Name: Lisolement et la caractérisation par cytométrie en flux de lintestin grêle Lymphocytes murine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez une méthode rapide et reproductible pour isoler des lymphocytes intestinaux chez la souris et les caractériser par cytométrie en flux. Cette technique optimise l'étude de l'immunité muqueuse et du rôle du microbiote intestinal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NKS est soutenu par le prix NIH K08 AI108690.

Toutes les études ont été menées en cours d&#39;examen et les lignes directrices strictes selon le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) à la Harvard Medical School, qui répond aux normes vétérinaires établies par l&#39;American Association for Laboratory Animal Science (AALAS). 1. Transmission horizontale des bactéries via Co-logement (en option) <ol><li> Pour minimiser la contamination exogène (en particulier en cas d&#39;utilisation des souris gnotobiotique), pratiquer une technique aseptique lors de l&#39;assemblage des cages stériles jetables, en utilisant la nourriture et de l&#39;eau qui ont tous deux été autoclavé. </li><li> Utilisez des poinçons de l&#39;oreille ou des étiquettes pour marquer individuellement âgées de 6 semaines C57BL / 6 qui abritent différents microbiotes et loger eux dans la même cage. Étant donné que les souris sont coprophages et mangent pelotes fécales du sol de la cage, les microbes seront naturellement transmises horizontalement entre les souris. </li><li> souris Co-maison pour ≥1 semaine pour laisser le temps pour le transfert microbien et le changement immunologique avant l&#39;analyse. </li></ol&gt; 2. Préparation d&#39;une suspension cellulaire unique de la couche intraépithéliale Petit-intestinal et la lamina propria <ol><li> Préparation des solutions <ol><li> Préparer des milieux d&#39;extraction (par l&#39;intestin grêle): 30 ml de RPMI + 93 ul de 5% (p / v), dithiothréitol (DTT) + 60 ul d&#39;EDTA 0,5 M + 500 ul de sérum foetal bovin (FBS). Ajouter le TNT immédiatement avant utilisation. </li><li> Préparer les médias de digestion (par l&#39;intestin grêle): 25 ml de RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg de collagénase II + 300 pi de FBS. Ajouter la dispase et de la collagénase immédiatement avant utilisation. </li><li> Pour toutes les incubations effectuées à 37 ° C, des solutions Préchauffer à 37 ° C. </li></ol></li><li> Euthanize la souris par asphyxie au CO2 suivie d&#39; une dislocation cervicale. </li><li> Placez la face dorsale de la souris vers le bas et pulvériser l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Utilisez des ciseaux pour effectuer une laparotomie en coupant successivement la peau et le fascia puis péritonéale le long de la ligne médiane ventrale from la symphyse pubienne du processus xiphoïde, exposant ainsi la cavité péritonéale. </li><li> Utilisez des ciseaux pour séparer de l&#39;intestin grêle de l&#39;estomac par sectionnant le sphincter pylorique. Retirez délicatement le petit intestin du péritoine, taquinant le gras mésentérique. <ol><li> Pour supprimer complètement le petit intestin, faire une deuxième coupe à la jonction iléo-caecale. Placer le petit intestin isolé à froid ( par exemple., 4 ° C) , RPMI contenant 10% de FBS pour maximiser la viabilité cellulaire. </li></ol></li><li> Retirez délicatement les gros morceaux de graisse à l&#39;aide des pinces incurvées. Faites preuve de prudence pour éviter de déchirer le tissu intestinal lui-même tout en essayant d&#39;enlever la graisse. </li><li> Pour supprimer le contenu intestinal, rincer délicatement les intestins avec 15 - 20 ml de PBS froid à l&#39;aide d&#39;une aiguille d&#39;alimentation 18 G fixée à une seringue. </li><li> Utilisez des ciseaux pour exciser PPs, et les placer dans RPMI froid contenant 5% de FBS. PPs sont situés sur le côté antimésentérique du petit intestin et apparaissent comme un blanc multi-lobuléeMasse. En fonction de la souche spécifique, une souris a typiquement 8 - 12 PPs. </li><li> Couper l&#39;intestin grêle dans 3 - 4 segments de pouce. </li><li> Retirer le gras résiduel en roulant chaque segment de l&#39;intestin grêle sur une serviette en papier humidifié avec RPMI, en utilisant un scalpel terne pour taquiner la graisse loin du tissu. </li><li> Tourner le tissu à l&#39;intérieur par canulation les segments intestinaux avec des forceps incurvés et de saisir l&#39;extrémité distale du tissu. Ensuite, utilisez une paire de pinces droites pour enlever délicatement le segment de tissu de la pince incurvées (commençant à l&#39;extrémité proximale), ce qui entraîne dans le tissu étant inversé. </li><li> Placez les segments de tissu dans une tasse contenant 30 ml de milieu d&#39;extraction et une barre d&#39;agitation. Fixer le couvercle sur la coupe, et on agite à 500 tours par minute pendant 15 minutes à 37 ° C; agitation devrait être vigoureuse mais non turbulent. </li><li> Après incubation, utilisez une passoire en acier pour séparer les morceaux de tissu à partir du surnageant contenant l&#39;épithélium, qui devrait apparaître nuageux. Ce surnageant contient iLes lymphocytes ntraepithelial qui peuvent être analysées plus en profondeur, le cas échéant, en procédant à un filtrage de l&#39;échantillon dans les étapes 2,18 - 2,23. </li><li> agiter manuellement les morceaux de tissu dans RPMI pour laver milieux d&#39;extraction résiduels. </li><li> Placez le tissu sur une serviette en papier et le retourner bout sur bout à plusieurs reprises pour faciliter l&#39;élimination du mucus résiduel qui n&#39;a pas été libéré par le milieu d&#39;extraction. </li><li> Placer les fragments de tissu dans un tube de 1,5 ml avec 600 ul de milieu de digestion. </li><li> Utilisez des ciseaux pour hacher le tissu jusqu&#39;à ce que les pièces ne collent aux ciseaux et la solution semble homogène. Cette étape est essentielle pour assurer la digestion enzymatique complète du tissu. </li><li> Ajouter de l&#39;intestin grêle haché dans une tasse contenant 25 ml de milieu de digestion. Agiter à 500 tours par minute pendant 30 minutes à 37 ° C. A mi - chemin à travers la digestion (ie., À 15 min), pipeter de haut en bas avec une pipette sérologique pour aider à briser les gros morceaux de tissu. </li><li> Filtre tissu digéré (ou epithElial couche de l&#39;étape 2.12 si IELs de traitement) à travers une cellule de tamis 100 pm dans un tube de 50 ml. Rincer le filtre avec 20 ml de RPMI contenant 10% de FBS. </li><li> Centrifuger la solution filtrée à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 10% de FBS. </li><li> Filtrer les cellules remises en suspension à travers un tamis de 40 um de cellules dans un tube de 50 ml. Rinçage filtre avec 20 ml de RPMI contenant 10% de FBS. </li><li> solution Centrifugeuse filtré à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 2% de FBS. </li></ol> 3. Préparation d&#39;une suspension cellulaire unique à partir des plaques de Peyer <ol><li> Transfert excisé PPs à une tasse avec 25 ml de milieu de digestion et une barre d&#39;agitation. couvercle sécurisé, et un essorage à 500 tours par minute pendant 10 minutes à 37 ° C. </li><li> Filtre digéré PPs à travers un tamis de 40 um de cellules dans un tube de 50 ml. Si un amas remadans, les presser à travers le tamis en utilisant l&#39;extrémité plate du piston d&#39;une seringue de 1 ml. </li><li> Rinçage filtre avec 10 ml de RPMI contenant 10% de FBS. </li><li> solution Centrifugeuse filtré à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 2% de FBS. </li></ol> 4. Coloration de surface pour la cytométrie de flux <ol><li> Aliquoter volume approprié de cellules (par exemple., 200 pi de LPLs) dans une plaque à fond rond de 96 puits. </li><li> Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 90 ul de RPMI contenant 2% de FBS et une dilution 1: 100 d&#39;anticorps anti-CD16 / 32 (bloc Fc). Incuber pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 10 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 250 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant parinversant la plaque. </li><li> (Facultatif) cellules tache avec la viabilité de colorant, si désiré, en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 ul de 1% de formaline pour fixer les cellules. Incuber pendant 1 heure dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Ajouter 200 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 250 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 ul de PBS. Analyser les cellules en utilisant un cytomètre de flux. </li></ol>

<ol><li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li>
<li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li>
<li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+%28normal+microflora%29%2C+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides%3A+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li>
<li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li>
<li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Nous présentons un protocole pour l&#39;isolement et le flux de caractérisation cytométrie de petits lymphocytes-intestinaux, y compris le LPLs, IELs, et les lymphocytes dans le PPs. Pour ceux intéressés à évaluer comment les changements dans le microbiote affectent le système immunitaire de l&#39;intestin grêle, nous détaillons les étapes simples impliqués dans la transmission horizontale des organismes entre les souris hébergeant différentes microbiotes. Bien que ce protocole se concentre sur l&#39;intestin grêle, la ...

La tâche principale de l&#39;intestin grêle est souvent considérée comme la digestion et l&#39; absorption des nutriments 1. Bien que cette fonction métabolique est évidemment essentiel, de l&#39;intestin grêle a un rôle tout aussi important dans la protection de l&#39;hôte à partir du barrage continu des antigènes environnementaux trouvés dans la lumière 2. Le tractus intestinal sépare le monde extérieur (par exemple., Antigènes luminal) à partir de l&#39;environnement interne de l&#39;hôte avec une couche épithéliale qui est seulement une couche cellulaire unique épaisse. En tant que tel, le système immunitaire de l&#39;intestin grêle a la formidable tâche d&#39;équilibrer son seuil pour la réactivité, ce qui permet des antigènes étrangers provenant de l&#39;alimentation et commensaux microbes d&#39;entrer dans la muqueuse avec un minimum, le cas échéant, la réponse immunitaire lors du montage d&#39;une réponse robuste contre les agents pathogènes envahisseurs et d&#39;autres antigènes &quot;nuisibles&quot;. Réponses immunitaires excessives ou inappropriées à ces antigènes peuvent conduire à une maladie pathologique (par exemple., Inflammamaladie tory de l&#39; intestin, diabète de type I, la sclérose en plaques) et doit être évitée 3-6. Dans l&#39; ensemble, le tractus gastro - intestinal est considéré comme représentant le plus grand organe immunitaire dans le corps, contenant plus de 70% de toutes les cellules sécrétrices d&#39;anticorps 7. Le système immunitaire de l&#39; intestin grêle est composé de 3 compartiments principaux - la lamina propria (LP), la couche intraépithéliale, et les plaques de Peyer (PP) - que chacun contient un groupe distinctif de lymphocytes 2. Les lymphocytes LP (LPLs) sont principalement des cellules avec des cellules ~ 20% B TCRap + T; lymphocytes intraépithéliaux (LIE) contiennent très peu de cellules B avec plus de cellules TCRγδ + T que les cellules TCRap + T; et PPs, qui sont les organes lymphoïdes secondaires embarqués dans le petit-intestinal mur, contiennent ~ 80% de cellules B. Bien que chacune de ces régions anatomiques a des fonctions légèrement distinctes et les bases ontologiques, ils fonctionner dans ahla mode armonized pour protéger l&#39;hôte contre les insultes pathogènes. En outre, il est de plus en plus l&#39; appréciation que le microbiote est un facteur déterminant pour le développement du système immunitaire intestinal, avec l&#39; augmentation de la reconnaissance de la relation entre les microbes spécifiques apparenté et l&#39;ontogenèse des particuliers lignées cellulaires 8,9. En outre, étant donné que l&#39; éducation du système immunitaire intestinal affecte les réponses immunitaires dans des sites anatomiquement éloignés (par exemple., L&#39; arthrite, la sclérose en plaques, la pneumonie), il est devenu clair que le développement du système immunitaire intestinal est pertinent pour plus de processus de la maladie que précédemment reconnu 10 -12. En tant que tel, l&#39;intérêt pour l&#39;évaluation quantitative du système immunitaire intestinal a étendu au-delà des interactions hôte-pathogène pour inclure désormais les interactions hôte-commensal et la pathogenèse de nombreuses maladies systémiques ainsi. Compte tenu de la variabilité des méthodes actuelles dans leisolement des lymphocytes intestinaux, un procédé qui est optimisé pour le rendement, de la viabilité et l&#39;uniformité tout en équilibrant le temps nécessaire est de plus en plus critique. Les protocoles qui impliquent des gradients de Percoll sont le temps et de main - d&#39;œuvre et potentiellement plus sujettes à l&#39; erreur humaine, conduisant à un rendement variable et la viabilité 13. Ici, nous fournissons un protocole optimisé pour l&#39;isolement et la caractérisation des lymphocytes de tous les compartiments 3 immunitaire de l&#39;intestin grêle. De plus, l&#39;intérêt croissant porté par des altérations induites par les microbes dans le système immunitaire des muqueuses, on comprend les étapes qui peuvent être utilisés pour permettre la transmission horizontale des micro-organismes entre la souris pour évaluer la façon dont ces modifications affectent quantitativement le système immunitaire intestinal.

<table><tbody><tr><td>Gants stériles</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>cage stérile pour souris</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>contient un couvercle, un fond de cage et une litière alpha-dri</td></tr><tr><td>Distributeur en métal</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille d’eau</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Porte-cartes</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur autoclavable chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>la concentration dans le protocole est basée sur un niveau d’activité de 1,878 U/mg</td></tr><tr><td>de collagénase, type II&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>la concentration dans le protocole est basée sur un niveau d’activité de 245 U/mg</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d’alimentation (18 G, longueur 2")</td> <td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 ml</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable (15 lames)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Pince courbe</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Pince droite</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Gobelets polyvalents, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Barre d’agitation</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’agitation multi-positions, 9 positions</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Conique en acier inoxydable passoire, 3 pouces&nbsp ;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Tube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; m Crépine à cellule</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; m Crépine à cellules</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube conique</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringue</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96 puits Plaque à fond rond</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/32 (bloc Fc)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>(En option) Colorant de viabilité fixable eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10 % Formalin, tampon neutre</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle lymphocytes murine

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Les intestins - qui contiennent le plus grand nombre de cellules immunitaires de tout organe dans le corps - sont constamment exposés à des antigènes étrangers, à la fois microbienne et alimentaire. Compte tenu de la compréhension croissante que ces antigènes luminal contribuent à façonner la réponse immunitaire et que l&#39;éducation des cellules immunitaires dans l&#39;intestin est critique pour un certain nombre de maladies systémiques, on a accru l&#39;intérêt pour la caractérisation du système immunitaire intestinal. Cependant, de nombreux protocoles publiés sont laborieux et prend du temps. Nous présentons ici un protocole simplifié pour l&#39;isolement de lymphocytes à partir propria de l&#39;intestin grêle lamina couche intraépithéliales et les plaques de Peyer qui est rapide, reproductible et ne nécessite pas de gradients de Percoll laborieux. Bien que le protocole met l&#39;accent sur l&#39;intestin grêle, il est également adapté à l&#39;analyse du côlon. De plus, nous mettons en évidence certains aspects qui peuvent avoir besoin d&#39;optimisation supplémentaires en fonction de la ques scientifique spécifiquetion. Cette approche se traduit par l&#39;isolement d&#39;un grand nombre de lymphocytes viables qui peuvent ensuite être utilisés pour l&#39;analyse par cytométrie de flux ou d&#39;autres moyens de caractérisation.

L&#39; analyse par cytométrie de suspensions de cellules isolées de l&#39; intestin grêle lymphocytes devrait donner une population discrète de cellules qui ont des caractéristiques similaires avant et dispersion latérale comme splénocytes (Figures 1A et 1B). Les lymphocytes peuvent commencer à mourir si le tissu ne soit pas maintenu à 4 ° C au cours des premières étapes de l&#39;isolement, ce qui entraîne dans la population de lymphocytes ayant une dispersion inférieure...

La caractérisation quantitative des lymphocytes intestinaux suscite un intérêt croissant en raison de la reconnaissance croissante du fait que ces cellules jouent un rôle essentiel dans diverses maladies intestinales et systémiques. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler des populations de cellules uniques de différents compartiments de l’intestin grêle pour une caractérisation ultérieure de la cytométrie en flux.

L&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle Lymphocytes murine

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des populations de cellules individuelles provenant de différents compartiments de l'intestin grêle, qui peuvent ensuite être utilisées pour une analyse par cytométrie en flux ou par tout autre moyen de caractérisation. Cette méthode permet de répondre à des questions clés en immunologie muqueuse, comme la manière dont la microbiote influence le développement du système immunitaire intestinal. Les principaux avantages de cette technique sont sa rapidité, sa reproductibilité et le fait qu'elle ne nécessite pas de gradients de Percoll laborieux.Pour commencer cette procédure, placez la souris en position dorsale et vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 pour cent. Effectuez une laparotomie en incisant successivement la peau puis la fascia péritonéale le long de la ligne médiane ventrale, de la symphyse pubienne jusqu’au processus xiphoïde, exposant ainsi la cavité péritonéale. Ensuite, séparez l’intestin grêle de l’estomac en sectionant le sphincter pylorique. Retirez délicatement l’intestin grêle du péritoine et détachez la graisse mésentérique.Pour retirer complètement l'intestin grêle, effectuez une deuxième incision au niveau

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ici, nous détaillons une méthode pour l'isolement rapide des cellules dendritiques de souris intestinales (DCS) et les macrophages. Caractérisation phénotypique des CD intestinales et les macrophages est effectuée en utilisant plusieurs couleurs d'écoulement analyse cytométrique tandis magnétique enrichissement bourrelet suivie par tri cellulaire est utilisé pour donner des populations de grande pureté pour des études fonctionnelles.

L&#39;isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de l&#39;intestin de souris

Nous décrivons l'isolement rapide des primaires murins cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) par flux cytométrique sélection négative. Ceux-ci montrent AECII viabilité et à la pureté et conviennent à un large éventail d'études fonctionnelles et moléculaires concernant leur rôle dans les affections respiratoires comme les maladies auto-immunes ou infectieuses.

Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

Les lymphocytes sont les principaux acteurs des réponses immunitaires adaptatives. Ici, nous présentons un protocole de purification des lymphocytes pour déterminer les fonctions physiologiques des molécules souhaitées dans l’activation des lymphocytes in vitro et in vivo. Les procédures expérimentales décrites conviennent pour comparer les capacités fonctionnelles entre les lymphocytes témoins et les lymphocytes génétiquement modifiés.

Isolement et activation de murins Lymphocytes

Cet article décrit la cytométrie spectrale, une nouvelle approche en cytométrie de flux qui utilise les formes des spectres d'émission pour distinguer fluorochromes. Un algorithme remplace compensations et peut traiter auto-fluorescence comme un paramètre indépendant. Cette nouvelle approche permet l'analyse correcte des cellules isolées à partir d'organes solides.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

Ici, nous présentons un protocole visant à préparer les cellules individuelles de thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate afin d’étudier ces cellules à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce protocole a été utilisé pour la détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs utilisant l’écoulement cytometry.

Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux

Nous décrivons ici une analyse simple de l’hétérogénéité du compartiment des cellules B immunitaires murines dans le péritoine, la rate et les tissus de la moelle osseuse par cytométrie en flux. Le protocole peut être adapté et étendu à d’autres tissus de souris.

Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

Il s’agit d’une méthode pour isoler les cellules lymphoïdes utérines de souris gestantes et non enceintes. Cette méthode peut être utilisée pour de multiples applications en aval telles que le phénotypage FACS, le tri cellulaire, les tests fonctionnels, la séparation de l’ARN et la protéomique. Le protocole montre ici comment phénotyper les cellules lymphoïdes innées utérines du groupe 1 par cytométrie en flux.

Isolement des cellules lymphoïdes innées utérines pour analyse par cytométrie en flux

Dans cette étude, nous présentons un protocole efficace et reproductible pour isoler les populations immunitaires du système respiratoire murin. Nous fournissons également une méthode pour l’identification de toutes les cellules immunitaires innées et adaptatives qui résident dans les poumons de souris saines, en utilisant un panel de cytométrie en flux à base de 9 couleurs.

Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

Ce protocole offre des instructions détaillées pour établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, isoler les cellules lymphoïdes innées de type 1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin et établir des co-cultures en 3 dimensions (3D) entre les deux types de cellules pour étudier les interactions bidirectionnelles entre les cellules épithéliales intestinales et les cellules lymphoïdes innées de type 1.

Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

Découvrez une méthode rapide et reproductible pour isoler des lymphocytes intestinaux chez la souris et les caractériser par cytométrie en flux. Cette technique optimise l'étude de l'immunité muqueuse et du rôle du microbiote intestinal.

L'isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l'intestin grêle Lymphocytes murine

Explorer plus de vidéos