Décellularisation et recellularisation pulmonaires de primates non humains à l’aide d’un bioréacteur spécialisé à grands organes

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des matrices biologiques d’organes entiers des poumons de Reus Maccas et d’utiliser ces matrices comme échafaudages pour étudier les applications d’ingénierie tissulaire pulmonaire. Ceci est accompli en décellularisant d’abord des poumons entiers de Maca Reuss avec des détergents, des sels et des enzymes. La deuxième étape consiste à installer les échafaudages pulmonaires décellularisés dans un bioréacteur capable à la fois de ventiler les voies respiratoires et de perfuser le système vasculaire pulmonaire avec des milieux de culture cellulaire liquides.

Ensuite, les échafaudages pulmonaires sont assis avec des cellules souches via les voies respiratoires et des cellules endothéliales via le système vasculaire pulmonaire. La dernière étape consiste à cultiver les cellules à l’intérieur de l’échafaudage pulmonaire dans les conditions de ventilation et de perfusion fournies par le bioréacteur pendant la durée souhaitée, suivie d’une analyse de la morphologie cellulaire et tissulaire résultante. En fin de compte, la réisation d’échafaudages pulmonaires acellulaires de Maca avec des cellules souches et des cellules endothéliales permet d’obtenir des tissus modifiés qui imitent les caractéristiques anatomiques et histologiques des tissus pulmonaires natifs.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’ingénierie des tissus pulmonaires, par exemple si les cellules souches ou progénitrices peuvent être utilisées pour régénérer le tissu pulmonaire, seules ou de concert avec des cellules épithéliales et endothéliales pulmonaires matures. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies pulmonaires en phase terminale, car l’intégration de matrices pulmonaires acellulaires avec des cellules souches ou progénitrices dérivées de patients a le potentiel d’augmenter le nombre de poumons de donneurs disponibles pour la transplantation pulmonaire. De plus, les poumons résultants modifiés à l’aide des propres cellules souches du patient peuvent être résistants au rejet immunitaire.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons visionné une vidéo de Joe précédemment publiée par des membres du laboratoire du Dr Laura Nicholson à l’Université de Yale. Nous présentons ici les modifications apportées à leur procédure pour les rongeurs afin de répondre aux besoins de notre modèle de grand animal Resus Meac. Il faut prendre les plus grands précautions pour prévenir les incidents d’exposition infectieuse lors du travail avec des tissus de maca.

Avant de manipuler des tissus de primates non humains, enfilez un équipement de protection individuelle comprenant un masque chirurgical, un écran facial, une couche de gants chirurgicaux, une blouse jetable et une deuxième couche de gants chirurgicaux avec les poumons à plat dans un plateau de dissection, canulez l’artère pulmonaire à l’aide d’un connecteur de leurre femelle avec une ardillon de taille appropriée. Fixez la canule en place à l’aide d’un collier de serrage stérilisé à l’alcool. Glissez une attache zippée en plastique autour de la trachée.

Insérez un connecteur de leurre femelle dans l’ouverture trachéale et serrez l’attache zippée autour de l’ardillon du connecteur pour maintenir la trachée en place autour de l’ardillon. Éliminez l’air emprisonné des poumons en instillant une solution saline tamponnée au phosphate ou PBS contenant 30 unités par millilitre d’héparine et cinq microgrammes par millilitre de nitropresse de sodium. Les SNP abrégés permettent à la solution d’être expulsée par le recul naturel avant de répéter.

Installation deux fois de plus après l’installation de la troisième voie respiratoire avec la solution PBS Heparine SNP. Boucher la canule du leurre trachéal avec un bouchon de leurre. Coupez l’apex du cœur et irriguez les ventricules internes avec de l’héparine PBS SNP pour éliminer le sang résiduel lacérer les deux oreillettes pour faciliter le drainage des circuits pulmonaires lors de la perfusion.

Fixez une seringue de 60 cc remplie de la solution PBS Heparine SNP à la canule de l’artère pulmonaire et retirez délicatement le piston pour permettre au liquide de s’écouler dans le système vasculaire. Retirez le bouchon de la canule trachéale et laissez le liquide des voies respiratoires être expulsé par le recul naturel. Poursuivez la perfusion jusqu’à ce que la plus grande partie possible du système vasculaire pulmonaire soit retirée.

L’aspect le plus difficile de la procédure est de rincer et de laver efficacement les voies respiratoires pulmonaires Avec les liquides, l’écoulement des liquides est inhibé par rapport aux gaz car les voies respiratoires ne sont pas destinées à conduire des liquides, le temps et les patients sont nécessaires pour accomplir ces étapes, nous vous conseillons de continuer avec le protocole, malgré le liquide résiduel restant dans les voies respiratoires à mesure que la décellularisation progresse et que les débris cellulaires sont évacués, la viscosité du fluide restera faible et les poumons seront en mesure d’expulser efficacement les liquides dès le premier jour. Immergez le bloc cœur-poumon dans de l’eau déminéralisée, gonflez et perfuser le poumon avec de l’eau désionisée à l’aide de seringues de 60 cc fixées respectivement à la canule trachéale et à la canule artérielle immergées. Répétez efficacement les lavages des voies respiratoires et vasculaires avec de l’eau déminéralisée.

Quatre fois de plus pour un total de cinq rinçages d’environ 0,5 à un litre chacun après cinq lavages, retirez les poumons de l’eau et immergez le bloc dans la solution Triton. Gonflez et perfuser les poumons avec la solution Triton. Comme précédemment, répétez l’installation une deuxième fois et incubez les organes immergés dans la solution Triton pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Après une nuit d’incubation, retirez le bloc pulmonaire de la solution Triton et lavez-le à l’extérieur avec de l’eau désionisée. Ensuite, immergez le bloc dans de l’eau douce déminéralisée. Instillez l’eau déminéralisée dans la trachée et l’artère pulmonaire cinq fois pour éliminer la solution Triton et les débris cellulaires.

Retirez les poumons de l’eau désionisée et immergez-les dans une solution de désoxyate de sodium à 2 % ou de SDC. Gonflez et perfuser avec la solution SDC de la même manière. Immergez les poumons dans une solution de SDC pendant la nuit à quatre degrés Celsius le troisième jour.

Lavez à nouveau le tissu avec de l’eau déminéralisée à l’extérieur et à travers les voies respiratoires et le système vasculaire cinq fois. Comme précédemment, retirez le tissu de l’eau désionisée et immergez-le dans la solution molaire de chlorure de sodium. Gonflez et perfuser avec une solution de chlorure de sodium comme précédemment, et immergez le tissu dans une solution de chlorure de sodium pendant une heure à température ambiante après avoir lavé les poumons de la solution de chlorure de sodium avec cinq rinçages à l’eau déminéralisée.

Comme précédemment, baignez-les dans une solution d’ADN frais et instillez cette solution dans les voies respiratoires et le système vasculaire. Incuber les poumons dans une solution d’ADN pendant une heure à température ambiante. Retirez ensuite les poumons de la solution d’ADN et lavez-les à l’extérieur avec une solution de PBS.

Immergez les poumons dans une solution de PBS et lavez cette solution cinq fois par les voies respiratoires et le système vasculaire. Comme précédemment, conservez les poumons dans une solution PBS dans un récipient scellé pendant la nuit à quatre degrés Celsius le quatrième jour. Lavez les poumons dans une solution PBS fraîche et glacée cinq fois par les voies respiratoires et le système vasculaire.

Ensuite, conservez-les dans une solution PBS dans un récipient stérile scellé à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Assembler les composants du bioréacteur sous une hotte à flux laminaire selon le schéma. Dans le protocole de texte, remplissez la chambre principale avec un milieu de culture qui a été équilibré à l’atmosphère de 5 % de CO2 d’un incubateur de culture cellulaire immédiatement avant l’utilisation dans le bioréacteur, appliquez les adaptateurs de canule trachéale et vasculaire sur la canule pulmonaire.

Installez les organes dans la chambre principale du bioréacteur en baignant les poumons dans le milieu de culture et en fixant les adaptateurs de canule aux orifices appropriés du couvercle modifié. Une fois connecté, fixez le couvercle de manière sûre et ferme. La chambre ne sera pas ouverte à nouveau pendant la durée de l’aspiration de l’air de la tubulure à l’aide des orifices de la seringue et d’une seringue 60 CCC équipée d’une aiguille de calibre 18 déplaçant la directionnalité des robinets d’arrêt à trois voies pour diriger l’écoulement du liquide dans la seringue.

Déplacez les chambres de bioréacteur scellées et contiguës avec les organes installés vers un incubateur de culture tissulaire pour équilibrer la température et le gaz. Aérer les poumons à l’aide d’un tire-seringue fixé à la chambre principale à environ une respiration complète toutes les deux minutes, et perfuser le système vasculaire via la pompe péristaltique à environ 10 millilitres par minute pour un total de 30 minutes pour les voies respiratoires. Gonflez les poumons avec la suspension cellulaire en injectant doucement à travers l’orifice de seringue fixé au robinet d’arrêt à trois voies dans la boucle respiratoire.

Maintenez les poumons statiquement à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 pendant la nuit sans voies respiratoires ni perfusion vasculaire pour permettre aux cellules de se fixer à la matrice pulmonaire décellularisée. Après une nuit d’incubation, relancer le programme standard de ventilation des voies respiratoires et cultiver les organes pendant trois à sept jours pour la mise en place vasculaire. La directionnalité de la voie d’écoulement peut être modifiée de la chambre principale à un réservoir endothéliale en tournant la vanne sur le robinet d’arrêt positionné dans la tubulure reliant ces deux compartiments, ensemencer progressivement les cellules endothéliales à l’aide de la pompe péristaltique tout en agitant doucement à l’aide de l’agitation magnétique lorsque l’ensemencement est terminé.

Piétinement, perfusion et incubation statique pendant environ quatre à six heures. Recommencer la perfusion vasculaire avec le milieu de la chambre principale à un rythme d’environ 10 millilitres par minute. Culture pendant trois à sept jours avec perfusion vasculaire continue en même temps que la période de culture par ventilation des voies respiratoires.

Tout au long du processus de décellularisation, les poumons MCCA ont présenté un blanchiment progressif culminant dans une apparence translucide à la fin du processus. Cependant, les poumons ont conservé leurs caractéristiques anatomiques grossières et sont restés largement élastiques et capables de produire un recul naturel après gonflage avec un liquide. Au niveau microscopique.

L’ultrastructure histologique est restée intacte après la décellularisation. C’est-à-dire bronchiques, respiratoires, bronchiques, sacs alvéolaires. Les vaisseaux sanguins et les capillaires étaient encore clairement distinguables par la microscopie de faible puissance.

La microanatomie histologique, cependant, a démontré que si l’anatomie macroscopique et l’ultrastructure du poumon étaient légèrement perturbées par la décellularisation, le tissu manquait complètement de cellules intactes, comme on le voit ici. Seules des traces d’ADN sont restées dans les tissus décellularisés. De plus, l’ADN trace, qui a été concentré par précipitation d’alcool et visualisé dans un gel AROS à 0,8 %, était composé principalement de fragments dégradés de faible poids moléculaire.

L’efficacité de l’élimination des protéines cellulaires a été évaluée par des analyses par transfert Western des protéines pulmonaires natives et décellularisées. Lysats utilisant un anticorps contre la bêta-actine, la bêta-actine a été facilement détectée dans les lysats pulmonaires natifs, mais pas dans les lysats pulmonaires décellularisés, ce qui suggère que la décellularisation a considérablement appauvri les cellules et a retiré le matériel protéique associé aux cellules 14 jours après l’ensemencement des voies respiratoires avec des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de maca ou BMC et une culture en bioréacteur avec environ un cycle d’expiration d’inspiration toutes les deux minutes. Le parenchyme des poumons de Maca décellularisée a été effectivement identifié.

Les BMC ont tapissé les septus alvéolaires tout en maintenant une lumière alvéolaire claire et ouverte. La matrice dénudée des grandes voies respiratoires a également été isée par des BMC à l’aide du bioréacteur, la surface luminale d’une bronche de tige principale a été tapissée d’une monocouche de BMC squameux après 14 jours de culture. Dans le bioréacteur montré ici se trouve un lobe pulmonaire reus décellularisé cinq jours après l’ensemencement du système vasculaire avec des cellules endothéliales microvasculaires et fournissant une perfusion vasculaire constante avec un milieu de culture endothéliale à cinq millilitres par minute.

L’analyse histologique a révélé la présence de cellules tapissant le petit système vasculaire dans le parenchyme pulmonaire. Dans certains cas, les cellules semblaient être attachées à la matrice via plusieurs projections cellulaires à travers la lumière, tandis que d’autres coupes transversales de vaisseaux montraient des cellules tapissant la surface endothéliale d’une lumière claire. En suivant cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’immunohistochimie, le western blot et la PCR quantitative en temps réel peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la différenciation des cellules souches ensemencées en cellules de lignée pulmonaire une fois cultivées sur la matrice pulmonaire acellulaire ou avec des cellules épithéliales et endothéliales matures dans le bioréacteur. Après avoir regardé cette vidéo, nous devrions avoir une bonne compréhension de la façon de décellulariser les poumons de primates non humains et d’utiliser ensuite les poumons acellulaires résultants comme échafaudages pour la culture de cellules souches, de cellules épithéliales et de cellules endothéliales dans un système de bioréacteur. N’oubliez pas que travailler avec des tissus de primates non humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle complet, y compris un écran facial et une double couche de gants en latex ou en nitrile, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.