Murine Hind Limb os long Dissection et moelle osseuse Isolation

L’objectif global de cette procédure de dissection d’os longs et d’isolement de la moelle osseuse est de retirer rapidement et systématiquement les os longs et de prélever la moelle osseuse pour une analyse plus approfondie en aval. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à la biologie de la moelle osseuse, aux métastases cancéreuses et à l’immunologie. Le principal avantage de cette technique est que le processus de dissection est rapide et standardisé, la procédure d’isolement de la moelle osseuse est assez stérile, Commencez par positionner la souris en position couchée.

Ensuite, épinglez les quatre coussinets sous l’articulation de la cheville et vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 %, en arrosant soigneusement les pattes. Ensuite, faites une petite incision à droite de la ligne médiane dans le bas-ventre juste au-dessus de la hanche, et étendez l’incision le long de la jambe et au-delà de l’articulation de la cheville. Tirez la peau vers l’arrière.

Ensuite, coupez le muscle quadriceps ancré à l’extrémité proximale du fémur pour exposer la face antérieure du fémur, et épinglez le muscle de la jambe avec la goupille à un angle de 45 degrés de la planche. Avec les ciseaux contre la face postérieure du fémur, coupez les ischio-jambiers loin de l’articulation du genou. Ensuite, tirez vers l’arrière la peau et les muscles ischio-jambiers ancrés à l’extrémité proximale du fémur pour exposer le côté postérieur de l’os, et épinglez les muscles ischio-jambiers de la jambe, en plaçant la goupille à un angle de 45 degrés.

À l’aide de la pince, saisissez l’extrémité distale du fémur juste au-dessus de l’articulation du genou. Guidez ensuite les lames de ciseaux de chaque côté de la tige fémorale vers l’articulation de la hanche. Après avoir atteint la tête fémorale, tournez les ciseaux, en déplaçant la lame supérieure directement sur la tête fémorale pour disloquer le fémur.

Saisissez maintenant le haut de la diaphyse fémorale avec la pince et coupez les tissus mous de la tête fémorale pour libérer le fémur de l’acétabulum. Ensuite, tirez tout l’os de la jambe, y compris le fémur, le genou et le tibia, vers le haut et loin du corps, et coupez soigneusement le tissu conjonctif et le muscle qui attachent la jambe à la peau. Lorsque tout le tissu conjonctif a été enlevé, étendez excessivement l’articulation de la cheville et tournez les ciseaux comme cela vient d’être démontré pour disloquer le tibia.

En saisissant l’extrémité distale du tibia et en prenant soin de ne pas sectionner les tendons, tirez le tibia vers le haut et éloignez-le du corps et de la planche d’affichage. Ensuite, retirez tout tissu conjonctif restant attaché à l’os long du genou et tout muscle ou tissu conjonctif supplémentaire attaché au fémur et au tibia. Pour préparer l’os long à l’isolement de la moelle osseuse, saisissez le fémur avec la rotule vers l’extérieur et la tête fémorale vers le bas.

Étendez trop l’articulation du genou et tournez les ciseaux pour disloquer le tibia du fémur. Ensuite, retirez tout tissu conjonctif qui maintient le fémur et le tibia ensemble. Ensuite, saisissez le fémur avec la face antérieure vers l’extérieur et la tête fémorale vers le bas, et guidez les ciseaux le long de la tige fémorale jusqu’aux condyles.

Faites pivoter doucement les ciseaux d’avant en arrière pour retirer les condyles, la rotule et l’épiphyse, exposant ainsi la métaphyse. Ensuite, utilisez la pince, les ciseaux et les lingettes Kimwipes pour retirer tout muscle ou tissu conjonctif supplémentaire attaché au fémur. Ensuite, saisissez le tibia avec le côté antérieur vers l’extérieur et l’extrémité de la cheville vers le bas.

Si l’épiphyse tibiale est intacte, guidez les ciseaux le long de la tige du tibia jusqu’aux condyles et tournez doucement les ciseaux d’avant en arrière pour retirer les condyles et l’épiphyse, exposant ainsi la métaphyse tibiale. Retirez ensuite tout muscle ou tissu conjonctif supplémentaire attaché au tibia, comme nous venons de le démontrer. Pour prélever la moelle osseuse, enfoncez d’abord une aiguille de calibre 18 dans le fond d’un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre.

Placez ensuite les os longs dans le tube, genou vers le bas, et fermez le couvercle. Imbriquez le tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et centrifugez les tubes à une fréquence supérieure ou égale à 10 000 fois g dans une microcentrifugeuse pendant 15 secondes. Vérifiez que la moelle osseuse a été retirée des os par inspection visuelle.

Les os doivent apparaître blancs et une grosse pastille doit être visible dans le tube plus grand. Ensuite, jetez les os dans le tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre et suspendez la moelle osseuse dans la solution appropriée pour l’analyse en aval souhaitée. Cette technique de dissection rapide convient à un certain nombre d’analyses en aval, notamment l’histomorphométrie et l’histologie.

En effet, comme le démontre cette reconstruction histomorphométrique micro-CT 3D représentative, l’os spongieux et la coquille corticale sont maintenus, permettant une quantification précise des paramètres structuraux standardisés pour l’histomorphométrie osseuse. Dans cette coupe histologique représentative d’un tibia formel et fixe et décalcifié coloré en H et E, le maintien de l’intégrité de l’os calcifié et de la moelle osseuse cellulaire pour l’analyse histologique peut être observé. De plus, la moelle osseuse isolée par cette procédure convient à de nombreuses applications en aval, y compris la culture cellulaire primaire d’ostéoclastes ou d’ostéoblastes.

Une fois maîtrisée, la technique peut être réalisée en sept minutes environ, de la dissection d’os long à l’isolement de la moelle osseuse, si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de procédure, il est important de ne pas oublier de positionner la souris pour faciliter la dissection. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le FACS ou d’autres processus unicellulaires, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant les altérations des populations de cellules de la moelle osseuse.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer rapidement les os longs des souris et d’isoler la moelle osseuse par centrifugation.