Procédure pour l'ingénierie du poumon

L’objectif global de cette procédure est de générer du tissu pulmonaire en culture qui est morphologiquement et physiologiquement comparable au tissu pulmonaire natif. Pour ce faire, on prélève d’abord le cœur et les poumons d’un rat adulte. L’étape suivante consiste à canuler l’artère pulmonaire et la trachée et à connecter les poumons canulés à un bioréacteur pour la décellularisation.

Après la décellularisation et le rinçage, le poumon est transféré dans un bioréacteur de culture stérile et préparé pour l’installation. La dernière étape de la procédure consiste à ensemencer le compartiment souhaité du poumon avec une population cellulaire préparée. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que la matrice extracellulaire décellularisée est efficacement repeuplée de cellules exprimant des marqueurs pulmonaires spécifiques à la région grâce à la microscopie d’immunofluorescence.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de culture de cellules pulmonaires in vitro est que les cellules conservent des phénotypes différenciés pendant une période prolongée, de sorte qu’elles peuvent être étudiées pendant plusieurs semaines dans un substrat tridimensionnel dérivé biologiquement. Pour la décellularisation, les poumons sont reliés au capuchon du bioréacteur via la canule vasculaire, et le capuchon est connecté à l’appareil de décellularisation. La bouteille en verre au-dessus des poumons est maintenue en place par un support à anneaux et une pince attachée.

À ce stade, le matériel cellulaire peut être retiré pour produire un échafaudage de matrice extracellulaire, qui peut être repeuplé avec du matériel cellulaire. L’assemblage du bioréacteur pour l’ensemencement et la culture de tissus pulmonaires modifiés est illustré dans ce schéma. Le connecteur de verrouillage du leurre de la canule trachéale se connecte à une boucle respiratoire entre le réservoir de la trachée et la chambre principale.

La boucle respiratoire comprend deux valves unidirectionnelles. Positions telles que le milieu suit un chemin différent dans et hors du poumon. Un petit réservoir est temporairement incorporé dans la ligne de perfusion pour l’ensemencement des cellules endothéliales.

Une pompe pulsatile est utilisée pour transporter les cellules du réservoir vers le compartiment vasculaire du poumon. La perfusion vasculaire est assurée à l’aide d’une pompe à rouleau. Le milieu est perfusé dans l’artère pulmonaire via la canule attachée, s’écoule à travers le système vasculaire pulmonaire et sort de la veine pulmonaire directement dans le bioréacteur principal où le milieu est prélevé pour la perfusion.

L’épithélium pulmonaire est installé par injection dans la boucle respiratoire. La chambre principale contenant le poumon et le réservoir de la trachée sont utilisés pour la culture pulmonaire à long terme. Lorsque les poumons ont été extraits et que l’artère et la trachée sont correctement canulées, les poumons fraîchement extraits devraient retenir l’air sans fuir.

Cela peut être vérifié en les gonflant avec de l’air alors qu’ils sont immergés dans un liquide. Il ne doit pas y avoir de bulles indiquant des fuites d’air. Pour commencer le protocole, les poumons sont gonflés avec du PBS contenant du nitropresse de sodium jusqu’à ce que les poumons soient pleins mais pas surgonflés

Ensuite, perfuser les poumons avec du PBS et du SNP pendant au moins 15 minutes à 15 millimètres de mercure. Après cela, retirez le bouchon de la canule trachéale pour permettre aux poumons de se dégonfler. Poursuivre la perfusion avec PBS et SNP pendant 15 à 30 minutes si nécessaire.

Remplissez le PBS et le SNP pour vous assurer que la pression de profusion est maintenue à 10 à 15 millimètres de mercure. Pour commencer la procédure de décellularisation longue, le capuchon du bioréacteur est connecté à l’appareil de décellularisation. Ensuite, les poumons sont connectés au chapeau.

À l’aide des connexions de verrouillage du leurre reliées à la canule en forme de YS, la canule de l’artère pulmonaire doit se connecter à la ligne de perfusion et la canule trachéale doit flotter librement. Pour assurer une décellularisation complète des tissus, il est crucial de garder l’air hors du système. Les valves unidirectionnelles dans la canule artérielle et trachéale aident à éliminer les bulles d’air dans le tube en permettant l’inversion du flux dans le tube.

Par conséquent, en permettant aux bulles d’air d’être éliminées à l’aide d’une seringue, assurez-vous que toutes les conduites sont exemptes d’air. Commencer la perfusion avec une solution de décellularisation. Perfusé avec une solution de décellularisation.

Jusqu’à ce que 500 millilitres de solution aient pénétré dans les poumons, la pression optimale est inférieure à 15 millimètres de mercure. Cela prendra généralement 2,5 heures. Les débits sont généralement très lents au début et augmentent rapidement au cours de la deuxième heure jusqu’à environ un millilitre par minute ou plus.

Au cours de la perfusion, le liquide de décellularisation utilisé du bioréacteur a été retiré périodiquement tout en veillant à ce qu’il reste suffisamment de liquide pour soutenir le poumon et la canule trachéale. Lorsque la perfusion avec le liquide de décellularisation est terminée, transférez les poumons et le bioréacteur dans une hotte de culture tissulaire. Pour commencer le rinçage des organes, retirez le pot de 500 millilitres qui contient le liquide de décellularisation et remplacez-le par un pot stérile contenant jusqu’à un litre de PBS stérile.

Utilisez une aspiration sous vide ou une seringue pour vous assurer que les conduites sont exemptes d’air, perfuser le PBS à travers le système vasculaire à 10 à 15 millimètres de mercure de la même manière. En ce qui concerne la décellularisation, à l’aide de techniques stériles, on retire périodiquement les déchets de PBS du bioréacteur et on remplace ou on remplit le bocal de PBS. Avec du PBS frais et stérile, continuez à rincer jusqu’à ce qu’au moins 2,5 litres de PBS stérile aient perfusé les poumons.

Cela prendra généralement deux jours à partir du début du processus de décellularisation, une fois le rinçage terminé. Transférez les poumons dans un nouveau système de bioréacteur stérile contenant du PBS frais plus 10 % de FBS plus 10 % de streptocoque Pen, assurez-vous que toute l’anse de perfusion et toutes les voies respiratoires sont remplies de liquide. À partir de là, une pompe pulsatile sera utilisée pour perfuser les poumons à cinq millimètres par minute.

Stérilisez l’échafaudage de la matrice extracellulaire pulmonaire par perfusion nocturne avec du PBS contenant 10 % de FBS et 10 % de pénicilline streptomycine. Une fois cette étape terminée, transférez les poumons dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure ou jusqu’à ce que la température soit équilibrée. En préparation au traitement par Ben Nase, l’étape suivante consiste à traiter les poumons avec Ben Nase.

Pour éliminer l’ADN restant de chaque poumon, remplissez d’abord une seringue de 10 millilitres avec un tampon Prewarm Ben Nase uniquement, et une seringue de 10 millilitres avec 90 unités par millilitre. Ben Nase dilué dans un tampon Ben Nase. Arrêter la perfusion des poumons.

Gonflez ensuite les voies respiratoires avec le tampon Ben Nase tout en évitant d’injecter de l’air dans le poumon. Laissez le poumon se dégonfler pendant une minute. Gonflez ensuite le poumon avec la solution de Ben Nase.

Encore une fois, en faisant attention de ne pas introduire d’air dans les poumons après avoir gonflé avec du Ben Nase. Laissez les poumons reposer sans perfusion ni ventilation à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’heure qui suit, reprenez la perfusion avec le PBS plus 10 % FBS 10 % de pénicilline streptomycine qui se trouve déjà dans le bioréacteur et poursuivez la perfusion pendant la nuit du lendemain.

Après le rinçage et la stérilisation, le long échafaudage de matrice extracellulaire peut être préparé pour le repeuplement cellulaire. Remplacez la solution de benzo P-B-S-F-B-S par 250 millilitres de culture. Imprégner le milieu pendant au moins une heure avant l’introduction des cellules et le remplacer par un milieu de culture frais directement avant l’ensemencement des cellules.

De nombreuses sources cellulaires peuvent être utilisées pour le recul des organes. Ici, l’assise avec une population de cellules épithéliales sera démontrée. Tout d’abord, préparez une seringue contenant 15 millilitres d’une suspension cellulaire de la population de cellules épithéliales souhaitée.

Ensuite, remplissez le réservoir des voies respiratoires avec 80 millilitres de milieu de culture et assurez-vous que toutes les conduites de ventilation sont exemptes d’air. Placez ensuite le bioréacteur dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et connectez la pompe à seringue pour la ventilation. Ensemencez les cellules dans les poumons à l’aide d’un seul bolus rapide en injectant la suspension cellulaire de 15 millilitres dans la canule trachéale.

Assurez-vous que les filtres à air du bioréacteur principal sont bouchés. Ensuite, commencez immédiatement une seule respiration lente à l’aide de la pompe à seringue pour prélever 60 millilitres d’air du bioréacteur principal à raison de trois millilitres par minute. Cela durera environ 20 minutes.

A laisser les poumons reposer statiquement pendant environ 18 heures après cela. Commencer la perfusion vasculaire lente à environ 0,5 millilitre par minute. Lors de la culture d’organes, la perfusion est généralement effectuée à raison d’un à trois millilitres par minute.

À l’aide d’une pompe à rouleaux pendant la culture épithéliale, la ventilation est généralement fournie à un rythme continu d’une respiration par minute et un volume courant de cinq à 10 millilitres. À l’aide d’une pompe à seringue, l’air est cycliquement prélevé et injecté dans le bioréacteur pour affecter la respiration en alternant entre la pression négative et la pression atmosphérique à l’intérieur de la chambre principale. En raison de la nécessité de maintenir le bioréacteur étanche à l’air pendant la ventilation, la ventilation doit être interrompue quotidiennement et l’air de la chambre principale doit être renouvelé.

De plus, le support doit être changé environ tous les trois à quatre jours. Au cours de la culture, environ la moitié du volume total doit être remplacée à chaque fois par la culture de l’épithélium pulmonaire et de l’endothélium vasculaire. À l’intérieur de l’échafaudage monté sur le bioréacteur, nous sommes en mesure de générer du tissu pulmonaire capable de participer à l’échange gazeux pendant de courts intervalles de temps.

Une coloration standard à l’hémat, au toin et à l’eoïn d’un poumon de rat natif est présentée ici pour comparaison avec une coloration H et e d’un poumon de rat décellularisé. La matrice extracellulaire décellularisée finale doit être complètement dépourvue de matériaux cellulaires et conserver les caractéristiques macroscopiques, microscopiques et ultrastructurelles du poumon natif. Les colorations h et e permettront de visualiser tout ADN résiduel, collé à l’échafaudage à la suite d’une décellularisation insuffisante ou d’un rinçage dans des conditions optimales pour l’ensemencement cellulaire et la culture ultérieure du poumon.

De plus, le bioréacteur devrait produire des cellules bien réparties dans les cinq lobes du poumon et couvrir environ 70 % de l’échafaudage de la matrice extracellulaire. Ces images comparent le poumon natif au poumon repeuplé lorsqu’il est coloré par immunofluorescence. Pour les marqueurs pulmonaires clés, la population de cellules cultivées est positive pour la protéine sécrétoire de Clara et la protéine sécrétoire C et l’aquaporine cinq.

Les marqueurs d’intérêt sont représentés en rouge et les noyaux colorés au DAPI sont en bleu dans tous les panneaux. Une fois maîtrisée, cette procédure, de la décellularisation au recul, peut être effectuée en quatre à cinq jours si elle est effectuée correctement.