L'isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l'intestin grêle Lymphocytes murine

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des populations de cellules uniques de différents compartiments de l’intestin grêle qui peuvent ensuite être utilisées pour l’analyse cytométrique en flux ou un autre moyen de caractérisation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en immunologie des muqueuses, telles que l’impact du microbiote sur le développement du système immunitaire intestinal. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, reproductible et ne nécessite pas de gradients de percoll laborieux.

Pour commencer cette procédure, placez la souris côté dorsal vers le bas et vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %, effectuez une laparotomie en coupant séquentiellement la peau, puis le fascia péritonéal le long de la ligne médiane ventrale de la symphyse pubienne au processus xiphoïde, exposant ainsi la cavité péritonéale. Ensuite, séparez l’intestin grêle de l’estomac en transectant le sphincter pylorique. Retirez doucement l’intestin grêle du péritoine et évacuez la graisse mésentérique.

Pour enlever complètement l’intestin grêle, faites une deuxième incision à la jonction iléo-caecale. Placez l’intestin grêle isolé dans un milieu RPMI de quatre degrés Celsius contenant 10 % de FBS pour maximiser la viabilité cellulaire. Retirez délicatement les gros morceaux de graisse à l’aide d’une pince incurvée et faites attention à ne pas déchirer le tissu intestinal lui-même pendant le processus.

Pour éliminer le contenu intestinal, canulez l’extrémité proximale de l’intestin grêle avec une aiguille d’alimentation de calibre 18 fixée à une seringue et rincez doucement l’intestin avec 15 à 20 millilitres de PBS froid. Utilisez des ciseaux pour exciser les plaques de Peyer qui sont situées du côté antitimerenérique de l’intestin grêle et apparaissent comme une masse blanche multilobée. Ensuite, placez-les dans un milieu RPMI froid contenant cinq pour cent de FBS.

Ensuite, coupez l’intestin grêle en segments de trois à quatre pouces, retirez la graisse résiduelle en roulant chaque segment de l’intestin grêle sur une serviette en papier imbibée de RPMI et utilisez un scalpel émoussé pour éloigner la graisse du tissu. Il est essentiel de porter une attention stricte à l’élimination complète de la graisse mésentérique pour assurer la viabilité des lymphocytes, car même de minuscules morceaux de graisse peuvent provoquer la mort des cellules. Après cela, retournez le tissu en canulant les segments intestinaux avec des pinces incurvées et en saisissant l’extrémité distale du tissu, puis utilisez une paire de pinces droites pour retirer doucement le segment de tissu de l’extrémité proximale, ce qui entraîne l’inversion du tissu.

Placez les segments de tissu dans une tasse contenant 30 millilitres de milieu d’extraction et une barre d’agitation. Fixez le couvercle sur le capuchon et remuez pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. L’agitation doit être vigoureuse, mais pas turbulente.

Après 15 minutes, utilisez une passoire en acier pour séparer les morceaux de tissu de l’épithélium contenant du surnageant qui devrait apparaître trouble. Agitez manuellement les morceaux de tissu dans un milieu RPMI pour éliminer le milieu d’extraction résiduel. Ensuite, placez le mouchoir sur une serviette en papier sèche et retournez-le plusieurs fois pour faciliter l’élimination du mucus résiduel qui n’a pas été libéré par le milieu d’extraction.

Par la suite, placez les fragments de tissu dans un tube d’un point de cinq millilitres avec 600 microlitres de milieu de digestion. Émincez le tissu jusqu’à ce que les morceaux ne collent plus aux ciseaux et que la solution apparaisse homogène. Cette étape est essentielle pour assurer une digestion enzymatique complète des tissus.

Hacher le tissu jusqu’à ce que les morceaux ne collent plus aux ciseaux et que la solution semble homogène est essentiel pour garantir le rendement cellulaire ainsi que la reproductibilité des résultats. Ajoutez l’intestin grêle haché dans une tasse contenant 25 millilitres de fluide de digestion et remuez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. À mi-chemin de la digestion, faites-le monter et descendre avec une pipette sérologique pour aider à décomposer les gros morceaux de tissu.

Ensuite, filtrez le tissu digestif à travers une crépine de 100 micromètres dans un tube de 15 millilitres. Rincez la passoire avec 20 millilitres de milieu RPMI contenant 10 % de FBS. Ensuite, centrifugez la solution filtrée pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Décanter soigneusement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un millilitre de milieu RPMI contenant 10 % de FBS. Filtrez les cellules remises en suspension à travers une crépine de 40 micromètres dans un tube de 15 millilitres. Rincez la passoire avec 20 millilitres de RPMI contenant 10 pour cent de FBS.

Ensuite, centrifugez la solution filtrée pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Décantez soigneusement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu RPMI, contenant deux pour cent de FBS. Dans cette procédure, transférez les patchs de Peyer excisés dans une tasse avec 25 millilitres de milieu de digestion et un agitateur.

Fixez le couvercle et tournez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, filtrez les patchs de Peyer digérés à travers une crépine de 40 micromètres dans un tube de 15 millilitres. S’il reste des grumeaux, passez-les dans la passoire à l’aide de l’extrémité plate du piston d’une seringue d’un millilitre.

Ensuite, rincez la passoire avec 10 millilitres de milieu RPMI, contenant 10 pour cent de FBS. Centrifugez la solution filtrée pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, décantez soigneusement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu RPMI contenant deux pour cent de FBS.

L’analyse par cytométrie en flux de suspensions de cellules uniques de lymphocytes de l’intestin grêle devrait permettre d’obtenir une population discrète de cellules présentant des caractéristiques de diffusion vers l’avant et latérale similaires à celles des splénocytes. Les lymphocytes peuvent commencer à mourir si le tissu n’est pas maintenu à quatre degrés Celsius pendant les premières étapes de l’isolement, ce qui fait que la population lymphocytaire a une diffusion vers l’avant plus faible et est plus difficile à séparer des autres cellules épithéliales et mortes. De plus, si la graisse mésentérique n’est pas complètement éliminée du tissu de l’intestin grêle, il y aura une perte pratiquement complète de lymphocytes.

En règle générale, une viabilité de 80 % pour les lymphocytes LP de l’intestin grêle est obtenue. Une fois maîtrisé, on peut traiter quatre souris et avoir des suspensions unicellulaires prêtes à être colorées en moins de quatre heures. Au cours de cette procédure, il est important d’éliminer complètement toute la graisse mésentérique et de bien hacher les tissus pour assurer une digestion complète.

À la suite de cette procédure, les suspensions de cellules uniques peuvent être utilisées à des fins autres que la cytométrie en flux, telles que des expériences in vitro, l’analyse de l’expression génique ou le transfert adoptif pour caractériser davantage la fonction de ces cellules. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en immunologie des muqueuses pour explorer l’ontogenèse et les implications fonctionnelles du système immunitaire intestinal chez la souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les suspensions de cellules uniques de différents compartiments de l’intestin grêle, en nettoyant la graisse mésentérique, en extrayant la couche épithéliale et en digérant le tissu avec de la collagénase.