Name: Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour létude des interactions ARN-protéine: LIRE / IRP Exemple (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Apprenez à analyser les interactions ARN-protéine par EMSA en utilisant des extraits cellulaires et des sondes ARN radiomarquées. Cette méthode permet de visualiser les complexes formés et d'étudier leur dynamique de liaison.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (MOP-86514).

Les procédures expérimentales sur des souris ont été approuvés par le Comité de l&#39;Université McGill (protocole 4966) de protection des animaux. 1. Préparation d&#39;extraits de protéine à partir de cellules cultivées <ol><li> Laver les cellules en culture à deux reprises avec 10 ml de phosphate refroidie à la glace une solution saline tamponnée (PBS). </li><li> Grattez cellules adhérentes soit avec une spatule en caoutchouc ou d&#39;un grattoir à cellules en plastique dans 1 ml de PBS, le transfert suspension glacée dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifugeuse à 5 min à 700 xg, à 4 ° C. Aspirer PBS. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon de lyse cytoplasmique glacée (Tableau 1) par 10 7 cellules, et la pipette de haut en bas. </li><li> Incuber sur de la glace pendant 20 min. </li><li> Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à 4 ° C. </li><li> Jeter culot. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et garder sur la glace. </li><li> Determine concentration de protéine (généralement de 1 à 10 ug / ul) en utilisant le 23 dosage de Bradford. </li><li> Aliquoter et cellulaires magasin extraits à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Préparation d&#39;extraits de protéine à partir de foie et la rate de souris <ol><li> Euthanasier une souris avec inhalation de CO 2. </li><li> Placez l&#39;animal euthanasié sur un tapis propre sur une planche de dissection. Ouvrez l&#39;abdomen avec des ciseaux. </li><li> Disséquer le foie et la rate à l&#39;aide des ciseaux et des pinces, et rincer chaque tissu dans du PBS environ 50 ml de glace-froid. </li><li> Tissus en petits morceaux immédiatement couper avec un scalpel (par exemple: environ 1-2 mm 3). </li><li> Sans délai, mettre des morceaux de tissus dans une nouvelle cryotube puis enclenchez les congeler dans l&#39;azote liquide. Magasin enfichable aliquotes congelées de tissus à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Homogénéiser une seule pièce de tissu congelé (environ 1-2 mm 3) 0,25 au 0,5 ml deglacé tampon de lyse cytoplasmique (tableau 1) avec un homogénéisateur de tissu pendant 10 sec. </li><li> Transfert homogénat à 1,5 ml microtube et le froid sur la glace pendant 20 min. </li><li> Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à 4 ° C. </li><li> Jeter culot et le transfert surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Garder sur la glace. </li><li> Déterminer la concentration en protéine (généralement de 1 à 10 ug / ul) en utilisant le 23 dosage de Bradford. </li><li> Aliquoter et cellulaires magasin extraits à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Préparation de Radiolabeled IRE-sonde <ol><li> Linéariser le plasmide contenant IRE I-12.CAT 22 par incubation à 37 ° C pendant 1 heure avec l&#39;endonucléase de restriction XbaI (1 U par pg de plasmide), qui clive en aval de la séquence IRE. Le plasmide linéarisé est utilisé comme matrice pour la transcription in vitro. </li><li> Mettre en place unn in vitro réaction de transcription dans un volume total de 20 ul. Utiliser les solutions mères indiqués dans le tableau 2 et ajouter: 1 ul de modèles de plasmide linéarisé, un tampon de transcription 4 pi; 1 pl de mélange ATP / CTP / GTP mélange, 10 ul de [α- 32 P] -UTP, 2 pl de dithiothréitol, un inhibiteur de RNase et 1 pi 1 pi d&#39;ARN polymerase de T7. Mélanger en pipetant. </li><li> Incuber à 40 ° C pendant 1 h 24. </li></ol> 4. Purification de Radiolabeled IRE-sonde <ol><li> Mettre fin à la réaction de transcription in vitro par addition de 1 pi d&#39;EDTA 0,5 M, pH 8. Mélanger en pipetant de haut en bas. </li><li> Ajouter 10 ul de 10 mg / ml d&#39;ARNt, en tant que support pour une meilleure précipitation. Mélanger en pipetant. </li><li> Ajouter 82,5 ul de 3 M d&#39;acétate d&#39;ammonium. Mélanger au vortex. </li><li> Ajouter 273 ul d&#39;éthanol. Mélanger au vortex. </li><li> Laisser reposer à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à température ambiante. Surnageant défausse. </li><li> Laver culot avec 100 pi d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à température ambiante. Surnageant défausse. </li><li> Air culot sec pendant 10 min. </li><li> Resuspendre le culot dans 100 pi de double distillée, préalablement autoclave H 2 O. </li><li> Quantifier la radioactivité dans un compteur à scintillation liquide, sonde IRE aliquote de radiomarqué et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Aliquots congelés peuvent être utilisés pour 3 semaines. </li></ol> 5. Préparation d&#39;un gel de Polyacrylamide natif à EMSA <ol><li> Assemblez le gel (16 x 16 cm) en utilisant 1,5 entretoises mm et peigne. </li><li> Pour préparer un gel de Polyacrylamide natif à 6%, utiliser les solutions mères indiqués dans le tableau 3 Mélanger 7,5 ml de 40% d&#39;acrylamide. Bisacrylamide, 5 ml de TBE 5x et 37,5 mlDouble H 2 O. distillée </li><li> Ajouter 0,5 ml de 10% persulfate fraîchement préparée d&#39;ammonium (APS) et 25 ul tétraméthyléthylènediamine (TEMED). </li><li> Verser immédiatement la solution d&#39;acrylamide au gel et laissez polymériser. Attendez environ 30 min. </li><li> Monter l&#39;appareil d&#39;électrophorèse avec le gel, remplir les réservoirs avec 0,5x TBE et se connecter avec l&#39;alimentation. </li></ol> 6. mobilité électrophorétique Maj Assay <ol><li> Diluer 25 pg d&#39;extrait de protéine à partir de cellules ou de tissus avec cytoplasmique tampon de lyse (tableau 1) dans un volume total de 10 ul en (concentrations de protéine plus faibles peuvent également être utilisés). Garder sur la glace. Si nécessaire, ajouter 1 pl de 1: 4 dilué 2-mercaptoéthanol (2-ME) pour activer IRP1 dormance (concentration finale: 2%) 25. </li><li> Diluer la sonde IRE radiomarqué en chambre double H 2 O distillée à 200 000 cpm / ul, dénaturation thermique à 95 °C pendant 1 min, et refroidir à la température ambiante pendant au moins 5 min. </li><li> Mettre en place une réaction EMSA en ajoutant 1 pl de la sonde IRE radiomarqué à l&#39;extrait de protéine. </li><li> Incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 1 pi de 50 mg / ml d&#39;héparine à la réaction (à inhiber les interactions protéiques non spécifiques avec la sonde 9) et poursuivre l&#39;incubation pendant encore 10 min. Aliquoter la solution mère de l&#39;héparine (50 mg / ml) et conserver à -80 ° C. </li><li> Lors de l&#39;utilisation de longues sondes radiomarquées (&gt; 60 nucleotides), ajouter 1 pl de RNase T1 (1 U / ul) et incuber pendant 10 min à température ambiante pour réduire la protéine non spécifique à la liaison à la sonde, et pour permettre une meilleure séparation de l&#39;ARN / protéine complexe au cours de l&#39;électrophorèse. </li><li> Ajouter 3 pi de tampon de chargement (80% de glycérol + bleu bromophénol), mélanger et la charge sur le gel de polyacrylamide non dénaturant 6%. </li><li> Exécutez le gel pendant 60 min à 130 V (5 V / cm). </li><li> Transfert du gel sur un grand papier filtre et sèche. </li><li> Exposer à un film et développer autoradiographie. Temps d&#39;exposition peut varier de 1 h (ou moins) jusqu&#39;à O / N. </li></ol>

<ol><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).</li>
<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Luscieti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutations+in+the+ferritin-L+iron-responsive+element+that+only+mildly+impair+IRP+binding+cause+hereditary+hyperferritinaemia+cataract+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 30(2013).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22Filter-binding+assay+for+analysis+of+RNA-protein+interactions%22">Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions</a>. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-mediated+degradation+of+IRP2%3A+an+unexpected+pathway+involving+a+2-oxoglutarate-dependent+oxygenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity.</a> Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).</li>
<li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5%27+untranslated+regions+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).</li>
<li>Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interaction+of+the+iron-responsive+element+binding+protein+with+iron-responsive+RNA+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements.</a> Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).</li>
<li>Mueller, S., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+iron+regulatory+protein-1+%28IRP1%29+by+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress.</a> Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).</li>
<li>Wang, J., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular iron metabolism.</a> Biochem J. 434, 365-381 (2011).</li>
<li>Hentze, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+iron-responsive+element+for+the+translational+regulation+of+human+ferritin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA.</a> Science. 238, 1570-1573 (1987).</li>
<li>Casey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-responsive+elements%3A+regulatory+RNA+sequences+that+control+mRNA+levels+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation.</a> Science. 240, 924-928 (1988).</li>
<li>Dandekar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+iron-responsive+element+in+murine+and+human+erythroid+d-aminolevulinic+acid+synthase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA.</a> EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).</li>
<li>Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulation+of+mammalian+and+drosophila+citric+acid+cycle+enzymes+via+iron-responsive+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).</li>
<li>McKie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duodenal+iron-regulated+transporter+IREG1%2C+implicated+in+the+basolateral+transfer+of+iron+to+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation.</a> Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).</li>
<li>Gunshin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+protein-coupled+metal-ion+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter.</a> Nature. 388, 482-488 (1997).</li>
<li>Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-regulatory+proteins+limit+hypoxia-inducible+factor-2alpha+expression+in+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).</li>
<li>Sanchez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulation+and+the+cell+cycle%3A+Identification+of+an+iron-responsive+element+in+the+3%27-untranslated+region+of+human+cell+division+cycle+14A+mRNA+by+a+refined+microarray-based+screening+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy.</a> J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).</li>
<li>Santos, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iron+responsive+element-like+stem-loop+regulates+alpha-hemoglobin-stabilizing+protein+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA.</a> J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-mediated+iron+trafficking+in+humans+is+regulated+by+iron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron.</a> J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).</li>
<li>Gray, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+iron+regulatory+factor+functions+as+an+iron-responsive+element-binding+protein%2C+a+translational+repressor+and+an+aconitase.+A+functional+assay+for+translational+repression+and+direct+demonstration+of+the+iron+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch.</a> Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Testa, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+iron+regulatory+element-binding+protein%28s%29+in+cell+extracts+of+activated+lymphocytes+versus+monocytes-macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages.</a> J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).</li>
<li>Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+and+the+molecular+mechanism+of+a+regulated+RNA-protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction.</a> Science. 244, 357-359 (1989).</li>
<li>Meyron-Holtz, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablations+of+iron+regulatory+proteins+1+and+2+reveal+why+iron+regulatory+protein+2+dominates+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis.</a> EMBO J. 23, 386-395 (2004).</li>
<li>Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+juvenile+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A mouse model of juvenile hemochromatosis.</a> J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).</li>
<li>Sebastiani, G., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+associated+with+systemic+or+local+iron+overload%3A+from+pathophysiology+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice.</a> Metallomics. 3, 971-986 (2011).</li>
<li>Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+conditional+alleles+of+the+murine+iron+regulatory+protein+%28IRP%29-1+and+-2+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes.</a> Genesis. 43, 181-188 (2005).</li>
<li>Gkouvatsos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-dependent+regulation+of+hepcidin+in+Hjv-%2F-+mice%3A+Evidence+that+hemojuvelin+is+dispensable+for+sensing+body+iron+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels.</a> PLoS ONE. 9, 85530(2014).</li>
<li>Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+determinants+within+iron-responsive+elements+dictate+iron+regulatory+protein+binding+and+regulatory+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy.</a> RNA. 16, 154-169 (2010).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Mapping of RNA-protein interactions.</a> Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ici, nous décrivons un protocole qui a été mis au point pour étudier les activités IRE contraignants de IRP1 et IRP2, et nous montrons des données représentatives. En utilisant différentes sondes, ce protocole peut également être ajustée pour l&#39;étude d&#39;autres protéines liant l&#39;ARN. Une étape critique est la taille de la sonde. L&#39;utilisation de sondes longues, ce qui est fréquent lorsque le site de liaison exacte est inconnue, peut entraîner des complexes ARN / protéine qui ne migrent pas différente de ce...

L&#39;EMSA a été initialement développé pour étudier l&#39;association de protéines de liaison à l&#39;ADN avec des séquences d&#39;ADN cible 1,2. Le principe est similaire pour les interactions ARN / protéine 3, qui est l&#39;objet de cet article. En bref, l&#39;ARN est chargé négativement et migrer vers l&#39;anode pendant l&#39;électrophorèse non dénaturant dans polyacrylamide (ou gels agarose). La migration dans le gel dépend de la taille de l&#39;ARN, qui est proportionnelle à la charge. La liaison d&#39;une protéine spécifique à l&#39;ARN modifie sa mobilité, et les complexes migre plus lentement par rapport à l&#39;ARN libre. Ceci est principalement dû à une augmentation de la masse moléculaire, mais aussi à des altérations de la charge et éventuellement conformation. Utilisant un ARN marqué comme sonde permet un contrôle facile de la «retard de gel&quot; ou &quot;bandshift&quot;. L&#39;utilisation de 32 sondes d&#39;ARN P marqué est très répandue et offre une sensibilité élevée. La migration des ARN / complexes de protéines et d&#39;ARN libre sont détectéspar autoradiographie. Inconvénients sont la demi-vie courte de 32 P (14,29 jours), la détérioration progressive de la qualité de la sonde due à la radiolyse, l&#39;exigence d&#39;une licence de la radioactivité et de l&#39;infrastructure pour les travaux de la radioactivité, et de biosécurité préoccupations potentielles. Par conséquent, les méthodes non isotopiques alternatives pour marquage de la sonde d&#39;ARN ont été développés, par exemple avec de la biotine ou des fluorophores, qui permettent une détection par imagerie de fluorescence ou de chimioluminescence 4,5. Les limitations de ces procédés sont le coût plus élevé et souvent une sensibilité réduite par rapport à marquage isotopique et le potentiel de marqueurs non isotopiques pour interférer avec l&#39;interaction ARN / protéine. Les non-dénaturantes des gels de Polyacrylamide sont appropriés pour la plupart des applications EMSA et sont couramment utilisés. À l&#39;occasion, des gels d&#39;agarose peuvent représenter une alternative pour l&#39;analyse de grands complexes. Le principal avantage de l&#39;EMSA est qu&#39;il combine la simplicité, la sensibilité et la robustesse 4 &lt;/ Sup&gt;. Le test peut être réalisé en quelques heures et ne nécessite pas une instrumentation sophistiquée. Les interactions ARN / protéine peut être détectée par l&#39;EMSA à des concentrations aussi faibles que 0,1 nm ou moins, et dans une large gamme de conditions de liaison (pH 4,0 à 9,5, monovalent concentration en sel de 1 à 300 mM, et la température de 0 à 60 ° C). ARN / protéines formation du complexe peut également être étudié par le test de filtre contraignant. Ce est une procédure simple, rapide et peu coûteux basé sur la conservation de complexes ARN / protéines dans un filtre de nitrocellulose, tandis qu&#39;une sonde d&#39;ARN libre passe par six. Par rapport à l&#39;EMSA, elle est limitée dans les cas où la sonde d&#39;ARN contient de multiples sites de liaison, ou l&#39;extrait brut contient plus d&#39;une des protéines liant l&#39;ARN qui se lient à la sonde sur le même site. Alors que de multiples interactions ARN / protéines seront échapper à la détection par le test de filtre contraignantes, elles peuvent être facilement visualisés par l&#39;EMSA. Dans certains cas, la visualisation est veillen possible lorsque deux complexes ARN / protéines co-émigrer (par exemple, IRP1 humaine / IRE et IRP2 / complexes IRE), en ajoutant un anticorps dirigé contre l&#39;une des protéines liant l&#39;ARN à la réaction EMSA, ce qui donne encore un retard sur le gel ( &quot;supershift&quot;) 7. L&#39;EMSA a été largement utilisé pour étudier IRP1 et IRP2, qui sont des régulateurs post-transcriptionnel du métabolisme du fer 8-10. Ils fonctionnent en se liant à IRE, structures en épingle à cheveux phylogénétiquement conservés dans les UTR de plusieurs ARNm 11. IRE ont été découverts dans les ARNm codant la ferritine 12 et récepteur de la transferrine 1 (TfR1) 13, les protéines de stockage du fer et de l&#39;absorption, respectivement. Plus tard, IRE ont été trouvés dans érythroïde spécifique aminolévulinate synthase (ALAS2) 14, aconitase mitochondriale 15, 16 ferroportine, divalent transporteur de métaux 1 (DMT1) 17, l&#39;hypoxie inducible factor 2 <em&gt; α (HIF2α) 18, et d&#39;autres ARNm 19-21. Le H- prototype et ARNm L-ferritine contiennent une IRE dans leur 5 &#39;UTR, tandis que TfR1 ARNm contient plusieurs IRE à son extrémité 3&#39; UTR. Interactions IRE / IRP spécifiquement inhiber la traduction de l&#39;ARNm de la ferritine en bloquant stériquement son association des sous-unités 43S ribosomique; en outre, ils stabilisent TfR1 ARNm contre clivage endonucléolytique. IRP1 et la part de IRP2 vaste similarité de séquence et de présenter une activité élevée de IRE-contraignant dans les cellules de fer-affamés. Dans les cellules de fer-remplie, IRP1 assemble un cluster Fe-S cubane qu&#39;il convertit en aconitase cytosolique au détriment de son activité IRE contraignant, tandis que IRP2 subit une dégradation par le protéasome. Ainsi, les interactions IRE / IRP dépendent du statut en fer cellulaire, mais sont également régies par d&#39;autres signaux, tels que H 2 O 2, l&#39;oxyde nitrique (NO) ou hypoxie. Ici, nous décrivons le protocole pour évaluer l&#39;activité IRE liaison à partir d&#39;extraits cellulaires bruts et de tissus par EMSA. Nous avons utilisé une sonde IRE marqué au 32P H-ferritine qui a été généré par transcription in vitro à partir d&#39;une matrice d&#39;ADN plasmidique (de I-12.CAT), où la séquence IRE a été initialement introduit dans l&#39;orientation sens en aval du site de l&#39;ARN polymerase T7 par clonage des oligonucleotides synthétiques annelés 22.

<table><tbody><tr><td>leupeptine</td><td>SIGMA</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Protein Assay</td><td>BIORAD</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARN polymérase</td><td>Thermoscientifique</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase</td><td>Invitrogen</td><td>15518-012</td><td></td></tr><tr><td>UTP [alpha-32P]</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td>NEG507H</tr><tr><td>Liquide à scintillation</td><td>Beckman Coulter</td><td>141349</td><td></td></tr><tr><td>héparine</td><td>SIGMA</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>Thermoscientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Nom de l’équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissu Ruptor</td><td>Qiagen</td><td>9001271</td><td></td></tr><tr><td>Compteur à scintillation</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cellule</td><td>BIORAD</td><td>165-1834</td><td></td></tr><tr><td>Peignes 20 puits</td><td>BIORAD</td><td>165-1868</td><td>1,5 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>1,5 mm Entretoises</td><td>BIORAD</td><td>165-1849</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>BIORAD</td><td>164-5070</td><td></td></tr></tbody></table>

maj de mobilité électrophorétique assay (emsa) pour l&#39;étude des interactions arn-protéine: l&#39;ire / irp exemple

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Interactions ARN / protéines sont essentielles pour voies de régulation post-transcriptionnel. Parmi les protéines liant l&#39;ARN cytosoliques les mieux caractérisés sont des protéines régulatrices du fer, et IRP1 IRP2. Ils se lient à repasser éléments sensibles (IRES) dans les régions non traduites (UTR) de plusieurs ARNm cibles, contrôlant ainsi la traduction ou la stabilité des ARNm. Interactions IRE / IRP ont été largement étudiés par l&#39;EMSA. Ici, nous décrivons le protocole EMSA pour analyser l&#39;activité IRE contraignant de IRP1 et IRP2, qui peut être généralisée à évaluer l&#39;activité d&#39;autres protéines liant l&#39;ARN ainsi. Un lysat de protéine brute contenant une protéine de liaison à l&#39;ARN, ou une préparation purifiée de cette protéine, est incubé avec un excès de 32 sonde d&#39;ARN marquée au P, ce qui permet la formation du complexe. L&#39;héparine est ajoutée à empêcher protéine non spécifique de liaison à la sonde. Ensuite, le mélange est analysé par électrophorèse non dénaturante sur un gel de Polyacrylamide. La sonde libremigre rapide, tandis que l&#39;ARN / protéines expositions complexes de mobilité retardée; par conséquent, la procédure est aussi appelé «retard de gel&quot; ou le dosage &quot;de bandshift&quot;. Après achèvement de l&#39;électrophorèse, le gel est séché et complexes ARN / protéine, ainsi que la sonde libre, sont détectés par autoradiographie. L&#39;objectif global du protocole est de détecter et de quantifier IRE / IRP et d&#39;autres interactions ARN / protéines. En outre, l&#39;EMSA peut également être utilisé pour déterminer la spécificité, l&#39;affinité de liaison, et la stoechiométrie de l&#39;interaction ARN / protéine à l&#39;étude.

Une sonde IRE radiomarqué a été préparé, comme décrit dans les sections 3 et 4 du protocole. La séquence de la sonde était 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; les nucléotides gras représentent un résidu C non apparié et la boucle, qui sont caractéristiques IRE critiques. La radioactivité spécifique de la sonde est de 4,5 x 10 9 cpm / ug d'ARN. Pour évaluer les effets des perturbations de fer sur l'activité I...

Nous présentons ici un protocole d&#39;analyser les interactions ARN / protéines. L&#39;essai de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est basé sur la migration différentielle des complexes ARN / ARN et de protéine libre pendant l&#39;électrophorèse sur gel natif. En utilisant une sonde d&#39;ARN radiomarqué, complexes / protéine ARN peuvent être visualisés par autoradiographie.

Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l&#39;étude des interactions ARN-protéine: L&#39;IRE / IRP Exemple

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser les interactions entre les protéines d’ARN et les extraits cellulaires à l’aide d’un test de déplacement de mobilité électrophorétique. Ceci est réalisé en préparant d’abord un extrait protéique à partir de cellules ou de tissus dans une étape distincte, une sonde d’ARN radio-marquée spécifique au gène est synthétisée et purifiée. L’extrait protéique est ensuite mélangé à la sonde d’ARN marquée pour permettre la formation de complexes ARN protéiques spécifiques.Enfin, le produit de réaction est chargé sur un gel de polyacrylamide non dénaturant et analysé par électrophorèse. La sonde d’ARN libre est séparée des complexes protéiques d’ARN en raison de sa mobilité plus rapide. Le test de décalage de mobilité électrophorétique est largement utilisé pour analyser les interactions entre les protéines de l’ARN. Nous avons pu analyser la liaison des protéines régulatrices du fer, IRP un et IRP deux, à leur élément d’ARN cible.Mais la méthode peut également être appliquée à l’étude d’autres protéines de liaison à l’ARN démontrant que cette procédure sera effectuée par le Dr Kain Philippine, associé de recherche dans mon laboratoire

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa-for-study-rna-protein

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

En raison de la nature transitoire de pré-ARNm, il peut être difficile d'isoler et...

Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l&#39;homme pré-ARNm

Dans cette vidéo, nous démontrons le test de décalage de mobilité électrophorétique pour détecter les interactions protéine-ADN à l’aide de sondes d’ADN marquées par fluorescence infrarouge. Lorsque la protéine se lie à la sonde d’ADN, elle forme un grand complexe qui migre lentement et apparaît comme une bande décalée sur le gel.

Essai de décalage de mobilité électrophorétique pour la détection de complexes facteur de transcription-ADN

Dans cette vidéo, nous décrivons l’évolution systématique des ligands par la méthode d’enrichissement exponentiel (SELEX) pour identifier des séquences spécifiques de liaison à l’ARN pour une protéine cible d’intérêt. La protéine est incubée avec un grand nombre de séquences d’ARN randomisées, et les séquences d’ARN de liaison aux protéines sont isolées, amplifiées par PCR et séquencées pour identifier leurs sites de liaison aux protéines.

Essai de liaison in vitro basé sur SELEX pour identifier les interactions ARN-protéines

Nous présentons un plan stratégique et un protocole pour identifier les variants génétiques non codants affectant la liaison à l’ADN du facteur de transcription (TF). Un protocole expérimental détaillé est fourni pour l’analyse du test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) et du test de précipitation d’affinité de l’ADN (DAPA) de la liaison de l’ADN TF dépendant du génotype.

Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l&#39;ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

Nous décrivons ici un protocole optimisé de électrophorétiques Assays Mobility Shift fluorescentes (FEMSA) en utilisant SOX-2 protéines purifiées avec infrarouges fluorescentes sondes d'ADN marquées par un colorant comme une étude de cas pour aborder une question biologique importante.

Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l'électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l'utilisation d'électrophorèse sur gel horizontal horizontal.

Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN

Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ce protocole décrit comment faire mutagénèse dirigée avec un 2-step et approche, qui s’applique à n’importe quel fragment d’ADN d’intérêt basée sur les 3 étapes amplification génique (PCR).

Mutagenèse dirigée pour In Vitro et In Vivo des expériences illustrées avec Interactions ARN chez Escherichia Coli

Dans cette méthode, nous quantifions l'affinité de liaison des protéines de liaison d'ARN (RBPs) aux emplacements de liaison de cognate et non-cognate utilisant un simple, vivant, test de journaliste dans les cellules bactériennes. L'exemple est basé sur la répression d'un gène journaliste.

Un jeu d'enfant pour quantifier la liaison protéine-ARN chez les bactéries

Présentés ici sont des protocoles pour les essais biochimiques in vitro utilisant des étiquettes de biotine qui peuvent être largement applicables pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques.

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As

Ici, nous présentons un protocole pour enrichir les sites endogènes de liaison d'ARN ou « empreintes » des complexes d'ARN:protéines (RNP) des cellules mammifères. Cette approche implique deux immunoprécipitations des sous-unités de RNP et est donc surnommée immunoprécipitation d'ARN en tandem (RIPiT).

Identification des empreintes de pas de l'ARN: Complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'ARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq)

Apprenez à analyser les interactions ARN-protéine par EMSA en utilisant des extraits cellulaires et des sondes ARN radiomarquées. Cette méthode permet de visualiser les complexes formés et d'étudier leur dynamique de liaison.

Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l'étude des interactions ARN-protéine: L'IRE / IRP Exemple

Explorer plus de vidéos