Détection et surveillance de l'ADN circulant associé à la tumeur dans les biofluides des patients

Ce protocole permet la détection des mutations associées à la tumeur et complète actuellement les procédures chirurgicales invasives. Une autre force est la capacité d’employer ce protocole pour surveiller la charge de mutation de tumeur des heures supplémentaires. La technique permet le génotypage tumoral sans nécessiter de biopsie réelle des tissus chirurgicaux qui est particulièrement utile pour les tumeurs dans des endroits difficiles, comme le tronc cérébral avec accès restreint aux tissus.

En l’absence de biopsie répétée, les données moléculaires longitudinales ne sont pas disponibles pour compléter l’IRM. La surveillance numérique de PCR facilite un supplément moléculaire basé au diagnostic, permettant un processus plus éclairé de prise de décision de traitement. Des méthodes similaires peuvent être utilisées pour détecter l’expression des gènes en particulier système, avec fluo-4 conventionnels et quencher-liés sondes, mais avec une sensibilité plus élevée qu’avec le PCR quantitatif.

Avant de commencer la procédure pcr numérique gouttelette, nettoyer l’espace banc et l’équipement avec 10% d’eau de Javel et 70% d’éthanol et vortex doucement et brièvement centrifuger tous les reagents, sauf l’huile de stabilisation gouttelette. Confirmez que la bouteille de gaz azoté comprimé est fixée à l’instrument générateur de gouttelettes et que le réservoir du cylindre est fixé à 90 livres par pouce carré. Et 38 microlitres de mélange numérique de réaction PCR directement dans le fond de chaque puits d’une bande de tube PCR de huit puits, en enlevant toutes les bulles avec une pointe propre pipette.

Ajouter 12 microlitres d’échantillon d’ADN pré-amplifié en triplicate aux puits appropriés de la bande de tube. Pipette doucement le volume complet 10 fois pour mélanger le mélange de réaction avec l’échantillon d’ADN et pipette le volume complet de chaque puits dans les canaux correspondants A à H d’une puce d’instrument génératrice de gouttelettes. Insérez une nouvelle bande de tube PCR dans l’instrument générateur de gouttelettes et numérisez l’iD de puce d’instrument générateur de gouttelettes dans le logiciel sur l’ordinateur de l’instrument.

Cliquez ensuite sur Démarrer la course pour commencer à déposer des échantillons. Lorsque la gouttelette est terminée, retirez la bande de tube PCR et appliquez des bouchons de bande de tube. Transférer la bande de tube sur un cycleur thermique et équilibrer le tube avec une autre bande de tube contenant 80 microlitres d’eau par puits.

Ensuite, exécutez le cycleur thermique dans les conditions de cycle thermique appropriées. Remplacer les bouchons de bande par des bouchons à grande vitesse. Lorsque le cycle thermique est terminé, transférez la bande de tube à l’instrument de quantification, cliquez sur Configurer une course sur le logiciel d’instrument et placez la bande de tube dans l’instrument de quantification.

Placez le bouclier métallique sur une nouvelle puce d’instrument de quantification, numérisez l’iD de la puce dans l’instrument et insérez la puce dans la machine. Fermez le couvercle de l’instrument. Dans le logiciel, entrez un nom pour l’exécuter PCR numérique et pour chacun des huit canaux, puis sélectionnez mode rapide et cliquez sur Démarrer pour commencer la quantification.

Pour analyser les données spectrales brutes, lancez le logiciel d’analyste et ouvrez les fichiers fcs. Sous vue d’analyse, sélectionnez intact. Sous la vue de l’échantillon, cliquez sur les cases à côté de chacun des huit échantillons.

Le logiciel tracera les signaux pour les allèles de type mutant et sauvage le long de l’axe x et y respectivement. Utilisez la fonction matricielle calculée pour demander la compensation spectrale sur les gouttelettes intactes, selon les instructeurs fabricants et ajuster les paramètres de l’axe sous les options de l’axe. Réglez l’axe x à un minimum de zéro et un maximum de 30 000 et l’axe y à un minimum de moins 5000 et un maximum de 10 000.

Lorsque des grappes de gouttelettes ont été identifiées, ajustez l’axe pour réduire l’espace vide dans le graphique. Sélectionnez l’échantillon correspondant à l’ADN génomique positif du tissu tumoral pour définir les portes négatives de type mutant et sauvage, en veillant à ce que les grappes soient distinctes et facilement identifiables. Cliquez ensuite à droite et sélectionnez Appliquer tous les paramètres à des échantillons sélectionnés pour appliquer les paramètres de la porte pour le contrôle positif à tous les échantillons.

Sous la vue graphique, cliquez sur plusieurs échantillons pour afficher les parcelles de tous les échantillons sélectionnés et exporter l’image sous forme de fichier tif. Ensuite, sous Workspace, sélectionnez Analyse d’exportation et enregistrez le fichier de données analysé comme fichier csv. Ici, des résultats représentatifs pour une détection réussie d’une mutation dans un plasma pré-amplifié et l’ADN libre de cellules de fluide céphalo-rachidien de deux enfants avec les gliomes diffus de midline sont montrés.

Dans cette expérience, une séparation claire entre les amas de type mutant et sauvage peut être observée le long de l’axe x et y respectivement. Des grappes robustes de type sauvage indiquent que l’extraction d’ADN sans cellules a été un succès parce que l’ADN modèle est présent. Pour ces patients, les faisceaux mutants montrent une fréquence allélique de mutation de 1.6 et 39.32 pour cent pour les échantillons de plasma et de fluide céphalo-rachidien respectivement conformément au statut de mutation de tumeur tel que confirmé par l’analyse génomique du tissu de tumeur biopsié.

Le contrôle négatif d’autre part montre zéro mutant et zéro gouttelettes sauvages de type indiquant qu’il n’y avait aucune contamination du mélange de réaction PCR. L’ADN génomique positif de tissu de tumeur de contrôle montre la mutation étant détectée à la fréquence allelic prévue pour l’échantillon particulier de tumeur choisi. L’absence de détection de mutation dans le plasma peut ne pas nécessairement signifier qu’un patient est de type sauvage pour la mutation d’intérêt que les faux négatifs ne se produisent.

Par exemple, dans ce patient, bien que la mutation d’intérêt n’ait pas été détectée, le statut de mutation a été confirmé par l’analyse génomique du tissu de tumeur. Le PCR est une technique très sensible qui exige une décontamination fréquente de la zone de travail et de l’équipement pour éviter l’acquisition de données faussement positives.