuer unilatérales de 6-OHDA lésions du faisceau médian du cerveau antérieur chez la souris est décrite. Cette méthode a un faible taux de mortalité (13,3%) avec 89% des animaux qui ont survécu montrant la perte de&gt; 95% de la dopamine striatale et 90,63 ± -4,02% biais ipsiversive rotation vers le côté de la lésion.

Développement d&#39;une manière unilatérale-lésés 6-OHDA modèle murin de la maladie de Parkinson

Découvrez comment créer un modèle de rat pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique de vecteur viral AAV dans la substantia nigra. Cette méthode permet l'expression ciblée de l'alpha-synucléine et facilite les tests précliniques de thérapies.

Élaboration dun modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique dun vecteur viral adéno-associé recombinant (Vidéo) | JoVE Journal

Élaboration d'un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d'un vecteur viral adéno-associé recombinant

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