Génération de cellules de souris Airway épithéliales ESC dérivés Utilisation décellularisé Lung échafauds

L’objectif global de cette procédure est de diriger la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en cellules épithéliales matures des voies respiratoires, en utilisant une culture 3D mise en place avec des échafaudages pulmonaires décellularisés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement pulmonaire, telles que le rôle des contractions de la matrice cellulaire et de la signalisation des facteurs de croissance lors de la différenciation de la lignée pulmonaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise un système de culture 3D dans un cadre défini sans sérum et permet une différenciation épithéliale robuste des voies respiratoires avec une contamination limitée par d’autres lignées endodermiques. Après avoir euthanasié un rat wistar adulte, selon le protocole de texte, fixez l’animal à une surface de dissection en fixant les pattes avant et arrière, et utilisez de l’éthanol à 70 % pour pulvériser la poitrine et l’abdomen. Créez une incision juste en dessous de la cage thoracique. Coupez la peau et exposez le diaphragme. Ensuite, faites de petites incisions à travers le diaphragme, pour provoquer la rétraction des poumons, réduisant ainsi le risque de perforation des poumons. Ensuite, créez une incision verticale le long du sternum et ouvrez la cavité thoracique pour accéder au cœur et aux poumons. Ensuite, à l’aide d’une suture, ligaturez la veine cave inférieure et utilisez de petits ciseaux de dissection pour placer une petite incision dans l’oreillette gauche. À l’aide d’une seringue de 10 ml préparée avec une aiguille de calibre 25 remplie de solution saline héparinée de Hank’s Balance, commencez la perfusion pulmonaire en insérant l’aiguille dans le ventricule droit et poussez le tampon dans la circulation pulmonaire. Continuez la perfusion jusqu’à ce que les poumons deviennent blancs et que le liquide qui s’écoule de l’oreillette gauche soit clair. Après la perfusion, exposez la trachée et faites une petite incision près du cartilage thyroïdien pour la canulation. Ensuite, à l’aide d’un cathéter en plastique, canulez la trachée et utilisez une suture pour la fixer en place. Maintenant, installez un système de perfusion par gravité en fixant une seringue de 10 ml à un support d’autoclave et à une pince. Ensuite, retirez et jetez le piston de la seringue. Fixez le point de remplissage maximum sur le corps de la seringue à 20 cm au-dessus des poumons, puis fixez un robinet d’arrêt à deux voies à l’extrémité de la seringue et un long tube en plastique à l’autre extrémité du robinet d’arrêt. Retirez doucement le cathéter de la trachée et fixez-le à l’extrémité du tube en plastique. Ensuite, versez la solution de décellularisation dans la seringue et laissez la solution remplir complètement le tube en plastique et le cathéter attachés. Remettez le cathéter rempli de solution dans la trachée et lavez les poumons en les remplissant jusqu’à la capacité pulmonaire totale pendant une minute. Retirez ensuite le cathéter de la trachée pour permettre au liquide de s’écouler des poumons. Répétez le lavage des poumons huit fois avec une solution de décellularisation, suivi de dix rinçages avec du PBS. Les poumons apparaîtront blancs à la fin des étapes de lavage. Ensuite, disséquez la trachée et les poumons du cou et de la cavité thoracique. Retirez l’excès de tissu des poumons disséqués, y compris l’œsophage et le cœur, puis transférez les poumons dans du PBS froid jusqu’à la préparation de la section du vibratome. Pour préparer des sections épaisses, préparez environ 15 ml d’agarose à bas point de fusion de 2 % et 4 % dans du PBS, et suffisamment d’agarose à 6 % pour intégrer tous les lobes dans de petits blocs rectangulaires. Après avoir transféré l’agarose dans des tubes de 15 ml, placez les tubes sur un bloc chauffant et maintenez la température au-dessus de 40 degrés Celsius pour éviter la gélification. À l’aide de petits ciseaux, disséquez le poumon décellularisé à l’extrémité de chaque bronche lobaire et détachez chaque lobe. Ensuite, utilisez des feuilles absorbantes pour éliminer l’excès de PBS et transférez les lobes à 2 % d’agarose sur le bloc chauffant pendant cinq minutes pour enrober le tissu. Après avoir transféré chaque lobe dans une boîte de Pétri, placez le plat sur une assiette froide et laissez la surface se gélifier pendant une minute. Placez délicatement les lobes dans de l’agarose à 4 %, et après avoir incubé pendant cinq minutes et refroidi, répétez l’enrobage avec de l’agarose à 6 %. Après l’enrobage, utilisez des moules à base métallique pour intégrer chaque lobe séparément dans de l’agarose à 6 %, avec au moins 3 ml d’agarose entourant le tissu à partir des bords. Ensuite, à l’aide d’une pince, orientez chaque lobe en positionnant le plus grand bord plat du tissu à la surface du moule métallique face à l’expérimentateur, et terminez l’enrobage à l’aide de cassettes en plastique. Laissez les blocs se gélifier sur une plaque froide pendant au moins 30 minutes avant de sectionner le vibratome. Vous pouvez également stocker les blocs dans une chambre humidifiée jusqu’à 12 heures à quatre degrés Celsius avant la section du vibratome. Pour préparer les sections, mettez en place le vibratome en remplissant la chambre de sectionnement avec du PBS froid. Mettez en place un bain de glace autour de vous pour maintenir une température froide tout au long de la section. Maintenant, retirez les blocs des moules métalliques et utilisez une lame de rasoir pour couper l’excès d’agarose entourant les lobes, tout en gardant environ trois millimètres du bord du tissu. À l’aide d’un adhésif, fixez le tissu au centre de la plaque d’échantillon et immergez la plaque dans la chambre de sectionnement remplie de PBS. Chargez la lame de sectionnement sur le vibratome. Définissez les limites de sectionnement sur le vibratome, en sélectionnant respectivement les valeurs de vitesse, d’amplitude et d’épaisseur suivantes. Sectionnez complètement chaque lobe, et si les sections ne se séparent pas complètement les unes des autres, utilisez de petits ciseaux pour couper manuellement les sections. Ensuite, récupérez délicatement les sections d’échafaudage et transférez-les dans du PBS froid. À l’aide d’une pince, libérez délicatement chaque section de l’agarose environnante. Pour décontaminer les sections d’échafaudage, après les avoir transférées du PBS aux tubes de microcentrifugation, ajoutez 90 unités par millilitre de nucléase dans du PBS et incubez sur un rotateur à température ambiante pendant 12 à 24 heures. Après avoir transféré les sections dans de nouveaux tubes de microcentrifugation, conformément au protocole textuel, dans des conditions stériles, ajoutez une solution antimicrobienne et incubez sur un rotateur à température ambiante pendant six heures. Ensuite, dans des conditions stériles, utilisez du PBS pour rincer deux fois les échafaudages et les transférer dans un milieu sans sérum, ou SFDM, avant l’ensemencement avec des cellules. Pour mettre en place une culture d’interface air-liquide, utilisez des pinces stériles pour placer des membranes hydrophobes sur une boîte de Pétri. Ensuite, transférez chaque section d’échafaudage décellularisée de SFDM sur une membrane, en veillant à ce que les sections soient réparties uniformément sur la membrane. Préparez six ou douze plaques de puits en remplissant les puits avec 1 ml ou 0,5 ml de SFDM respectivement. Ensuite, placez doucement les membranes dans les puits, en laissant la membrane flotter sur le milieu en créant une installation de culture air-liquide. Pour ensemencer des échafaudages 3D, suite à la préparation des cellules endodermiques et au tri cellulaire activé par fluorescence, pour enrichir pour un endoderme définitif, utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules triées. Ensuite, faites tourner les cellules à 400 G pendant cinq minutes. À l’aide de SFDM, remettre en suspension les cellules granulées à environ 100 000 cellules dans 10