Évaluation de l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires longitudinales dorsales chez la drosophile

Commencez avec des thoraces de Drosophila de type sauvage et transgénique chimiquement fixées dans un tampon.

Chez les thoraces transgéniques, les jonctions neuromusculaires des muscles longitudinaux dorsaux contiennent des neurones qui expriment une protéine mutante induisant la neurodégénérescence.

Retirez le tampon et congelez les thoraces pour éviter d’endommager les tissus pendant la bissection.

Ajoutez un tampon frais et transférez les thoraces dans des boîtes de dissection.

Positionnez un thorax ventral vers le haut et retirez les grappes de cellules nerveuses pour exposer la ligne médiane.

Coupez en deux le long de la ligne médiane pour obtenir des hémitoraces.

Retirez l’excès de tissu.

Incuber les hémithoraces dans un tampon bloquant pour perméabiliser les membranes et empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Ajouter des anticorps conjugués aux fluorophores ciblant une glycoprotéine exprimée dans les neurones NMJ et les filaments d’actine musculaire.

Retirez les anticorps non liés.

Disposez les hémithoraces sur une glissière de pont, ajoutez un support de montage et montez les tissus.

Visualisez au microscope.

Par rapport au type sauvage, les mutants présentent une coloration neuronale réduite, indiquant une neurodégénérescence, tandis que les muscles présentent une fluorescence intacte.

Avant de commencer les bissections, enfilez des gants de cryoprotection et des lunettes de sécurité et remplissez une fiole de Dewar d’azote liquide. Utilisez un brise-lame pour saisir une lame en plume en biais et pliez la lame pour casser un petit morceau. Utilisez le brise-lame pour verrouiller la lame en position et utilisez une pipette Pasteur en verre pour retirer tout le PBS des tubes d’échantillon.

À l’aide d’une pince cryogénique, immerger les tubes dans la fiole d’azote liquide. Après 10 secondes, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter environ 300 microlitres de PBS glacé dans chaque tube sur de la glace et placez un thorax côté ventral vers le haut dans une boîte de dissection de 10 centimètres recouverte d’élastomère de silicone contenant du PBS glacé. Utilisez une paire de pinces émoussées pour positionner le thorax et une paire fine de pinces pour retirer une partie des ganglions thoraciques afin d’exposer la ligne médiane du thorax.

En utilisant la ligne médiane du thorax comme guide, utilisez la lame pour faire une coupe peu profonde à travers un tiers du thorax et utilisez la pince émoussée pour positionner le thorax à un angle de 45 degrés. Utilisez la lame pour couper directement la ligne médiane du thorax afin d’obtenir deux hémothoraces et pour faire soigneusement une ou deux coupes pour enlever l’excès de tissu sans endommager les muscles longitudinaux dorsaux. Ensuite, placez les échantillons de tissu musculaire dans un tube de PBS correctement étiqueté.

Lorsque tous les échantillons de thorax ont été coupés en deux, perméabilisez les tissus dans un tampon de blocage pendant au moins une heure à 4 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, vortex une solution de coloration structurelle fraîchement préparée et ajoutez 150 microlitres de colorant à chaque échantillon pour une incubation de deux heures sur un rotateur à température ambiante dans l’obscurité. Après la coloration, lavez les échantillons dans du PBST et placez cinq étiquettes de renfort empilées et coupées en deux, à 15 millilitres d’intervalle, sur une lame de microscope en verre.

Utilisez une pointe de micropipette modifiée pour transférer les thoraces sur chaque lame, et utilisez une lingette de laboratoire pour enlever tout excès de PBST. À l’aide d’une pince, disposez les échantillons de manière à ce que les thoracs soient orientés vers le haut, côté musculaire vers le haut. Lorsque les échantillons sont correctement orientés, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour appliquer 70 microlitres de support de montage sur chaque lame, et recouvrez chaque lame avec une lamelle. Ensuite, utilisez du vernis à ongles pour enduire généreusement les bords extérieurs des lamelles afin d’obtenir une étanchéité complète autour de chaque tissu.