L'analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines Saccharomyces cerevisiae

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la dégradation de la population à l’état d’équilibre d’une protéine spécifique chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer les exigences génétiques et les effets environnementaux sur la dégradation d’une protéine d’intérêt. Le principal avantage de cette technique est qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser des isotopes radioactifs et de longues étapes d’immunoprécipitation, contrairement aux techniques de chasse par impulsions, qui sont également utilisées pour visualiser la dégradation des protéines.

Cette procédure peut être utilisée pour analyser soit une protéine de levure endogène, soit une protéine exprimée à partir d’un plasmide. Pour ce dernier, la souche de levure est transformée à l’aide d’un plasmide codant pour la protéine d’intérêt selon un protocole standard de transformation de levure. Inoculez la levure dans cinq millilitres de milieu approprié.

Incuber toute la nuit à 30 degrés Celsius avec rotation. Le lendemain matin, mesurez la densité optique à 600 nanomètres, ou OD600, de chaque culture de nuit. Diluez les cultures à une OD600 de 0,2 dans 15 millilitres de milieu frais.

Incuber à 30 degrés Celsius en secouant jusqu’à ce que les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique moyenne. Pendant que les cellules de levure se développent, préparez-vous à la procédure de poursuite du cycloheximide. Réglez un bloc chauffant pouvant accueillir des tubes coniques de 15 millilitres à 30 degrés Celsius pour l’incubation des cellules en présence de cycloheximide.

Pour assurer une distribution efficace de la chaleur aux cultures, ajoutez de l’eau dans chaque puits du bloc de chaleur de sorte qu’un tube conique de 15 millilitres fasse monter le niveau de l’eau jusqu’au rebord du puits, mais ne le déborde pas. Installez un deuxième bloc chauffant pouvant accueillir des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à 95 degrés Celsius pour la dénaturation des protéines après la lyse cellulaire. Préchauffer la croissance fraîche à 30 degrés Celsius.

1,1 millilitres de milieu est nécessaire par point temporel par culture à analyser. Ajoutez 50 microlitres de 20x Stop Mix dans des tubes de microcentrifugation pré-étiquetés. Préparez un tube par point temporel par culture à analyser.

Placez les tubes sur de la glace. Lorsque les cellules de levure ont atteint une croissance mi-logarithmique, collectez 2,5 unités OD600 de chaque culture par point temporel à analyser. Une unité OD600 est égale à la quantité de levure présente dans un millilitre de culture à une OD600 de 1,0.

Centrifuger les cellules collectées dans des tubes coniques de 15 millilitres à 3 000 fois g à température ambiante pendant deux minutes. Retirez le surnageant. Remettez en suspension chaque pastille de cellule dans un millilitre de milieu de croissance fraîche à 30 degrés Celsius pour 2,5 OD600 unités de cellules.

Avant de commencer la chasse au cycloheximide, équilibrez les suspensions de cellules de levure en les incubant dans le bloc de chaleur à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes. L’aspect le plus difficile de cette procédure est le moment de l’ajout de cycloheximide et de la collecte des cellules pour chaque échantillon. Nous assurons le succès en établissant et en respectant un calendrier pour l’ajout de cycloheximide et la collecte de cellules.

Pour commencer la chasse au cycloheximide, appuyez sur « Start » sur la minuterie. Ajoutez rapidement mais soigneusement du cycloheximide à une concentration finale de 250 microgrammes par millilitre à la première suspension de cellules de levure et agitez brièvement pour mélanger. Transférez immédiatement 950 microlitres, soit environ 2,4 unités OD600, de la suspension de cellules de levure avec du cycloheximide ajouté dans un tube de microcentrifugation pré-étiqueté contenant 50 microlitres de Stop Mix 20x glacé.

Vortex le tube de la microcentrifugeuse et placez-le sur de la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été prélevés. Commencer la chasse au cycloheximide comme démontré pour chacune des suspensions de cellules de levure restantes à intervalles de temps réguliers. À chaque point temporel suivant, vortex les suspensions de cellules de levure et transfère 950 microlitres dans des tubes de microcentrifugation étiquetés contenant 50 microlitres de 20x Stop Mix pré-refroidis.

Vortex et placez les cellules collectées sur de la glace. Pour éviter l’installation des cellules de levure, vortex les suspensions cellulaires dans les tubes coniques de 15 millilitres environ toutes les cinq minutes tout au long de la poursuite. Lorsque tous les échantillons ont été prélevés, granulez les cellules collectées par centrifugation à 6 500 fois g et à température ambiante pendant 30 secondes.

Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration. Les cellules sont maintenant prêtes pour la lyse alcaline. Préparez les cellules pour la lyse alcaline en ajoutant 100 microlitres d’eau distillée à chaque pastille de cellule, et remettez-les en suspension en pipetant de haut en bas.

Ajoutez 100 microlitres d’hydroxyde de sodium de 0,2 molaire à chaque échantillon. Mélanger par vortex. Incuber les cellules à température ambiante pendant cinq minutes.

À ce stade, les cellules de levure n’ont pas été lysées et les protéines n’ont pas été libérées. Ensuite, granulez les cellules par centrifugation à 18 000 fois g à température ambiante pendant 30 secondes. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration.

Pour lyser les cellules, ajoutez 100 microlitres de tampon d’échantillon Laemmli à chaque pastille de cellule. Remettez en suspension en pipetant de haut en bas. Incuber à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dénaturer complètement les protéines.

Centrifugez les lysats à 18 000 fois g et à température ambiante pendant une minute pour granuler le matériau insoluble. Le surnageant, qui est une protéine extraite solubilisée, est prêt à être séparé par SDS PAGE et l’analyse ultérieure par transfert Western. Alternativement, les lysats peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius.

La stabilité de Deg1-Sec62, un substrat de dégradation associé au réticulum endoplasmique de levure, a été analysée par la méthodologie de chasse au cycloheximide. La protéine Deg1-Sec62 migre sur SDS PAGE en tant que plusieurs espèces et se dégrade facilement dans les cellules de type sauvage. Pgk1 est un contrôle de charge dont l’abondance ne varie pas dans les conditions analysées.

La perte de l’ubiquitine ligase HRD1, résidente du RE, ou de l’enzyme conjuguée à l’ubiquitine ubc7, a considérablement stabilisé la protéine Deg1-Sec62, ce qui confirme le rôle précédemment observé de ces protéines dans la dégradation de Deg1-Sec62. Cue1 est une protéine transmembranaire qui ancre ubc7 à la membrane du RE et active l’enzyme, mais une exigence de cue1 dans la dégradation de Deg1-Sec62 n’a pas été directement étudiée. L’observation de cette étude selon laquelle Deg1-Sec62 était stabilisé en l’absence de repère1 a confirmé le rôle de Deg1-Sec62 associée au RE

Le résultat du transfert Western a été quantifié à l’aide d’un logiciel d’imagerie. Pour comparer l’abondance de la protéine Deg1-Sec62 entre les échantillons, un rapport entre les intensités de signal ajustées de Deg1-Sec62 et Pgk1 a été déterminé pour chaque échantillon. Il est important de se rappeler que cette procédure rend compte le plus directement de la cinétique de dégradation d’une population à l’état stationnaire d’une protéine d’intérêt.

Pour visualiser la dégradation de la population naissante d’une protéine d’intérêt, d’autres techniques, telles que les expériences de chasse à impulsions, peuvent être utilisées. N’oubliez pas que le cycloheximide et l’azoture de sodium sont extrêmement toxiques et que des précautions doivent être prises pour éviter tout contact direct avec ces produits chimiques lors de l’exécution de cette procédure.