Transplantation de poumon issu de la bio-ingénierie à l’aide de poumons de souris décellularisés et de cellules endothéliales humaines primaires

La bio-ingénierie d’organes à taille humaine nécessite une grande quantité de ressources, ce qui dépasse souvent la capacité des laboratoires universitaires. La réduction du coût du développement de protocoles itératifs accélérera les progrès de la recherche dans ce domaine. L’objectif de cette étude est de fournir le protocole standardisé pour la bio-ingénierie pulmonaire à l’aide de blocs cœur-poumon de souris. On ne sait toujours pas quelles cellules sont appropriées pour la bio-ingénierie d’organes, et comment ces cellules devraient être intégrées dans la culture du bioréacteur d’organes. Plusieurs types de cellules et de conditions doivent être comparés afin d’établir des protocoles évolutifs et reproductibles.

Les souris sont de petits animaux de laboratoire faciles à manipuler. Cependant, bien qu’ils soient petits, l’architecture de base des poumons est similaire chez tous les mammifères. En optimisant le protocole sur cette petite plateforme, nous pouvons augmenter la taille des modèles d’animaux laser en multipliant simplement les résultats optimisés en fonction de la taille des animaux. Cette plateforme de bio-ingénierie pulmonaire de la taille d’une souris permet aux chercheurs de tester efficacement leurs cellules souches. Ces cellules génétiquement modifiées peuvent être précieuses ou coûteuses à utiliser pour l’ensemble de l’ingénierie pulmonaire. De plus, les cellules dérivées de patients peuvent également être utilisées pour créer des modèles de maladies in vitro.

Les efforts actuels consistent à tester plusieurs types de cellules souches modifiées et de cellules progénitrices, afin de déterminer le potentiel de prolifération requis et la capacité différentielle pour la bio-ingénierie pulmonaire. Une fois que les cellules appropriées auront été identifiées, cette recherche sera étendue à un modèle animal plus grand tel que le porc.

[Narrateur] Pour commencer, placez la souris euthanasiée en position couchée sur une table d’opération et fixez les membres. Vaporisez uniformément de l’éthanol à 70 % sur la poitrine et la surface abdominale pour le stériliser. Ensuite, ouvrez la cavité abdominale le long de la ligne médiane s’étendant jusqu’au cou, à l’aide de ciseaux en acier inoxydable, et fendez le sternum. Réséquez le diaphragme de la paroi thoracique. Coupez la paroi thoracique ventrale pour exposer les cavités thoraciques et retirer le thymus. À l’aide d’une suture en soie 4/0, légatez la veine cave inférieure et la veine cave supérieure droite. Coupez l’aorte abdominale avec des ciseaux en acier inoxydable pour le drainage. À l’aide d’une seringue stérile de cinq millilitres munie d’une aiguille de calibre 27, injectez trois millilitres de PBS stérile dans le ventricule droit en perforant la paroi du ventricule. Utilisez une pince Dumont pour enrouler une suture en soie 4/0 autour de l’artère pulmonaire principale. Ensuite, découpez une fenêtre de deux millimètres sous les valves de l’artère pulmonaire, à l’aide de ciseaux à ressort, pour accéder à la paroi du ventricule droit. Insérez le cathéter de l’artère pulmonaire à travers la fenêtre et fixez-le avec la suture en soie 4/0 pré-bouclée. Injectez lentement deux millilitres de PBS à travers le cathéter de l’artère pulmonaire, à l’aide d’une seringue de cinq millilitres. Canulez la trachée à l’aide d’un cathéter trachéal et attachez-la en place avec une suture en soie 4/0. Maintenant, injectez lentement deux millilitres d’air à travers le cathéter trachéal à l’aide d’une seringue vide de cinq millilitres. Maintenez l’air pendant 10 secondes pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite d’air des poumons. Retirez le bloc d’extrémité du cœur et des poumons. Ensuite, transférez le bloc cœur-poumon réséqué dans une boîte de Pétri en plastique de 10 centimètres de diamètre contenant de l’eau déminéralisée, pour la décellularisation des poumons. Incuber le bloc pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, à l’aide d’une seringue de cinq millilitres, injectez trois fois deux millilitres d’eau déminéralisée stérile à travers le cathéter trachéal. Faites une pause après chaque injection pour permettre au liquide de s’échapper lorsque les poumons reculent. De même, injectez deux millilitres d’eau à travers le cathéter de l’artère pulmonaire. Injectez deux millilitres de solution Triton X-100 à 0,1 % dans les cathéters artériels trachéaux et pulmonaires. Transférez le bloc cœur-poumon dans une boîte de Pétri et incubez statiquement dans une solution Triton X-100 pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, pour retirer la solution de Triton X-100 des poumons, injectez deux millilitres d’eau désionisée dans le cathéter trachéal et le cathéter de l’artère pulmonaire, et répétez ces opérations avec deux millilitres de solution de désoxycholate à 2 %. Après avoir retiré la solution de désoxycholate des poumons, injectez deux millilitres d’une solution molaire de chlorure de sodium dans les cathéters des artères trachéale et pulmonaire. Incuber le bloc cœur-poumon pendant une heure. Après avoir retiré la solution de chlorure de sodium avec de l’eau déminéralisée, injectez deux millilitres de solution de travail DNase I dans les cathéters des artères trachéale et pulmonaire. Incuber le bloc cœur-poumon pendant une heure. Injectez du PBS stérile dans les cathéters des artères trachéale et pulmonaire pour éliminer la solution de DNase I. Après la décellularisation, confirmez que les poumons sont blancs et transparents sur les bords. Ajoutez 70 millilitres de milieu de culture EGM-2 dans le récipient en verre et placez le bouchon en silicone sur le dessus du récipient pour le sceller. Assemblez un bouchon en silicone, une cartouche en verre, un bouchon à vis GL45 avec tube, une bouteille en verre autoclavable de 250 millilitres et un tube L/S 14 avec raccords de leurre à l’aide de robinets à trois voies. Insérez une aiguille de calibre 20 dans le septum en silicone du bouchon à vis GL45. Remplissez les tubes A, B et C avec des milieux de culture à l’aide d’une seringue de 10 millilitres reliée aux robinets un et trois. Fixez le cathéter artériel pulmonaire du bloc cœur-poumon décellularisé à la tubulure C à l’aide d’un leurre. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le cathéter ou la tubulure. Pour l’injection gravitaire de cellules endothéliales, placez un réservoir cellulaire contenant des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine, ou HUVEC, sur un agitateur magnétique, en veillant à ce que le réservoir soit à 30 centimètres au-dessus de la chambre de l’organe. Allumez l’agitateur magnétique à une vitesse de 120 tr/min. Ouvrez les robinets un et deux pour permettre à la suspension cellulaire de s’écouler dans l’échafaudage décellularisé, via le tube A, le tube C et le cathéter de l’artère pulmonaire. Pour la perfusion de la culture d’organes, placez la chambre de l’organe dans un incubateur de dioxyde de carbone. Fixez le tube B à une tête de pompe reliée à une pompe pulsatile. Fermez la porte vitrée de l’incubateur. Assurez-vous que le tube est correctement positionné entre la porte et le joint en caoutchouc. Incuber l’échafaudage décellularisé à 37 degrés Celsius pendant trois heures pour permettre aux cellules endothéliales de s’installer à l’intérieur de l’échafaudage. Démarrez la pompe à un taux de six tr/min, ce qui permet une perfusion de milieu de deux millilitres par minute à l’aide d’un tube L/S 14. Observez le poumon décellularisé se dilater légèrement en raison de la perfusion médiale. Ensuite, fermez la porte de l’incubateur. Pour effectuer un changement de support, arrêtez l’entraînement de la pompe. Fixez une seringue stérile de 50 millilitres au robinet d’arrêt trois et retirez 50 millilitres de milieu de la chambre. Remplissez une autre seringue stérile de 50 millilitres avec 50 millilitres de milieu préchauffé. Injectez la solution dans une cartouche en verre et transférez le fluide dans la chambre via le robinet d’arrêt trois, en vous assurant que le robinet d’arrêt est correctement commuté. Redémarrez la pompe à pulsatiles. Récoltez le bloc cœur-poumon recullularisé après deux jours de culture d’organe de perfusion. Les poumons de souris sont apparus blancs et translucides après la décellularisation, indiquant l’élimination des composants cellulaires, tout en préservant la structure pulmonaire globale. L’analyse histologique des poumons de souris décellularisés a révélé des structures alvéolaires intactes, sans composants cellulaires restants. Des poumons de souris recellularisés avec trois fois 10 à la puissance sept HUVEC après deux jours de culture en bioréacteur basé sur la perfusion, ont montré une distribution homogène des HUVEC. Les HUVECs ont migré dans les zones alvéolaires périphériques, formant un réseau capillaire, comme observé dans les poumons recullularisés.