Name: Lisolement et la caractérisation par cytométrie en flux de lintestin grêle Lymphocytes murine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez une méthode rapide et reproductible pour isoler des lymphocytes intestinaux chez la souris et les caractériser par cytométrie en flux. Cette technique optimise l'étude de l'immunité muqueuse et du rôle du microbiote intestinal.

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Toutes les études ont été menées en cours d&#39;examen et les lignes directrices strictes selon le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) à la Harvard Medical School, qui répond aux normes vétérinaires établies par l&#39;American Association for Laboratory Animal Science (AALAS). 1. Transmission horizontale des bactéries via Co-logement (en option) <ol><li> Pour minimiser la contamination exogène (en particulier en cas d&#39;utilisation des souris gnotobiotique), pratiquer une technique aseptique lors de l&#39;assemblage des cages stériles jetables, en utilisant la nourriture et de l&#39;eau qui ont tous deux été autoclavé. </li><li> Utilisez des poinçons de l&#39;oreille ou des étiquettes pour marquer individuellement âgées de 6 semaines C57BL / 6 qui abritent différents microbiotes et loger eux dans la même cage. Étant donné que les souris sont coprophages et mangent pelotes fécales du sol de la cage, les microbes seront naturellement transmises horizontalement entre les souris. </li><li> souris Co-maison pour ≥1 semaine pour laisser le temps pour le transfert microbien et le changement immunologique avant l&#39;analyse. </li></ol&gt; 2. Préparation d&#39;une suspension cellulaire unique de la couche intraépithéliale Petit-intestinal et la lamina propria <ol><li> Préparation des solutions <ol><li> Préparer des milieux d&#39;extraction (par l&#39;intestin grêle): 30 ml de RPMI + 93 ul de 5% (p / v), dithiothréitol (DTT) + 60 ul d&#39;EDTA 0,5 M + 500 ul de sérum foetal bovin (FBS). Ajouter le TNT immédiatement avant utilisation. </li><li> Préparer les médias de digestion (par l&#39;intestin grêle): 25 ml de RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg de collagénase II + 300 pi de FBS. Ajouter la dispase et de la collagénase immédiatement avant utilisation. </li><li> Pour toutes les incubations effectuées à 37 ° C, des solutions Préchauffer à 37 ° C. </li></ol></li><li> Euthanize la souris par asphyxie au CO2 suivie d&#39; une dislocation cervicale. </li><li> Placez la face dorsale de la souris vers le bas et pulvériser l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Utilisez des ciseaux pour effectuer une laparotomie en coupant successivement la peau et le fascia puis péritonéale le long de la ligne médiane ventrale from la symphyse pubienne du processus xiphoïde, exposant ainsi la cavité péritonéale. </li><li> Utilisez des ciseaux pour séparer de l&#39;intestin grêle de l&#39;estomac par sectionnant le sphincter pylorique. Retirez délicatement le petit intestin du péritoine, taquinant le gras mésentérique. <ol><li> Pour supprimer complètement le petit intestin, faire une deuxième coupe à la jonction iléo-caecale. Placer le petit intestin isolé à froid ( par exemple., 4 ° C) , RPMI contenant 10% de FBS pour maximiser la viabilité cellulaire. </li></ol></li><li> Retirez délicatement les gros morceaux de graisse à l&#39;aide des pinces incurvées. Faites preuve de prudence pour éviter de déchirer le tissu intestinal lui-même tout en essayant d&#39;enlever la graisse. </li><li> Pour supprimer le contenu intestinal, rincer délicatement les intestins avec 15 - 20 ml de PBS froid à l&#39;aide d&#39;une aiguille d&#39;alimentation 18 G fixée à une seringue. </li><li> Utilisez des ciseaux pour exciser PPs, et les placer dans RPMI froid contenant 5% de FBS. PPs sont situés sur le côté antimésentérique du petit intestin et apparaissent comme un blanc multi-lobuléeMasse. En fonction de la souche spécifique, une souris a typiquement 8 - 12 PPs. </li><li> Couper l&#39;intestin grêle dans 3 - 4 segments de pouce. </li><li> Retirer le gras résiduel en roulant chaque segment de l&#39;intestin grêle sur une serviette en papier humidifié avec RPMI, en utilisant un scalpel terne pour taquiner la graisse loin du tissu. </li><li> Tourner le tissu à l&#39;intérieur par canulation les segments intestinaux avec des forceps incurvés et de saisir l&#39;extrémité distale du tissu. Ensuite, utilisez une paire de pinces droites pour enlever délicatement le segment de tissu de la pince incurvées (commençant à l&#39;extrémité proximale), ce qui entraîne dans le tissu étant inversé. </li><li> Placez les segments de tissu dans une tasse contenant 30 ml de milieu d&#39;extraction et une barre d&#39;agitation. Fixer le couvercle sur la coupe, et on agite à 500 tours par minute pendant 15 minutes à 37 ° C; agitation devrait être vigoureuse mais non turbulent. </li><li> Après incubation, utilisez une passoire en acier pour séparer les morceaux de tissu à partir du surnageant contenant l&#39;épithélium, qui devrait apparaître nuageux. Ce surnageant contient iLes lymphocytes ntraepithelial qui peuvent être analysées plus en profondeur, le cas échéant, en procédant à un filtrage de l&#39;échantillon dans les étapes 2,18 - 2,23. </li><li> agiter manuellement les morceaux de tissu dans RPMI pour laver milieux d&#39;extraction résiduels. </li><li> Placez le tissu sur une serviette en papier et le retourner bout sur bout à plusieurs reprises pour faciliter l&#39;élimination du mucus résiduel qui n&#39;a pas été libéré par le milieu d&#39;extraction. </li><li> Placer les fragments de tissu dans un tube de 1,5 ml avec 600 ul de milieu de digestion. </li><li> Utilisez des ciseaux pour hacher le tissu jusqu&#39;à ce que les pièces ne collent aux ciseaux et la solution semble homogène. Cette étape est essentielle pour assurer la digestion enzymatique complète du tissu. </li><li> Ajouter de l&#39;intestin grêle haché dans une tasse contenant 25 ml de milieu de digestion. Agiter à 500 tours par minute pendant 30 minutes à 37 ° C. A mi - chemin à travers la digestion (ie., À 15 min), pipeter de haut en bas avec une pipette sérologique pour aider à briser les gros morceaux de tissu. </li><li> Filtre tissu digéré (ou epithElial couche de l&#39;étape 2.12 si IELs de traitement) à travers une cellule de tamis 100 pm dans un tube de 50 ml. Rincer le filtre avec 20 ml de RPMI contenant 10% de FBS. </li><li> Centrifuger la solution filtrée à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 10% de FBS. </li><li> Filtrer les cellules remises en suspension à travers un tamis de 40 um de cellules dans un tube de 50 ml. Rinçage filtre avec 20 ml de RPMI contenant 10% de FBS. </li><li> solution Centrifugeuse filtré à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 2% de FBS. </li></ol> 3. Préparation d&#39;une suspension cellulaire unique à partir des plaques de Peyer <ol><li> Transfert excisé PPs à une tasse avec 25 ml de milieu de digestion et une barre d&#39;agitation. couvercle sécurisé, et un essorage à 500 tours par minute pendant 10 minutes à 37 ° C. </li><li> Filtre digéré PPs à travers un tamis de 40 um de cellules dans un tube de 50 ml. Si un amas remadans, les presser à travers le tamis en utilisant l&#39;extrémité plate du piston d&#39;une seringue de 1 ml. </li><li> Rinçage filtre avec 10 ml de RPMI contenant 10% de FBS. </li><li> solution Centrifugeuse filtré à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 2% de FBS. </li></ol> 4. Coloration de surface pour la cytométrie de flux <ol><li> Aliquoter volume approprié de cellules (par exemple., 200 pi de LPLs) dans une plaque à fond rond de 96 puits. </li><li> Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 90 ul de RPMI contenant 2% de FBS et une dilution 1: 100 d&#39;anticorps anti-CD16 / 32 (bloc Fc). Incuber pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 10 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 250 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant parinversant la plaque. </li><li> (Facultatif) cellules tache avec la viabilité de colorant, si désiré, en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 ul de 1% de formaline pour fixer les cellules. Incuber pendant 1 heure dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Ajouter 200 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 250 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 ul de PBS. Analyser les cellules en utilisant un cytomètre de flux. </li></ol>

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<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
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</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Nous présentons un protocole pour l&#39;isolement et le flux de caractérisation cytométrie de petits lymphocytes-intestinaux, y compris le LPLs, IELs, et les lymphocytes dans le PPs. Pour ceux intéressés à évaluer comment les changements dans le microbiote affectent le système immunitaire de l&#39;intestin grêle, nous détaillons les étapes simples impliqués dans la transmission horizontale des organismes entre les souris hébergeant différentes microbiotes. Bien que ce protocole se concentre sur l&#39;intestin grêle, la ...

La tâche principale de l&#39;intestin grêle est souvent considérée comme la digestion et l&#39; absorption des nutriments 1. Bien que cette fonction métabolique est évidemment essentiel, de l&#39;intestin grêle a un rôle tout aussi important dans la protection de l&#39;hôte à partir du barrage continu des antigènes environnementaux trouvés dans la lumière 2. Le tractus intestinal sépare le monde extérieur (par exemple., Antigènes luminal) à partir de l&#39;environnement interne de l&#39;hôte avec une couche épithéliale qui est seulement une couche cellulaire unique épaisse. En tant que tel, le système immunitaire de l&#39;intestin grêle a la formidable tâche d&#39;équilibrer son seuil pour la réactivité, ce qui permet des antigènes étrangers provenant de l&#39;alimentation et commensaux microbes d&#39;entrer dans la muqueuse avec un minimum, le cas échéant, la réponse immunitaire lors du montage d&#39;une réponse robuste contre les agents pathogènes envahisseurs et d&#39;autres antigènes &quot;nuisibles&quot;. Réponses immunitaires excessives ou inappropriées à ces antigènes peuvent conduire à une maladie pathologique (par exemple., Inflammamaladie tory de l&#39; intestin, diabète de type I, la sclérose en plaques) et doit être évitée 3-6. Dans l&#39; ensemble, le tractus gastro - intestinal est considéré comme représentant le plus grand organe immunitaire dans le corps, contenant plus de 70% de toutes les cellules sécrétrices d&#39;anticorps 7. Le système immunitaire de l&#39; intestin grêle est composé de 3 compartiments principaux - la lamina propria (LP), la couche intraépithéliale, et les plaques de Peyer (PP) - que chacun contient un groupe distinctif de lymphocytes 2. Les lymphocytes LP (LPLs) sont principalement des cellules avec des cellules ~ 20% B TCRap + T; lymphocytes intraépithéliaux (LIE) contiennent très peu de cellules B avec plus de cellules TCRγδ + T que les cellules TCRap + T; et PPs, qui sont les organes lymphoïdes secondaires embarqués dans le petit-intestinal mur, contiennent ~ 80% de cellules B. Bien que chacune de ces régions anatomiques a des fonctions légèrement distinctes et les bases ontologiques, ils fonctionner dans ahla mode armonized pour protéger l&#39;hôte contre les insultes pathogènes. En outre, il est de plus en plus l&#39; appréciation que le microbiote est un facteur déterminant pour le développement du système immunitaire intestinal, avec l&#39; augmentation de la reconnaissance de la relation entre les microbes spécifiques apparenté et l&#39;ontogenèse des particuliers lignées cellulaires 8,9. En outre, étant donné que l&#39; éducation du système immunitaire intestinal affecte les réponses immunitaires dans des sites anatomiquement éloignés (par exemple., L&#39; arthrite, la sclérose en plaques, la pneumonie), il est devenu clair que le développement du système immunitaire intestinal est pertinent pour plus de processus de la maladie que précédemment reconnu 10 -12. En tant que tel, l&#39;intérêt pour l&#39;évaluation quantitative du système immunitaire intestinal a étendu au-delà des interactions hôte-pathogène pour inclure désormais les interactions hôte-commensal et la pathogenèse de nombreuses maladies systémiques ainsi. Compte tenu de la variabilité des méthodes actuelles dans leisolement des lymphocytes intestinaux, un procédé qui est optimisé pour le rendement, de la viabilité et l&#39;uniformité tout en équilibrant le temps nécessaire est de plus en plus critique. Les protocoles qui impliquent des gradients de Percoll sont le temps et de main - d&#39;œuvre et potentiellement plus sujettes à l&#39; erreur humaine, conduisant à un rendement variable et la viabilité 13. Ici, nous fournissons un protocole optimisé pour l&#39;isolement et la caractérisation des lymphocytes de tous les compartiments 3 immunitaire de l&#39;intestin grêle. De plus, l&#39;intérêt croissant porté par des altérations induites par les microbes dans le système immunitaire des muqueuses, on comprend les étapes qui peuvent être utilisés pour permettre la transmission horizontale des micro-organismes entre la souris pour évaluer la façon dont ces modifications affectent quantitativement le système immunitaire intestinal.

<table><tbody><tr><td>Gants stériles</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>cage stérile pour souris</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>contient un couvercle, un fond de cage et une litière alpha-dri</td></tr><tr><td>Distributeur en métal</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille d’eau</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Porte-cartes</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur autoclavable chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>la concentration dans le protocole est basée sur un niveau d’activité de 1,878 U/mg</td></tr><tr><td>de collagénase, type II&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>la concentration dans le protocole est basée sur un niveau d’activité de 245 U/mg</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d’alimentation (18 G, longueur 2")</td> <td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 ml</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable (15 lames)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Pince courbe</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Pince droite</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Gobelets polyvalents, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Barre d’agitation</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’agitation multi-positions, 9 positions</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Conique en acier inoxydable passoire, 3 pouces&nbsp ;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Tube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; m Crépine à cellule</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; m Crépine à cellules</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube conique</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringue</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96 puits Plaque à fond rond</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/32 (bloc Fc)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>(En option) Colorant de viabilité fixable eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10 % Formalin, tampon neutre</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle lymphocytes murine

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Les intestins - qui contiennent le plus grand nombre de cellules immunitaires de tout organe dans le corps - sont constamment exposés à des antigènes étrangers, à la fois microbienne et alimentaire. Compte tenu de la compréhension croissante que ces antigènes luminal contribuent à façonner la réponse immunitaire et que l&#39;éducation des cellules immunitaires dans l&#39;intestin est critique pour un certain nombre de maladies systémiques, on a accru l&#39;intérêt pour la caractérisation du système immunitaire intestinal. Cependant, de nombreux protocoles publiés sont laborieux et prend du temps. Nous présentons ici un protocole simplifié pour l&#39;isolement de lymphocytes à partir propria de l&#39;intestin grêle lamina couche intraépithéliales et les plaques de Peyer qui est rapide, reproductible et ne nécessite pas de gradients de Percoll laborieux. Bien que le protocole met l&#39;accent sur l&#39;intestin grêle, il est également adapté à l&#39;analyse du côlon. De plus, nous mettons en évidence certains aspects qui peuvent avoir besoin d&#39;optimisation supplémentaires en fonction de la ques scientifique spécifiquetion. Cette approche se traduit par l&#39;isolement d&#39;un grand nombre de lymphocytes viables qui peuvent ensuite être utilisés pour l&#39;analyse par cytométrie de flux ou d&#39;autres moyens de caractérisation.

L&#39; analyse par cytométrie de suspensions de cellules isolées de l&#39; intestin grêle lymphocytes devrait donner une population discrète de cellules qui ont des caractéristiques similaires avant et dispersion latérale comme splénocytes (Figures 1A et 1B). Les lymphocytes peuvent commencer à mourir si le tissu ne soit pas maintenu à 4 ° C au cours des premières étapes de l&#39;isolement, ce qui entraîne dans la population de lymphocytes ayant une dispersion inférieure...

La caractérisation quantitative des lymphocytes intestinaux suscite un intérêt croissant en raison de la reconnaissance croissante du fait que ces cellules jouent un rôle essentiel dans diverses maladies intestinales et systémiques. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler des populations de cellules uniques de différents compartiments de l’intestin grêle pour une caractérisation ultérieure de la cytométrie en flux.

L&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle Lymphocytes murine

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des populations de cellules individuelles provenant de différents compartiments de l'intestin grêle, qui peuvent ensuite être utilisées pour une analyse par cytométrie en flux ou par tout autre moyen de caractérisation. Cette méthode permet de répondre à des questions clés en immunologie muqueuse, comme la manière dont la microbiote influence le développement du système immunitaire intestinal. Les principaux avantages de cette technique sont sa rapidité, sa reproductibilité et le fait qu'elle ne nécessite pas de gradients de Percoll laborieux.Pour commencer cette procédure, placez la souris en position dorsale et vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 pour cent. Effectuez une laparotomie en incisant successivement la peau puis la fascia péritonéale le long de la ligne médiane ventrale, de la symphyse pubienne jusqu’au processus xiphoïde, exposant ainsi la cavité péritonéale. Ensuite, séparez l’intestin grêle de l’estomac en sectionant le sphincter pylorique. Retirez délicatement l’intestin grêle du péritoine et détachez la graisse mésentérique.Pour retirer complètement l'intestin grêle, effectuez une deuxième incision au niveau de la jonction iléocæcale. Placez l'intestin grêle isolé dans du milieu RPMI à quatre degrés Celsius contenant 10 pour cent de SBF afin d'optimiser la viabilité cellulaire. Retirez délicatement les gros morceaux de graisse à l'aide de pinces courbes et faites attention à ne pas déchirer le tissu intestinal lui-même pendant le processus.Pour éliminer le contenu intestinal, canuler l'extrémité proximale de l'intestin grêle à l'aide d'une aiguille d'alimentation de calibre 18 fixée à une seringue et rincer doucement l'intestin avec 15 à 20 millilitres de PBS froid. Utiliser des ciseaux pour exciser les plaques de Peyer, situées du côté antimesentérique de l'intestin grêle et apparaissant comme une masse blanche multilobulée. Ensuite, les placer dans un milieu RPMI froid contenant 5 % de FBS.Ensuite, découpez l'intestin grêle en segments de huit à dix centimètres, retirez la graisse résiduelle en roulant chaque segment intestinal sur une serviette en papier humidifiée avec du RPMI, puis utilisez un scalpel émoussé pour détacher délicatement la graisse du tissu. Il est essentiel de veiller scrupuleusement à l'élimination complète de la graisse mésentérique afin de garantir la viabilité des lymphocytes, car même de minuscules fragments de graisse peuvent provoquer la mort cellulaire. Par la suite, retournez le tissu à l'envers en canulant les segments intestinaux avec une pince courbe, en saisissant l'extrémité distale du tissu, puis utilisez une pince droite pour retirer délicatement le segment tissulaire de l'extrémité proximale, ce qui entraîne l'inversion du tissu.Placer les segments de tissu dans un récipient contenant 30 millilitres de milieu d'extraction et un barreau d'agitation. Fermer hermétiquement le couvercle et agiter pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. L'agitation doit être vigoureuse, mais sans turbulence.Après 15 minutes, utilisez un tamis en acier pour séparer les morceaux de tissu du surnageant contenant l'épithélium, qui doit apparaître trouble. Agitez manuellement les morceaux de tissu dans du milieu RPMI afin d'éliminer le milieu d'extraction résiduel. Ensuite, placez le tissu sur une serviette en papier sèche et retournez-le plusieurs fois pour faciliter l'élimination du mucus résiduel qui n'a pas été libéré par le milieu d'extraction.Ensuite, placer les fragments de tissu dans un tube de 1,5 mL contenant 600 microlitres de milieu de digestion. Hacher finement le tissu jusqu'à ce que les morceaux n'adhèrent plus aux ciseaux et que la solution apparaisse homogène. Cette étape est essentielle pour assurer une digestion enzymatique complète du tissu.Hacher le tissu jusqu'à ce que les morceaux n'adhèrent plus aux ciseaux et que la solution apparaisse homogène est essentiel pour garantir le rendement cellulaire ainsi que la reproductibilité des résultats. Ajouter l'intestin grêle haché dans un récipient contenant 25 millilitres de milieu de digestion et agiter pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À mi-parcours de la digestion, aspirer et rejeter le mélange à l'aide d'une pipette sérologique afin de faciliter la dégradation des gros fragments de tissu.Ensuite, filtrez le tissu digestif à l’aide d’un tamis cellulaire de 100 micromètres dans un tube de 15 millilitres. Rincez le tamis avec 20 millilitres de milieu RPMI contenant 10 pour cent de FBS. Par la suite, centrifugez la solution filtrée pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Versez soigneusement le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de milieu RPMI contenant 10 pour cent de SBF. Filtrez les cellules resuspendues à l’aide d’un tamis cellulaire de 40 micromètres dans un tube de 15 millilitres. Rincez le tamis avec 20 millilitres de RPMI contenant 10 pour cent de SBF.Ensuite, centrifuger la solution filtrée pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Verser soigneusement le surnageant et resuspendre le culot dans un millilitre de milieu RPMI contenant 2 % de FBS. Dans cette procédure, transférer les plaques de Peyer excisées dans un bécher contenant 25 millilitres de milieu de digestion et une barrette d'agitation.Fermez hermétiquement le couvercle et centrifugez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, filtrez les plaques de Peyer digérées à travers un tamis cellulaire de 40 micromètres dans un tube de 15 millilitres. S'il reste des agrégats, poussez-les à travers le tamis en utilisant l'extrémité plate du piston d'une seringue de un millilitre.Ensuite, rincez le filtre avec 10 millilitres de milieu RPMI contenant 10 pour cent de FBS. Faites centrifuger la solution filtrée pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Puis, décantez soigneusement le surnageant et remettez en suspension le culot dans un millilitre de milieu RPMI contenant 2 pour cent de FBS.L'analyse par cytométrie en flux de suspensions uniques de cellules de lymphocytes de l'intestin grêle devrait produire une population distincte de cellules présentant des caractéristiques de diffusion antérieure et latérale similaires à celles des splénocytes. Les lymphocytes peuvent commencer à mourir si le tissu n'est pas maintenu à quatre degrés Celsius durant les étapes initiales de l'isolement, ce qui entraîne une diminution de la diffusion antérieure de la population lymphocytaire et rend plus difficile sa séparation des autres cellules épithéliales et mortes. De plus, si la graisse mésentérique n'est pas entièrement retirée du tissu intestinal grêle, il y aura pratiquement une perte totale des lymphocytes.On obtient généralement une viabilité de 80 pour cent pour les lymphocytes du lamina propria de l'intestin grêle. Une fois la technique maîtrisée, on peut traiter quatre souris et obtenir des suspensions de cellules uniques prêtes pour la coloration en moins de quatre heures. Lors de cette procédure, il est important de retirer complètement toute la graisse mésentérique et de bien hacher le tissu afin d'assurer une digestion complète.Après cette procédure, les suspensions monocellulaires peuvent être utilisées à d'autres fins que la cytométrie en flux, telles que des expériences in vitro, l'analyse de l'expression génique ou le transfert adoptif afin de caractériser davantage la fonction de ces cellules. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs en immunologie muqueuse d'explorer l'ontogenèse et les implications fonctionnelles du système immunitaire intestinal chez la souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de comprendre comment isoler des suspensions monocellulaires à partir de différents compartiments de l'intestin grêle, en éliminant la graisse mésentérique, en extrayant la couche épithéliale et en digérant le tissu au moyen de collagénase.

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Immunology and Infection

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