Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l'étude des interactions ARN-protéine: L'IRE / IRP Exemple

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser les interactions entre les protéines d’ARN et les extraits cellulaires à l’aide d’un test de déplacement de mobilité électrophorétique. Ceci est réalisé en préparant d’abord un extrait protéique à partir de cellules ou de tissus dans une étape distincte, une sonde d’ARN radio-marquée spécifique au gène est synthétisée et purifiée. L’extrait protéique est ensuite mélangé à la sonde d’ARN marquée pour permettre la formation de complexes ARN protéiques spécifiques.

Enfin, le produit de réaction est chargé sur un gel de polyacrylamide non dénaturant et analysé par électrophorèse. La sonde d’ARN libre est séparée des complexes protéiques d’ARN en raison de sa mobilité plus rapide. Le test de décalage de mobilité électrophorétique est largement utilisé pour analyser les interactions entre les protéines de l’ARN. Nous avons pu analyser la liaison des protéines régulatrices du fer, IRP un et IRP deux, à leur élément d’ARN cible.

Mais la méthode peut également être appliquée à l’étude d’autres protéines de liaison à l’ARN démontrant que cette procédure sera effectuée par le Dr Kain Philippine, associé de recherche dans mon laboratoire, et par le Dr Nicole Wilkinson, boursière postdoctorale. Lavez les cellules deux fois avec du PBS glacé, puis ajoutez un millilitre de PBS glacé et récoltez les cellules avec un grattoir à cellules en plastique. Transférez la suspension à cellules libres dans un tube à centrifuger frais de 1,5 millilitre.

Placez le tube dans une micro-centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius. Tournez à basse vitesse pendant cinq minutes et aspirez le surnaturel. Les cellules apparaîtront sous la forme d’une pastille blanche au fond du tube.

Pour chaque 10 millions de cellules récoltées, ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse cytoplasmique glacé. Détachez la pastille cellulaire en le pipetant plusieurs fois de haut en bas, puis incubez la suspension sur de la glace pendant 20 minutes. Cela permettra de solubiliser la membrane cellulaire et de libérer tout le contenu cytosolique dans le tampon.

Pour isoler la fraction cytosolique solubilisée, faites tourner le tube à pleine vitesse pendant 10 minutes dans une centrifugeuse à quatre degrés Celsius, transférez le snat clarifié dans un nouveau tube de 1,5 millilitre sur de la glace et jetez la pastille. Ensuite, déterminez la concentration totale en protéines de l’extrait cytoplasmique résultant à l’aide du test de Bradford. Aliquote l’extrait cytoplasmique résultant dans des tubes plus petits et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé pour produire des extraits cytoplasmiques à partir de tissus frais.

Commencez le processus de récolte en déposant l’animal euthanasié sur un tampon propre au-dessus d’une planche de dissection. Ouvrez l’abdomen avec des ciseaux. Retirez le foie et la rate à l’aide de ciseaux et de pinces.

Rincez chaque mouchoir dans environ 50 millilitres de PBS glacé pour éviter la dégradation des tissus. Coupez immédiatement les tissus en petits morceaux d’environ un à deux millimètres cubes avec un scalpel sans délai. Placez les mouchoirs dans un tube cryogénique frais et enclenchez-le.

Congeler un échantillon dans de l’azote liquide. Conservez les mouchoirs congelés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Commencez à fabriquer l’extrait cytoplasmique en transférant l’échantillon de tissu préalablement congelé dans un tube de deux millilitres à fond plat contenant 250 à 500 microlitres de tampon de lyse glacée.

Placez une pointe d’homogénéisateur de tissus dans le tube et allumez l’appareil à puissance moyenne. Après 10 secondes d’homogénéisation, placez immédiatement le tube sur de la glace pendant 20 minutes pour éviter la dénaturation des protéines. Pour isoler la fraction cytosolique, faites tourner le tube à pleine vitesse pendant 10 minutes dans une centrifugeuse à quatre degrés Celsius, transférez le surnageant clarifié dans un nouveau tube de 1,5 millilitre sur de la glace et jetez la pastille.

Déterminez la concentration totale en protéines de l’extrait cytoplasmique résultant à l’aide du test de Bradford. Versez l’extrait cytoplasmique résultant dans des tubes plus petits et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. Avant de poursuivre le protocole, installez un établi anti-radiations équipé d’un compteur Geiger à écran en plexiglas.

Faites de la cytométrie, des étiquettes de moniteur sur les blouses de laboratoire et des contenants de déchets tranchants et non tranchants appropriés aux rayonnements. À partir d’un plasmide d’ADN délinéarisé contenant un élément de réponse en fer cloné. En tant que matrice, mettez en place une réaction de transcription d’ARN in vitro de 20 microlitres en mélangeant le tampon de réaction de matrice, des nucléotides partiellement radioactifs et l’ARN polymérase avec une pipette à température ambiante.

Pour initier la synthèse de l’ARN, incubez l’échantillon à 40 degrés Celsius pendant une heure. Terminez la réaction de transcription in vitro en ajoutant un microlitre d’EDTA 0,5 molaire pH 8,0. Mélangez l’EDTA en pipetant de haut en bas.

Utilisez maintenant un protocole standard de précipitation d’alcool pour purifier le produit ARN. Pour commencer, ajoutez 10 microlitres de TRNA et 82,5 microlitres d’acétate de sodium à trois molaires à pH 5,2 au mélange post-synthèse et au vortex. Pour se mélanger, l’ARNt agira comme un transporteur de précipitation et augmentera le rendement final en ARN pour précipiter l’ARN.

Ajouter 273 microlitres de 95 à 100 % d’éthanol et mélanger par vortex. Laissez la réaction de précipitation se poursuivre en laissant le tube sur la paillasse pendant 10 minutes à température ambiante pour isoler l’ARN, faites tourner le tube dans une centrifugeuse à température ambiante à pleine vitesse pendant 10 minutes. À l’aide d’une pipette, jetez soigneusement le surnageant et ne dérangez pas la pastille.

L’ARN précipité peut exister soit sous la forme d’une petite pastille blanche près du fond du tube, soit être invisible à l’œil nu. Lavez le granulé en ajoutant 100 à 500 microlitres d’éthanol à 70 %. Faites tourner l’échantillon à pleine vitesse pendant 10 minutes à température ambiante, puis décantez la caisse claire avec le couvercle.

Ouvrez et séchez la pastille d’ARN en laissant le tube ouvert sur la paillasse pendant 10 à 15 minutes. Reconstituez l’ARN solide radiomarqué en ajoutant 100 microlitres d’eau sans nucléases. Quantifier l’étendue de l’incorporation de nucléotides radioactifs en plaçant la solution d’ARN dans un compteur de sation liquide Eloqua.

La sonde d’ARN radiomarquée est placée dans des tubes plus petits et stockée à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire. Les aliquotes congelées peuvent être utilisées jusqu’à trois semaines avant de commencer le test de déplacement de mobilité électrophorétique, préparez un gel d’acrylamide standard non dénaturant à 6 % d’une taille d’au moins 16 x 16 centimètres pour faciliter de plus grands volumes d’échantillons par voie. Et pour améliorer la stabilité mécanique d’un gel de cette taille.

Utilisez des entretoises en verre et des peignes d’au moins un millimètre d’épaisseur. Pour commencer le test de déplacement de mobilité électrophorétique, décongelez le lysat cytoplasmique précédemment gelé et les sondes d’ARN radiomarquées sur les yeux pour le composant protéique de l’expérience. Diluez 25 microgrammes de l’extrait cytoplasmique avec le tampon de lyse cytoplasmique jusqu’à un volume total final de 10 microlitres.

Si nécessaire, ajoutez un microlitre de solution mère de deux me au mélange et conservez l’échantillon de protéines sur de la glace. Pour la composante ARN, diluez la sonde d’ARN radiomarquée dans de l’eau exempte de nucléases jusqu’à 200 000 points par minute par microlitre chauffez l’ARN à 95 degrés Celsius pendant une minute et refroidissez la solution à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Pour initier la réaction de liaison à l’ARN protéique, ajoutez un microlitre de sonde d’ARN radiomarqué à l’extrait de protéine pour permettre à la liaison de se produire pendant 20 minutes à température ambiante.

Pour augmenter la spécificité du test de déplacement de mobilité électrophorétique, ajoutez un microlitre de stock d’héparine à la réaction. Si les sondes d’ARN radiomarquées ont une longueur supérieure à 60 nucléotides, ajoutez un microlitre supplémentaire d’ARN T un. Laisser la réaction de liaison se poursuivre pendant encore 10 minutes à température ambiante pour améliorer encore la spécificité et permettre une meilleure séparation du complexe ARN-protéique.

Ajoutez trois microlitres de tampon de chargement et pipetez de haut en bas pour mélanger. Ensuite, chargez toute la réaction sur le gel d’acrylamide à 6 % et faites fonctionner le gel à cinq volts par centimètre pendant 60 minutes. Assurez-vous de couvrir l’appareil avec un blindage anti-rayonnement approprié.

Démontez l’appareil à gel et transférez le gel sur un grand papier filtre. Séchez le gel à l’aide d’un aspirateur de séchage de gel dans une pièce sombre. Placez la combinaison de gel et de papier filtre sur un morceau.

Film après exposition, développez et séchez le film à l’air. Le temps d’exposition optimal peut varier d’une heure à toute la nuit. On peut évaluer la capacité de liaison dépendante du fer de I RRP un et I RRP deux aux sondes IRE radioactives dans des cellules de culture tissulaire à teneur variable en fer.

Ainsi, l’activité de liaison à l’IRE est induite dans les cellules appauvries en fer préalablement traitées avec la déféroxamine K. Inversement, l’activité de liaison à l’IRE est supprimée dans les cellules chargées de fer précédemment traitées avec de l’héran dans les cellules chargées de fer. L’activité de liaison à l’IRE de I RRP un est perdue après l’assemblage d’un amas de fer-soufre tandis que I RRP deux subit une dégradation dépendante du fer.

L’amas de cellules de fer d’IRP one peut être détruit par le traitement d’extraits cellulaires avec 2 %deux me, ce qui permet de surveiller son activité de liaison dormante à l’IRE. L’activité de I RRP deux n’est pas récupérée par deux moi. Dans cette expérience suivante, les activités de liaison à l’IRE de I RRP un et IRP deux en fonction de la concentration cellulaire en fer sont évaluées dans le contexte de tissus hépatiques frais de souris sauvages de type I RRP one knockout et I RRP two knockout.

Ici, les données montrent que l’alimentation de souris avec un régime riche en fer, connu pour augmenter la charge hépatique en fer, favorise une réduction des activités de liaison à l’IRE de I RRP un et IRP deux dans les extraits de foie de souris de type sauvage. I rrp deux complexes IRE sont faussés par la présence de I RRP un. Ils sont facilement visualisés dans des extraits hépatiques de souris knock-out I RRP one.

Ici, le régime riche en fer conduit à l’inactivation complète de l’IRP deux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser les interactions entre les protéines d’ARN par le test de déplacement de mobilité électrophorétique. N’oubliez pas que la qualité de la sonde d’ARN est essentielle au succès.