Name: Détection et surveillance de lADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez la détection de mutations tumorales par PCR digitale en gouttelettes dans les biofluides patients. Cette méthode non invasive permet le suivi longitudinal des charges mutationnelles sans biopsie chirurgicale.

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Les auteurs souhaitent souligner la générosité de tous les patients et de leurs familles. Ce travail a été soutenu par le financement de la Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), la V Foundation (Atlanta, GA), Le Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, Clinical and Translational Science Institute at Children's National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), The Lilabean Foundation for Pediatric Brain Cancer Research (Silver Spring, MD), Childhood Brain Tumor Foundation (Germantown, MD), the Children's Brain Tumor Tissue Consortium (Philadelphie, PA), et Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, GA).

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La méthode décrite dans ce manuscrit est incluse dans une demande internationale de brevet "Méthodes pour détecter les biomarqueurs du cancer" par Javad Nazarian et Eshini Panditharatna.

Ici nous avons présenté notre méthode pour détecter et quantifier la fréquence allélique des mutations de tumeur dans cfDNA de la biopsie liquide patiente. Nous mettons l'accent sur les étapes critiques pour le succès de cette méthode, y compris le traitement pré-analytique de l'échantillon, l'extraction de l'ADNc, la conception des analyses PCR et l'analyse des données. Pour limiter le volume d'échantillon utilisé, l'ADNccf est extrait de 1 ml de plasma, mais seulement 500 L de CSF. Lors de l'extraction de CSF, le protocole pour l'extraction de 1 ml d'urine (suivant le manuel du kit d'extraction de l'ADNc12) est utilisé, conformément à la recommandation du fabricant. La différence dans le volume d'échantillon exigé entre le plasma et cSF est due aux niveaux plus bas de cfDNA tumeur-spécifique dans le plasma comparé à CSF des patients présentant des tumeurs de cerveau, nécessitant de plus grands volumes d'échantillon pour la détectiondemutation 8. Si l'échantillon est disponible, plus de 1 ml de plasma peut être extrait pour produire un rendement d'ADN plus élevé. Cependant, dans le cas des patients pédiatriques, il est important de réduire au minimum la quantité de sang utilisée chaque fois que possible, car même une procédure simple telle que le prélèvement de sang est fatigante pour les patients pédiatriques avec des cancers subissant des thérapies de rayonnement. L'extraction d'aliquots de 1 ml de plasma permet également de reproduire les extractions, de sorte que l'analyse peut être répétée (par exemple, en cas d'échec dans l'extraction de l'ADN ou la contamination de l'échantillon).
Dans un effort pour réduire toute utilisation d'échantillon qui n'est pas strictement nécessaire, cfDNA n'est généralement pas quantifié. Cependant, nous avons trouvé une gamme de concentrations de cfDNA entre 0.2-2 ng/L et 0.6-13 ng/L dans le plasma et cSF, respectivement. Compte tenu de la faible quantité d'ADNc cf, et le fait que les allèles mutants spécifiques à la tumeur sont présents à une basse fréquence, une étape de pré-amplification en utilisant le même ensemble d'amorces utilisées pour dPCR est nécessaire pour augmenter considérablement la quantité d'ADN cible dans l'échantillon, aidant à détection de mutation8. La dilution du produit préamplifié dans le tampon de suspension d'ADN fournit un volume suffisant pour les répliques techniques, ce qui aide à distinguer les vrais positifs. Étant donné que le nombre de gouttelettes mutantes peut être faible (par exemple, entre 0-2 gouttelettes mutantes dans un échantillon de plasma), l'inclusion de répliques techniques est essentielle pour résoudre le statut de mutation. Tandis qu'un PUITS de PCR peut produire 0 gouttelettes mutantes, les deux autres peuvent donner 1-2 pour un échantillon simple de plasma analysé dans le triplicate ; ainsi, l'inclusion des répliques permet une plus grande précision lors de la détermination du statut de mutation. Le MAF est ensuite calculé comme la moyenne des valeurs de repli.
La préamplification multiplexée (préamplification du type sauvage et des allèles mutants de deux mutations d'intérêt) augmente l'utilité d'un seul échantillon, car le même matériau de départ peut être utilisé pour tester deux mutations. Fait important, un produit de préamplification multiplex peut être analysé en singleplex pendant dPCR pour une plus grande simplicité, comme décrit ici. Cependant, pcR de préamplification et dPCR peuvent être multiplexed. Lors du multiplexage, les conditions doivent être optimisées pour les deux ensembles d'amorces et de sondes : les températures d'annelage des amorces doivent être similaires à celles qui s'exécutent ensemble dans l'amplification du PCR, et les sondes doivent être conçues pour générer des amas distincts (basés sur le signal fluorescent et intensité). Lors de la validation d'un nouvel ensemble d'amorces et de sondes, exécutez un gradient de température annealing pour déterminer la température d'annealing optimale basée sur la gamme suggérée par le fabricant. Avant de tester les sondes sur des échantillons patients d'ADNc, validez-les à l'aide de constructions d'ADN synthétiqueets et/ou d'adans de tissus tumoraux de différentes entrées (c.-à-d. jusqu'à 10 ng).
Pour la détection des allèles mutants avec une plus grande spécificité et des décalages réduits dans l'hybridation de la sonde à l'ADN cible, des sondes verrouillées d'acide nucléique (LNA) sont utilisées. LNA est un analogue d'acide nucléique avec un pont de méthylène reliant le 2'-oxygène et 4'-carbone de l'anneau de ribose9. Le pont de méthylène verrouille l'acide nucléique dans une conformation biccyclique rigide qui limite la flexibilité, augmente la stabilité thermique duplex, et améliore la spécificité de l'hybridation de sonde pour cibler l'ADN10,18, 19. S'il existe un décalage de base unique entre la sonde LNA et l'ADN du modèle, la formation duplex entre la sonde et la cible se déstabilisera. En tant que tel, les sondes LNA améliorent la spécificité de la liaison de sonde et donnent lieu à un rapport signal-bruit plus élevé11. L'analyse du plasma et du CSF des patients pédiatriques non-CNS-diseased a établi la spécificité de notre analyse avec des sondes de LNA ciblant H3F3A p.K27M, pour déterminer qu'une fréquence allélique égale ou inférieure à 0.001% est considérée un faux positif 8. Pour des considérations supplémentaires pour optimiser la conception des sondes et des amorces, y compris le contenu de GC, la taille d'amplicon, les colorants de journaliste de sonde, et les quenchers, se référer aux directives de fabricant de dPCR14,17. Bien que notre méthode soit optimisée pour une utilisation avec le système RainDance, le protocole peut être adapté pour une utilisation avec d'autres plates-formes dPCR.
La méthode présentée ici tire la force de la sensibilité élevée et de l'enrichissement cible réalisé par dPCR, qui reste la plate-forme de choix pour détecter les mutations tumorales rares dans cfDNA. Bien que puissant, dPCR est limité dans le nombre de mutations qui peuvent être testés dans un seul essai. Une alternative au dPCR est le séquençage de prochaine génération (NGS), qui peut détecter des mutations multiples à travers de nombreux gènes, augmentant l'utilité d'un seul échantillon. NGS peut détecter des mutations dans CSF et plasma des patients présentant des gliomes de tronc cérébral20,cependant, est actuellement moins sensible que dPCR à détecter des mutations de tumeur dans cfDNA, avec des limites de détection de 0.1-10% MAF comparé à 0.001% dans les approches PCR-basées21 . dPCR réalise également un délai d'exécution plus rapide que NGS, permettant la détection rapide des mutations d'intérêt. L'approche PCR est applicable à tous les types de cancer et peut être étendue pour détecter les mutations des points chauds et l'ADNc22méthylé22 .
La biopsie liquide en est en effet à ses balbutiements et nécessitera un développement plus approfondi pour s'adapter à des maladies spécifiques. La surveillance tumorale dans le contexte de l'évolution tumorale sera le prochain défi, où une plate-forme capable de détecter les mutations émergentes avec une sensibilité élevée serait nécessaire. En outre, les plates-formes capables de détecter une variété de biomolécules (peptides, cytokines, ARN) seront très bénéfiques dans l'évaluation de la réponse tumorale au traitement, ainsi que l'avancement des interventions cliniques personnalisées.

En raison des limitations dans la disponibilité du tissu tumoral pour des analyses moléculaires, il y a un besoin pour le développement des méthodes fortement sensibles capables de détecter des mutations somatiques de tumeur dans les biofluides patients, y compris le plasma, le sérum et le fluide céphalo-rachidien (CSF) . Par exemple, les gliomes diffus pédiatriques de ligne médiane (DMG) présentent un défi dû à leur emplacement neuroanatomique. Au cours de la dernière décennie, le profilage moléculaire des spécimens de tissu de DMG a découvert des mutations de conducteur dans ce type de tumeur1 et a indiqué l'hétérogénéité spatiale et temporelle des mutations, rendant la biopsie nécessaire pour caractériser un patient dans une maladie sous-groupe et la promotion de thérapies à visée moléculaire2. En tant que tel, les essais cliniques préconisent l'intégration des biopsies chirurgicales pour le profilage moléculaire des tumeurs au diagnostic initial3,4,5,6. Pendant le traitement, la surveillance de la réponse thérapeutique dans les DMG est limitée à MRI, qui manque de sensibilité pour détecter de petits changements ou l'évolution génomique de tumeur. MRI est également enclin à détecter la pseudoprogression, inflammation passagère à l'emplacement dela tumeur qui imite la vraie progression sur la formation image et peut désinformer l'interprétation de la réponse de tumeur 7. Ainsi, DMGs représentent un type de tumeur avec un besoin élevé d'un autre, moyen mini-invasif de détecter des mutations de tumeur et de surveiller la réponse clinique. Afin de répondre à ces besoins, nous avons développé et optimisé un protocole pour détecter, et quantifier la fréquence allélique des mutations detumeur dans cfDNA du plasma, du sérum et du CSF des enfants avec des gliomes de ligne médiane 8. Étant donné que les DGM de l'enfance sont souvent une mutation somatique de lysine-à-méthionine à la position 27 de la variante d'histone H3.1 (H3.1K27M, 20% des cas) ou H3.3 (H3.3K27M, 60% des cas)1, ces mutations et d'autres caractéristiques des DMG (c.-à-d., ACVR1, PIK3R1) ont été visées pour quantification de l'allele mutant à l'aide de cfDNA8. Cet analyse peut être adapté pour détecter les mutations hotspot dans d'autres types de tumeurs à l'aide d'amorces et de sondes spécifiques à la séquence. La polyvalence de cette approche la rend applicable à une variété de cancers qui bénéficieraient de l'intégration d'outils diagnostiques à base de cfDNA et d'une surveillance thérapeutique.
Pour détecter avec sensibilité les mutations de basse fréquence allélique dans cfDNA, nous employons une approche numérique de PCR de gouttelette (dPCR). Dans cette méthode, le mélange de réaction PCR est divisé en un maximum théorique de 10 millions de gouttelettes à l'aide de la plate-forme dPCR (par exemple, RainDance), avec 7-9 millions de gouttelettes par PCR bien vu expérimentalement. En raison du degré élevé de partitionnement de l'échantillon, au plus une à deux molécules d'ADN peuvent être présentes dans chaque gouttelette. L'amplification de PCR et l'hybridation de sonde fluorescente de séquence-spécifique peuvent se produire dans chaque gouttelette, de sorte que des millions de réactions aient lieu. Cela maximise la sensibilité et permet la détection d'allèles mutants rares, qui pourraient autrement passer inaperçus sur un fond d'ADN wildtype. L'utilisation de sondes d'acide nucléique verrouillé (LNA) améliore la spécificité de l'analyse en limitant l'hybridation de décalage et en soutenant la détection précise de mutation9,10,11. Ici, nous décrivons nos méthodes de traitement d'échantillon, d'extraction de cfDNA, de préamplification des alleles cibles, de dPCR et d'analyse de données.

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris-HCl, 0,1 mM Tampon de suspension pour l’ADN EDTA (pH 8,0)</td><td>Teknova</td><td>T0227</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2-EDTA 7,2 mg Tubes de prélèvement sanguin (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367525</td><td>Pour la collecte de plasma</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Tube de sérum en plastique avec bouchon Red BD Hemogard (10 mL)</td><td>Becton Dickinson Diagnostics</td><td>367895</td><td>Pour le prélèvement de sérum</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>General Fournisseur de</td><td></td><td></td>laboratoire</tr><tr><td>Tampon ATL</td><td>Qiagen</td><td>19076</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de prélèvement de sang d’ADN acellulaire</td><td>Streck</td><td>218961</td><td>cfDNA (en option)</td></tr><tr><td>Concentrateur CentriVap</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Conception personnalisée</td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Biologie moléculaire Qualité Éthanol absolu (200 proof)</td><td>Fournisseur général Fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutant Probe Mutant</td><td>DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Conception personnalisée</td></tr><tr><td>Tubes d’ADN ccf de sang PAXgene</td><td>PreAnalytiX</td><td>768115</td><td>cfDNA (en option)</td></tr><tr><td>Capuchons de tube de bandelette PCR 8 puits</td><td>VWR</td><td>10011-786</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de bandelettes PCR 8 puits</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (p20, p200, p1000)</td><td>Fournisseur</td><td></td><td></td>général de laboratoire</tr><tr><td>Pointes de filtre de pipette (p20, p200, p1000)</td><td>General Lab Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook&nbsp ;</td><td>Manuel du kit d’extraction d’ADNcf Qiagen (édition 2013)</td><td></td>Kit d’acide nucléique circulant QIAamp Kit d’extraction d’ADNcf Qiagen 55114 (Étape 4 du protocole)&nbsp ;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>Kit optionnel pour l’extraction d’ADN à partir de petits (< ou =200 &micro ; L) volumes d’échantillons</td></tr><tr><td>Qiavac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>À utiliser avec le kit d’acides nucléiques circulants QIAamp</td></tr><tr><td>Kit de consommables Raindance</td><td>Bio-Rad</td><td>20-04411</td><td>Contient des puces d’instrument génératrices de gouttelettes, des puces d’instrument de quantification, des capuchons de bandelettes PCR, y compris des capuchons à haute vitesse, et de l’huile stabilisatrice de gouttelettes</td></tr><tr><td>Instrument de quantification</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Raindance Sense (utilisé dans Étape 9 du protocole)</td></tr><tr><td>Instrument source Raindance</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Instrument générateur de gouttelettes (utilisé à l’étape 9 du protocole)</td></tr><tr><td>Logiciel RainDrop Analyst II</td><td>Logiciel RainDance Technologies</td><td></td><td>Analyst utilisé pour l’analyse des données (étape 10 du protocole)</td></tr><tr><td>Piège à vapeur réfrigéré</td><td>Savant</td><td>RVT5105-115</td><td></td></tr><tr><td>Amorce inverse</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Conception sur mesure</td></tr><tr><td>Smartblock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>05 412 506</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Génotypage Master Mix</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4371353</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>14 285 562PM</td><td></td></tr><tr><td>WT Probe</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td></td><td>Conception sur mesure</td></tr></tbody></table>

détection et surveillance de l'adn circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Les complications associées à l'échantillonnage initial et chirurgical de tissu présentent le besoin des plates-formes mini-invasives capables de la sous-classification moléculaire et de la surveillance temporelle de la réponse de tumeur à la thérapie. Ici, nous décrivons notre méthode dPCR-basée pour la détection des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN libre de cellules (CFDNA), facilement disponibles dans les biofluides patients. Bien que limitée dans le nombre de mutations qui peuvent être testées dans chaque essai, cette méthode fournit un niveau élevé de sensibilité et de spécificité. La surveillance de l'abondance de mutation, telle que calculée par MAF, permet l'évaluation de la réponse de tumeur à la thérapie, fournissant de ce fait un supplément bien nécessaire à la formation image radiographique.

La figure 1 montre des résultats représentatifs pour la détection réussie de la mutation H3F3A p.K27M dans le plasma préamplifié (panneau supérieur gauche) et l'ADNc CSF (panneau supérieur droit) de deux enfants atteints de DMG. cfDNA échantillons ont été analysés en réplique, mais un seul graphique représentatif est montré pour chaque type d'échantillon. Les parcelles dPCR montrent la génération réussie de gouttelettes, avec 7-9 millions de gouttelettes par puits de PCR (dont la plupart sont des gouttelettes négatives qui ne contiennent pas d'ADN cible). Un minimum de 7 millions de gouttelettes par puits PCR indique une dropletisation réussie, tandis que moins de 7 millions indiquent une défaillance de l'analyse, auquel cas l'utilisateur ne devrait pas procéder à l'analyse des données. La figure 1 montre une séparation claire entre les amas mutants et les amas de type sauvage le long des axes x et y, respectivement. Les grappes robustes de type sauvage indiquent que l'extraction de cfDNA a été réussie parce que l'ADN de modèle est présent. Les amas mutants montrent un MAF de 1,60% et 39,92% pour les échantillons de plasma et de CSF, respectivement, démontrant la détection positive de la mutation. Pour ces patients, les résultats de dPCR sont en conformité avec l'état de mutation de tumeur, comme confirmé par l'analyse génomique du tissu de tumeurdebiopsie 8. Le contrôle négatif (panneau inférieur gauche) montre 0 gouttelettes mutantes et 0 wildtype, ce qui indique qu'il n'y a pas eu de contamination du mélange de réaction PCR. Le gDNA positif de tissu de tumeur de contrôle (panneau droit inférieur) montre la mutation étant détectée à la fréquence allélique prévue pour l'échantillon particulier de tumeur choisi.
Dans la figure 2, des résultats représentatifs sont montrés pour la détection infructueuse de la mutation d'intérêt, H3F3A p.K27M, dans la cfDNA plasmatique d'un enfant avec DMG. L'état de mutation a étéconfirmé par l'analyse génomique du tissu de tumeur 8. Les résultats représentatifs de deux puits PCR répliqués sont affichés (panneaux supérieurs). Le nombre total de gouttelettes, y compris les gouttelettes négatives, se situe entre 7 et 9 millions par puits PCR, ce qui indique une baisse réussie. Les amas de type sauvage, tracés le long de l'axe y, montrent environ 7 à 8 000 gouttelettes de type sauvage par puits PCR pour l'ADNc plasmatique, ce qui indique une extraction réussie de l'ADNc (car il y a de l'ADN sauvage cible dans l'échantillon). Cependant, 0 gouttelettes mutantes sont détectées dans l'échantillon plasmatique. Le panneau inférieur gauche montre un contrôle négatif (MB H2O) sans wildtype ou gouttelettes mutantes; et le panneau inférieur droit montre le contrôle positif préamplifié gDNA tissu tutueux (0,025 ng) avec détection de mutation positive. Comme le montre ce chiffre, l'absence de détection de mutation dans le plasma peut ne pas nécessairement signifier que le patient est wildtype pour la mutation d'intérêt, comme de faux négatifs se produisent8. Dans certains cas, lorsque la mutation est manquée dans le plasma recueilli à la biopsie initiale, il est détecté dans le plasma obtenu à partir du même patient à un moment ultérieur8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2.jpg"> Figure 1 : Détection réussie de H3F3A H3F3A mutation de p.K27M dans le plasma préamplifié et l'ADNc cfDNA de CSF des enfants avec des gliomes de midline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59721/59721fig2.jpg"> Figure 2 : Faux résultats négatifs obtenus à partir de l'analyse d'un échantillon préamplifié de cfDNA plasmatique d'un patient connu pour abriter la mutation d'intérêt, H3F3A H3F3A p.K27M, dans la tumeur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59721/59721fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ici, nous présentons un protocole pour détecter des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN circulant présent dans les fluides biologiques patients (biofluides). Notre méthode numérique de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette (dPCR) permet de quantifier la fréquence allélique de mutation de tumeur (MAF), facilitant un complément mini-invasif au diagnostic et à la surveillance temporelle de la réponse de tumeur.

Détection et surveillance de l'ADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Ce protocole permet la détection des mutations associées à la tumeur et complète actuellement les procédures chirurgicales invasives. Une autre force est la capacité d’employer ce protocole pour surveiller la charge de mutation de tumeur des heures supplémentaires. La technique permet le génotypage tumoral sans nécessiter de biopsie réelle des tissus chirurgicaux qui est particulièrement utile pour les tumeurs dans des endroits difficiles, comme le tronc cérébral avec accès restreint aux tissus.En l’absence de biopsie répétée, les données moléculaires longitudinales ne sont pas disponibles pour compléter l’IRM. La surveillance numérique de PCR facilite un supplément moléculaire basé au diagnostic, permettant un processus plus éclairé de prise de décision de traitement. Des méthodes similaires peuvent être utilisées pour détecter l’expression des gènes en particulier système, avec fluo-4 conventionnels et quencher-liés sondes, mais avec une sensibilité plus élevée qu’avec le PCR quantitatif.Avant de commencer la procédure pcr numérique gouttelette, nettoyer l’espace banc et l’équipement avec 10% d’eau de Javel et 70% d’éthanol et vortex doucement et brièvement centrifuger tous les reagents, sauf l’huile de stabilisation gouttelette. Confirmez que la bouteille de gaz azoté comprimé est fixée à l’instrument générateur de gouttelettes et que le réservoir du cylindre est fixé à 90 livres par pouce carré. Et 38 microlitres de mélange numérique de réaction PCR directement dans le fond de chaque puits d’une bande de tube PCR de huit puits, en enlevant toutes les bulles avec une pointe propre pipette.Ajouter 12 microlitres d’échantillon d’ADN pré-amplifié en triplicate aux puits appropriés de la bande de tube. Pipette doucement le volume complet 10 fois pour mélanger le mélange de réaction avec l’échantillon d’ADN et pipette le volume complet de chaque puits dans les canaux correspondants A à H d’une puce d’instrument génératrice de gouttelettes. Insérez une nouvelle bande de tube PCR dans l’instrument générateur de gouttelettes et numérisez l’iD de puce d’instrument générateur de gouttelettes dans le logiciel sur l’ordinateur de l’instrument.Cliquez ensuite sur Démarrer la course pour commencer à déposer des échantillons. Lorsque la gouttelette est terminée, retirez la bande de tube PCR et appliquez des bouchons de bande de tube. Transférer la bande de tube sur un cycleur thermique et équilibrer le tube avec une autre bande de tube contenant 80 microlitres d’eau par puits.Ensuite, exécutez le cycleur thermique dans les conditions de cycle thermique appropriées. Remplacer les bouchons de bande par des bouchons à grande vitesse. Lorsque le cycle thermique est terminé, transférez la bande de tube à l’instrument de quantification, cliquez sur Configurer une course sur le logiciel d’instrument et placez la bande de tube dans l’instrument de quantification.Placez le bouclier métallique sur une nouvelle puce d’instrument de quantification, numérisez l’iD de la puce dans l’instrument et insérez la puce dans la machine. Fermez le couvercle de l’instrument. Dans le logiciel, entrez un nom pour l’exécuter PCR numérique et pour chacun des huit canaux, puis sélectionnez mode rapide et cliquez sur Démarrer pour commencer la quantification.Pour analyser les données spectrales brutes, lancez le logiciel d’analyste et ouvrez les fichiers fcs. Sous vue d’analyse, sélectionnez intact. Sous la vue de l’échantillon, cliquez sur les cases à côté de chacun des huit échantillons.Le logiciel tracera les signaux pour les allèles de type mutant et sauvage le long de l’axe x et y respectivement. Utilisez la fonction matricielle calculée pour demander la compensation spectrale sur les gouttelettes intactes, selon les instructeurs fabricants et ajuster les paramètres de l’axe sous les options de l’axe. Réglez l’axe x à un minimum de zéro et un maximum de 30 000 et l’axe y à un minimum de moins 5000 et un maximum de 10 000.Lorsque des grappes de gouttelettes ont été identifiées, ajustez l’axe pour réduire l’espace vide dans le graphique. Sélectionnez l’échantillon correspondant à l’ADN génomique positif du tissu tumoral pour définir les portes négatives de type mutant et sauvage, en veillant à ce que les grappes soient distinctes et facilement identifiables. Cliquez ensuite à droite et sélectionnez Appliquer tous les paramètres à des échantillons sélectionnés pour appliquer les paramètres de la porte pour le contrôle positif à tous les échantillons.Sous la vue graphique, cliquez sur plusieurs échantillons pour afficher les parcelles de tous les échantillons sélectionnés et exporter l’image sous forme de fichier tif. Ensuite, sous Workspace, sélectionnez Analyse d’exportation et enregistrez le fichier de données analysé comme fichier csv. Ici, des résultats représentatifs pour une détection réussie d’une mutation dans un plasma pré-amplifié et l’ADN libre de cellules de fluide céphalo-rachidien de deux enfants avec les gliomes diffus de midline sont montrés.Dans cette expérience, une séparation claire entre les amas de type mutant et sauvage peut être observée le long de l’axe x et y respectivement. Des grappes robustes de type sauvage indiquent que l’extraction d’ADN sans cellules a été un succès parce que l’ADN modèle est présent. Pour ces patients, les faisceaux mutants montrent une fréquence allélique de mutation de 1.6 et 39.32 pour cent pour les échantillons de plasma et de fluide céphalo-rachidien respectivement conformément au statut de mutation de tumeur tel que confirmé par l’analyse génomique du tissu de tumeur biopsié.Le contrôle négatif d’autre part montre zéro mutant et zéro gouttelettes sauvages de type indiquant qu’il n’y avait aucune contamination du mélange de réaction PCR. L’ADN génomique positif de tissu de tumeur de contrôle montre la mutation étant détectée à la fréquence allelic prévue pour l’échantillon particulier de tumeur choisi. L’absence de détection de mutation dans le plasma peut ne pas nécessairement signifier qu’un patient est de type sauvage pour la mutation d’intérêt que les faux négatifs ne se produisent.Par exemple, dans ce patient, bien que la mutation d’intérêt n’ait pas été détectée, le statut de mutation a été confirmé par l’analyse génomique du tissu de tumeur. Le PCR est une technique très sensible qui exige une décontamination fréquente de la zone de travail et de l’équipement pour éviter l’acquisition de données faussement positives.

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