L'analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines
18 avril 2016
L’abondance des protéines reflète les taux de synthèse et de dégradation des protéines. Cet article décrit l’utilisation de la chasse au cycloheximide suivie d’un western blot pour analyser la dégradation des protéines chez l’eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure bourgeonnante).
L'objectif général de cette procédure est de visualiser la dégradation de la population à l'état stationnaire d'une protéine spécifique chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer les exigences génétiques ainsi que les effets environnementaux sur la dégradation d'une protéine d'intérêt. Le principal avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite ni isotopes radioactifs ni étapes longues d'immunoprécipitation, contrairement aux techniques de type pulse-chase, qui sont également utilisées pour visualiser la dégradation des protéines.
Cette procédure peut être utilisée pour analyser soit une protéine endogène de levure, soit une protéine exprimée à partir d'un plasmide. Pour ce dernier cas, la souche de levure est transformée avec un plasmide codant la protéine d'intérêt, selon un protocole standard de transformation de levure. Ensemencez la levure dans cinq millilitres de milieu approprié.
Incuber toute la nuit à 30 degrés Celsius avec agitation. Le lendemain matin, mesurer la densité optique à 600 nanomètres, ou OD600, de chaque culture de nuit. Diluer les cultures à une OD600 de 0,2 dans 15 millilitres de milieu frais.
Incuber à 30 degrés Celsius avec agitation jusqu'à ce que les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique moyenne. Pendant que les cellules de levure croissent, préparer la procédure de traçage à la cycloheximide. Régler un bloc chauffant pouvant accueillir des tubes coniques de 15 millilitres à 30 degrés Celsius pour l'incubation des cellules en présence de cycloheximide.
Pour assurer une répartition efficace de la chaleur aux cultures, ajouter de l'eau dans chaque puits du bloc chauffant de manière à ce qu'un tube conique de 15 millilitres provoque une montée du niveau d'eau jusqu'au bord du puits, sans déborder. Régler un second bloc chauffant, pouvant accueillir des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre, à 95 degrés Celsius pour la dénaturation des protéines après lyse cellulaire. Préchauffer le milieu de croissance frais à 30 degrés Celsius.
1,1 millilitre de milieu est nécessaire par point temporel et par culture à analyser. Ajouter 50 microlitres de Stop Mix 20x dans des tubes de microcentrifugation préalablement étiquetés. Préparer un tube par point temporel et par culture à analyser.
Placer les tubes sur de la glace. Lorsque les cellules de levure ont atteint une croissance en phase logarithmique moyenne, recueillir 2,5 unités OD600 de chaque culture par point temporel à analyser. Une unité OD600 correspond à la quantité de levure présente dans un millilitre de culture ayant une OD600 de 1,0.
Centrifuger les cellules recueillies dans des tubes coniques de 15 millilitres à 3 000 ×g pendant deux minutes à température ambiante. Éliminer le surnageant. Résuspendre chaque culot cellulaire dans un millilitre de milieu de croissance frais à 30 degrés Celsius par 2,5 unités d'OD600 de cellules.
Avant de commencer la cinétique de blocage par cycloheximide, équilibrer les suspensions de cellules de levure en les incubant pendant cinq minutes dans un bloc chauffant à 30 degrés Celsius. L'aspect le plus délicat de cette procédure est le moment de l'ajout de cycloheximide et la collecte des cellules pour chaque échantillon. Nous assurons le succès en établissant et en respectant un calendrier précis pour l'ajout de cycloheximide et la collecte des cellules.
Pour commencer le suivi par cycloheximide, appuyez sur Démarrer sur la minuterie. Ajoutez rapidement mais soigneusement de la cycloheximide à une concentration finale de 250 microgrammes par millilitre dans la première suspension de cellules de levure et vortexez brièvement pour homogénéiser. Transférez immédiatement 950 microlitres, soit environ 2,4 unités OD600, de la suspension de cellules de levure contenant la cycloheximide dans un tube microcentrifuge préalablement étiqueté et contenant 50 microlitres de mélange Stop 20x froid.
Vortexez le tube de microcentrifugation et placez-le sur de la glace jusqu'à ce que tous les échantillons aient été collectés. Commencez la poursuite à la cycloheximide comme indiqué pour chacune des suspensions restantes de cellules de levure à des intervalles de temps réguliers. À chaque point de temps ultérieur, vortexez les suspensions de cellules de levure et transférez 950 microlitres dans des tubes de microcentrifugation étiquetés contenant 50 microlitres de mélange d'arrêt 20x prérefroidi.
Vortexez et placez les cellules recueillies sur de la glace. Pour éviter l'agglomération des cellules de levure, vortexez les suspensions cellulaires dans des tubes coniques de 15 millilitres environ toutes les cinq minutes pendant toute la durée du suivi. Une fois tous les échantillons recueillis, faites précipiter les cellules par centrifugation à 6 500 × g et à température ambiante pendant 30 secondes.
Éliminer le surnageant par pipetage ou aspiration. Les cellules sont maintenant prêtes pour la lyse alcaline. Préparer les cellules pour la lyse alcaline en ajoutant 100 microlitres d'eau distillée à chaque culot cellulaire, puis les resuspendre par pipetage ascendant et descendant.
Ajouter 100 microlitres de soude 0,2 molaire à chaque échantillon. Mélanger par vortexage. Incuber les cellules à température ambiante pendant cinq minutes.
À ce stade, les cellules de levure n'ont pas été lysées et les protéines n'ont pas été libérées. Ensuite, former un culot des cellules par centrifugation à 18 000 ×g à température ambiante pendant 30 secondes. Éliminer le surnageant par pipetage ou aspiration.
Pour lyser les cellules, ajouter 100 microlitres de tampon d'échantillonnage de Laemmli à chaque culot cellulaire. Rédisperser en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Incuber à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de dénaturer complètement les protéines.
Centrifuger les lysats à 18 000 ×g et à température ambiante pendant une minute afin de former un culot avec le matériel insoluble. Le surnageant, qui correspond aux protéines extraites solubilisées, est prêt à être séparé par électrophorèse SDS-PAGE suivie d'une analyse par immunotransfert. Alternativement, les lysats peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius.
La stabilité de Deg1-Sec62, un substrat modèle de dégradation associée au réticulum endoplasmique chez la levure, a été analysée par la méthode de poursuite à la cycloheximide. La protéine Deg1-Sec62 migre sur gel SDS-PAGE sous forme de plusieurs espèces et est facilement dégradée dans des cellules de type sauvage. Pgk1 est un témoin de chargement dont l'abondance ne varie pas dans les conditions analysées.
La perte soit de la ligase d'ubiquitine résidente du RE, Hrd1, soit de l'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine Ubc7 a fortement stabilisé la protéine Deg1-Sec62, confirmant ainsi le rôle précédemment observé de ces protéines dans la dégradation de Deg1-Sec62. Cue1 est une protéine transmembranaire qui ancre Ubc7 à la membrane du RE et active l'enzyme, mais la nécessité de Cue1 dans la dégradation de Deg1-Sec62 n'avait pas été directement étudiée. L'observation de cette étude selon laquelle Deg1-Sec62 était stabilisée en l'absence de Cue1 a confirmé le rôle de Cue1 dans la dégradation associée au réticulum endoplasmique de Deg1-Sec62.
Le résultat du blot de Western a été quantifié à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images. Afin de comparer l'abondance de la protéine Deg1-Sec62 entre les échantillons, un ratio des intensités de signal ajustées de Deg1-Sec62 par rapport à Pgk1 a été déterminé pour chaque échantillon. Il est important de garder à l'esprit que cette procédure reflète principalement la cinétique de dégradation d'une population à l'état stationnaire d'une protéine d'intérêt.
Pour visualiser la dégradation d'une population naissante d'une protéine d'intérêt, d'autres techniques, telles que les expériences de type « pulse-chase », peuvent être utilisées. N'oubliez pas que le cycloheximide et l'azoture de sodium sont extrêmement toxiques et que des précautions doivent être prises afin d'éviter tout contact direct avec ces produits chimiques lors de la réalisation de cette procédure.
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Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de visualiser la dégradation des protéines chez Saccharomyces cerevisiae à l'aide d'une expérience de blocage par la cycloheximide suivie d'un immunoblotting. Cette technique permet aux chercheurs d'analyser la dégradation de protéines spécifiques sans avoir recours à des isotopes radioactifs ni à des étapes longues d'immunoprécipitation.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Dégradation des protéines
- Biologie cellulaire
- Systèmes modèles de levure
Contexte
- L'abondance des protéines est influencée par les taux de synthèse et de dégradation.
- La méthode de la chasse au cycloheximide est utilisée pour étudier la stabilité des protéines.
- Le transfert western est une technique permettant de détecter des protéines spécifiques.
- Comprendre la dégradation des protéines est essentiel pour obtenir des informations sur les processus cellulaires.
Objectif de l'étude
- Visualiser la dégradation d'une protéine spécifique chez la levure.
- Déterminer les facteurs génétiques et environnementaux influant sur la dégradation des protéines.
- Proposer une alternative plus simple aux techniques classiques de type pulse-chase.
Méthodes utilisées
- Utilisation de cycloheximide pour inhiber la synthèse des protéines.
- Immunotransfert pour analyser les niveaux protéiques au fil du temps.
- Transformation de levure avec des plasmides codant pour des protéines d'intérêt.
- Inoculation de la levure dans un milieu de croissance approprié.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de la dégradation des protéines chez la levure.
- Identification des exigences génétiques pour la dégradation des protéines.
- Évaluation des effets environnementaux sur la stabilité des protéines.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode par rapport aux techniques traditionnelles.
Conclusions
- La méthode de relève à la cycloheximide est efficace pour l'étude de la dégradation des protéines.
- Cette technique simplifie l'analyse de la stabilité des protéines chez la levure.
- Les résultats contribuent à une meilleure compréhension de la dynamique des protéines dans les cellules.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La cinétique de dégradation des protéines est essentielle pour la validation des cibles et l'atténuation des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. La méthode du chase à la cycloheximide permet une évaluation quantitative de la stabilité des protéines dans un modèle génétiquement manipulable, soutenant ainsi la vérification d'hypothèses et la clarification des voies. Cette approche offre une confiance prédictive pour hiérarchiser les cibles et réduire les risques liés aux hypothèses mécanistiques avant le criblage de composés.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en mesurant les taux de dégradation des populations protéiques à l'état stationnaire.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à l'analyse de perturbations génétiques et environnementales.
- Valeur prédictive : Génère des données quantitatives sur la cinétique de dégradation afin d'éclairer les décisions relatives à la confiance dans la cible et au tri du portefeuille.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Produit des résultats standardisés et reproductibles de western blot pour des mesures cinétiques de la stabilité des protéines.
- Extensibilité : Compatible avec les tests multiparamétriques afin d’évaluer les effets de composés sur les voies de dégradation protéique.
- Utilité de la plateforme : Met en place une capacité réutilisable pour évaluer l’interaction avec la cible par modulation de la dégradation dans des systèmes à base de levures.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Utilise Saccharomyces cerevisiae comme système pertinent pour modéliser des mécanismes de dégradation conservés.
- Continuité translationnelle : Relie la validation préliminaire des cibles à la découverte à des études précliniques par l'analyse de la voie conservée du ubiquitine-protéasome.
- Avancement ajusté au risque : Identifie les modificateurs génétiques et environnementaux de la dégradation afin de réduire les risques associés aux mécanismes cibles avant leur validation chez les mammifères.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés d'intérêt en fournissant des données cinétiques de dégradation qui éclairent les études de sélection de cible et de mécanisme d'action.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en isolant les variables de dégradation des effets de synthèse.
- Écrans : Permet le développement de tests pour le criblage de composés en établissant des taux de dégradation de base dans des souches de levure modifiées.
- Analytique : Génère des lectures quantitatives par immunobuvardage normalisées par rapport aux témoins de chargement pour l'analyse comparative entre conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes sur la dégradation obtenues chez la levure à des systèmes mammaliens grâce à des composants conservés du système de dégradation associé au réticulum endoplasmique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme standardisée permettant la réduction des risques sur des cibles dans différents projets par des études de perturbation génétique et chimique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Permet une dé-risquisation mécanistique en quantifiant la demi-vie des protéines et en identifiant les dépendances aux voies de dégradation.
- Valeur opérationnelle : Propose un protocole standardisé, sans recours aux isotopes, compatible avec l'infrastructure classique de western blot.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en réduisant l'ambiguïté concernant le mécanisme ciblé et les effets des composés modulateurs sur la stabilité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des cibles ajustée au risque, fondée sur la faisabilité de la dégradation et la conservation des voies impliquées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des cultures de levures, les protocoles de sécurité liés à la cycloheximide et la quantification par immunotransfert (western blot).
- Dépend de l'accès à des blocs chauffants à 30 °C et 95 °C, à des centrifugeuses et à du matériel standard pour l'électrophorèse SDS-PAGE et les immunotransferts.
- Exige une standardisation inter-équipes des procédures de prélèvement aux différents points temporels, de l'efficacité de lyse et de la normalisation des signaux.
- Les éléments à prendre en compte pour l'adaptation incluent les systèmes d'expression basés sur des plasmides, le marquage par épitope et la compatibilité avec les banques de levures aux gènes invalidés.
- Les limitations pratiques comprennent la toxicité de la cycloheximide, les effets secondaires potentiels sur la traduction et la nécessité d'une détection dans la gamme linéaire lors des immunotransferts.
