Combinaison de adhésif à base de bandes d'échantillonnage et de fluorescence In situ pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

L’objectif global de cette procédure est de coupler l’échantillonnage de produits frais à l’aide de ruban adhésif avec la détection moléculaire de cellules entières d’espèces de salmonelles à l’aide de la fluorescence rapide dans l’hybridation C deux, également connue sous le nom de poisson. Pour ce faire, il suffit d’appliquer d’abord du ruban adhésif sur le matériau souhaité et d’extraire les cellules liées à la surface. Les bandes de charge cellulaire peuvent être analysées directement ou soumises à des enrichissements en phase solide ou liquide.

La deuxième étape de la procédure consiste en l’auto-fixation et la déshydratation dans une série d’éthanol pour les cellules auxquelles il est fait allusion ou enrichies dans un bouillon. La deuxième étape implique la fixation des cellules en suspension, suivie de la suspension des cellules dans le tampon de stockage. La troisième étape de la procédure consiste à effectuer une étape d’hybridation rapide sur bande à l’aide d’un cocktail de sondes oligonucléotidiques spécifiques à la salmonelle, suivie de l’enlèvement de l’excès de sonde à l’aide d’un rinçage tampon de lavage pour les échantillons analysés par télécopieur, l’étape du poisson est effectuée en suspension, et l’excès de sonde peut être retiré à l’aide d’une simple étape de dilution avant l’analyse.

La dernière étape de la procédure consiste à contre-colorer les cellules hybrides liées à la bande avec DPI et à les examiner à l’aide de la microscopie à fluorescence. Pour les analyses basées sur des faits, une contre-coloration n’est pas nécessaire. En fin de compte, cette méthode fournit un moyen de détection visuelle ou cytométrique des espèces de salmonelles qui peuvent être présentes sur les fruits et légumes frais échantillonnés.

J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois en lisant sur un groupe italien qui utilisait une approche similaire pour examiner les communautés bactériennes sur des reliques de pierres aéromarines romaines. Mais r et moi avons mené une discussion sur ce travail dans un cours que j’enseignais sur les méthodes rapides en microbiologie alimentaire. Quelques semaines plus tard, une épidémie de salmonelle liée à des produits frais a commencé, blessant près de 1500 personnes dans 43 États différents.

Bien que notre approche expérimentale offre une voie opportune et pratique pour la détection des types de bactéries spécifiques sur les produits frais, elle est également suffisamment portable pour permettre des tests sur le terrain ou dans un environnement de production alimentaire. Commencez par sélectionner une bande à utiliser pour l’échantillonnage. Certaines options incluent le ruban anti-champignons disponible dans le commerce ou contacté, qui sont stériles et également emballés pour être faciles à utiliser.

À l’aide d’un marqueur permanent, dessinez des carrés d’un centimètre sur le côté non malade d’un morceau de ruban adhésif de 10 centimètres à l’aide d’un gabarit en aluminium stérile. Cela servira de guide visuel pour noter quelle partie du ruban a été utilisée pour échantillonner la surface des aliments ou de l’environnement sous la forme d’une boucle de ruban en forme de CS avec le côté collant face à la surface à échantillonner. Pour ce faire, tenez les extrémités collantes avec le pouce et le majeur et positionnez l’index contre le carré dessiné à l’arrière du ruban.

Placez le ruban sur la surface à échantillonner et appuyez doucement la zone marquée contre la surface sans relâcher les bords du ruban. Utilisez l’index pour vous assurer que le côté collant du ruban est en contact complet avec la surface de l’échantillon. Éviter les bulles en utilisant un mouvement régulier.

Retirez lentement la bande de l’échantillon. L’extraction physique des microbes liés à la surface accélère la charge de la cellule. À l’aide de ruban adhésif générique transparent, assurez-vous que la tension et l’étirement du ruban sont corrects afin de créer une surface plane et non ridée.

Cela aidera à minimiser les problèmes de déformation ou de gondolage du ruban. Lors du chauffage ultérieur. Lors de l’hybridation, placez le ruban face vers le bas sur des plaques agricoles de tranchage de xylose quatre ou de quatre plaques agricoles XLT de manière à ce que les cellules échantillonnées soient en contact direct avec la surface agricole pour faciliter le retrait du ruban de la surface agricole.

Après l’enrichissement, la partie de contact de l’échantillon du ruban est placée au ras de la surface agricole, et une extrémité du ruban est légèrement collée. La paroi latérale des plaques de la boîte de Pétri est inversée pour éviter la condensation et incubée à 35 degrés Celsius. Pour permettre une croissance suffisante des espèces de salmonelles, la durée de la période d’incubation nécessaire pour enrichir les cellules à un niveau détectable dépendra des niveaux initiaux de contamination par les salmonelles.

Après la période d’enrichissement souhaitée, ouvrez la plaque de gélose, le ruban conservera son adhérence pendant l’incubation. Appuyez doucement le ruban contre la gélose à l’aide de l’index pour assurer une récupération maximale des microcolonies formées À l’interface de la gélose à bande, saisissez le ruban par le bord fixé à la paroi de la boîte de Pétri et retirez-le d’un mouvement lent et régulier. À l’aide de ruban adhésif de bureau transparent générique, montez le ruban de charge de cellule côté collant vers le haut sur une lame de microscope afin de créer une surface plane et non ridée.

Effectuez la fixation de la cellule sur bande pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius en couvrant la zone de contact de l’échantillon avec 500 microlitres de formine tamponnée à 10 % neutre. Jetez le fixateur dans un récipient refermable sous un capot chimique pour minimiser l’exposition à des vapeurs irritantes ou toxiques, lavez le ruban une fois dans une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS en inondant doucement la surface du ruban avec du PBS pour déshydrater l’échantillon. À l’aide d’une série d’éthanol progressive, préparer des tampons d’hybridation et de lavage de pré-hybridation à l’aide des solutions commerciales de biologie moléculaire, filtrer à l’aide d’une seringue de 22 micromètres et préchauffer les tampons d’hybridation et de lavage à 55 degrés Celsius.

Ajouter des sondes d’oligonucléotides marquées par fluorescence au tampon d’hybridation préchauffé pour une concentration finale de la sonde de cinq nanogrammes par microlitre superposant la zone de contact de l’échantillon de la bande avec 300 microlitres de tampon d’hybridation contenant le cocktail de sonde et les cellules liées au ruban hybridé dans une chambre d’incubation humide et scellée réglée à 55 degrés Celsius pour un incubateur à contact direct, comme l’instrument en mode glissière hybridé pendant 15 minutes. Après l’hybridation, les lames sont retirées et la sonde contenant la superposition du tampon d’hybridation est mise au rebut. Rincer brièvement et doucement avec un tampon de lavage préchauffé par pipetage.

Un petit volume de tampon sur une lame inclinée permet aux lames de sécher à l’air libre pour la détection onap des espèces de salmonelles par microscopie à fluorescence. Superposez la diapositive avec environ 10 microlitres de bouclier vectoriel H 1200, support de montage contenant du dpi, le contre-colorant nucléaire incube dans l’obscurité pendant 10 minutes. Placez de l’huile d’immersion sur le couvercle, glissez-le et examinez les échantillons à l’aide d’un objectif à huile à fort grossissement.

Le filtre DPI est utilisé pour mettre au point l’échantillon. Le microscope est ensuite commuté sur le filtre approprié, et les cellules de salmonelle sont notées visuellement en fonction de leur fluorescence verte ou rouge, selon le colorant utilisé pour marquer les sondes. La détection cytrique avant transfère les échantillons en suspension PBS dans des tubes d’échantillonnage à fond rond de cinq millilitres et les examine à l’aide d’un cytomètre en flux avec une excitation à 647 nanomètres.

Analysez les données à l’aide du logiciel FlowJo. L’échantillonnage par ruban adhésif de Ty Murium à la surface d’une tomate contaminée artificiellement facilite l’analyse directe post-poisson par microscopie ou cytométrie en flux. Les bandes ont été traitées pour une fluorescence rapide dans l’hybridation C deux à l’aide d’une combinaison de sondes d’ADN spécifiques de la salmonelle et marquées au Texas Red, en fonction de la concentration locale initiale de cellules de salmonelle sur la bande.

L’enrichissement en phase solide a donné des résultats allant de microcolonies isolées à une croissance confluente. Les cellules échantillonnées sur bande ont pu être analysées par cytométrie combinée du poisson et de la cytométrie en flux, soit immédiatement après l’échantillonnage, soit après une surface liquide de cinq heures. Enrichissement de la mini culture à 35 degrés Celsius.

Bien que nous ayons décrit l’utilisation de la technique du poisson ruban pour la salubrité des aliments, la méthode a également un bon potentiel d’utilisation dans d’autres disciplines, notamment la microbiologie environnementale, la phytopathologie ou la microbiologie clinique. Parallèlement à cette procédure, des expériences supplémentaires telles que des tests biochimiques ou des tests PCR peuvent être effectuées sur des enrichissements en phase solide ou liquide à partir d’échantillons extraits sur bande. Les tests peuvent être utilisés pour répondre à des questions sur une salmonelle qui peut être présente, des questions qui dépassent le cadre de la procédure sur le poisson.