Isolement des cellules lymphoïdes innées utérines pour analyse par cytométrie en flux

Il s’agit d’une méthode pour isoler les cellules lymphoïdes utérines de souris gestantes et non enceintes. Cette méthode peut être utilisée pour de multiples applications en aval telles que le phénotypage FACS, le tri cellulaire, les tests fonctionnels, la séparation de l’ARN et la protéomique. Le protocole montre ici comment phénotyper les cellules lymphoïdes innées utérines du groupe 1 par cytométrie en flux.

Notre méthode permet d’évaluer la composition et les caractéristiques fonctionnelles de différentes sous-populations de lymphocytes présentes dans le tissu utérin des animaux gravides et non gravides. Ce protocole permet d’isoler les lymphocytes utérins tout en préservant l’expression de surface des protéines, la viabilité cellulaire et la fonctionnalité. Par conséquent, il convient à une gamme d’applications ultérieures.

L’ablation du fœtus au début de l’expérience et la collecte de leucocytes sont des étapes techniquement difficiles. Comme il s’agit d’une longue expérience, une attention et une attention particulières sont nécessaires une fois que vous avez atteint les étapes de coloration des anticorps. Pour commencer, transférez le tissu utérin prélevé sur une souris femelle C57 noire six femmes enceinte dans une boîte de Pétri stérile, puis à l’aide d’instruments stériles, retirez doucement la graisse entourant le tissu, en prenant soin de ne pas laisser le tissu sécher.

Retirez les fœtus en disséquant chaque site d’implantation avec des instruments stériles, puis ramenez l’utérus dans son tube de collecte original de cinq millilitres contenant un millilitre de support de collecte. À l’aide de ciseaux, hachez le tissu dans le tube de collecte, puis placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite trois millilitres de mélange de digestion enzymatique préchauffé au tube.

Incuber le tube pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec agitation pour améliorer l’activité de digestion enzymatique. Une fois l’incubation terminée, vortexez le tube et maintenez-le sur la glace pour inhiber l’activité enzymatique, puis transférez le tissu digestif dans un tube centrifuge de 15 millilitres correctement étiqueté. Rincez le tube de collecte de cinq millilitres avec un total de 10 millilitres de solution glacée de cinq millimolaires EDTA PBS pour recueillir tout le tissu restant et le transférer dans le tube de centrifugeuse de 15 millilitres.

Centrifuger l’échantillon de tissu digéré pendant 10 minutes à 400 fois G.Jeter le surnageant, faire glisser doucement la pastille, puis remettre en suspension dans 10 millilitres de solution préchauffée de pbS EDTA de cinq millimolaires préchauffés. Pour réduire l’agglutination cellulaire, incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius avec agitation, suivi d’un vortex à haute température pendant 10 secondes. Pour éliminer les amas cellulaires dans les tissus non dissociés, placez une passoire de 70 micromètres sur un tube de centrifugeuse stérile de 50 millilitres, puis à l’aide du piston d’une seringue stérile d’un millilitre, forcez le tissu digéré à travers la passoire dans le tube.

Lavez la passoire plusieurs fois avec un total de 10 millilitres de PBS froid pour recueillir toutes les cellules, puis passez le tube de centrifugeuse de 50 millilitres pendant 10 minutes à 400 fois G.Après avoir jeté le surnageant, les cellules lymphoïdes innées peuvent être isolées à l’aide de l’option A ou de l’option B.Pour l’option A, remettez en suspension la pastille en cinq millilitres de 80% isotonique par appel à l’aide d’une pipette voy. Ensuite, en utilisant la pipette voy à vitesse lente, superposez soigneusement huit millilitres, 40% par solution d’appel, sur la pastille remise en suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Pipette lentement et continuellement, en maintenant le 15 millilitre à un angle d’environ 45 degrés.

Sans perturber la superposition, centrifugez le tube pendant 20 minutes à 850 fois G avec une accélération moyenne et des pauses minimales à température ambiante. Une fois la centrifugation terminée, retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse sans perturber les couches par appel. Ensuite, sans perturber l’anneau des leucocytes à l’interface des deux solutions par appel, utilisez une pipette pasteur stérile pour tout jeter sauf 0,5 à un millilitre de la couche supérieure par appel.

Tout en essayant de réduire au minimum la quantité de solution aspirée par appel dans la pipette, collectez soigneusement l’anneau de leucocytes et transférez les cellules dans un nouveau tube de centrifugeuse marqué de 15 millilitres. Ajouter 10 millilitres de milieu RPMI stérile complété par 10% de chaleur et FBS activé aux cellules, puis centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 500 fois G et quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et procédez à la lyse des globules rouges.

Pour isoler les cellules à l’aide de l’option B, après avoir passé le tissu digéré à travers la passoire cellulaire et centrifugé le résultat en suspension cellulaire comme démontré précédemment, remettez en suspension la pastille avec huit millilitres de 35% isotonique par appel et milieu RPMI, et transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez le tube à 940 fois G pendant 10 minutes à température ambiante avec une accélération moyenne et des pauses minimales. Ensuite, à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette voy, aspirez soigneusement le surnageant avant de remettre la pastille dans 14 millilitres de milieu RPMI complété par 10% de chaleur et FBS activé.

Centrifuger à nouveau l’échantillon pendant cinq minutes à 500 fois G et quatre degrés Celsius, puis jeter le surnageant par aspiration et procéder à la lyse des globules rouges. Pour lyser les globules rouges, remettre l’échantillon en suspension dans trois millilitres d’une solution de lysage des globules rouges X et incuber pendant trois minutes à température ambiante, puis ajouter 10 millilitres de PBS dans l’échantillon pour arrêter la réaction. Centrifuger le tube à 400 fois G pendant cinq minutes après avoir jeté le surnageant, ajouter 10 millilitres supplémentaires de PBS et répéter la centrofugation.

Remettre en suspension la pastille dans un millilitre de milieu RPMI complété par un FBS inactivé à la chaleur de 10%, puis passer la suspension dans la cellule à travers une passoire cellulaire stérile de 70 micromètres. Après avoir compté, les cellules ajustent la concentration de la suspension cellulaire à un à 2 millions de cellules dans 100 microlitres de PBS et procèdent à la coloration et à l’analyse des facs. Les ILC utérins du groupe un comprennent les cellules NK conventionnelles, les cellules NK résidentes des tissus et les ILC du groupe un, leurs pourcentages variant au cours de la vie et de la grossesse.

Ces sous-ensembles peuvent être discriminés à l’aide de la cytométrie en flux en examinant d’abord les cellules sur leur capacité à diffuser la lumière, puis en isolant les cellules CD 45 positives CD 45 positives et négatives CD 19 négatives, puis en identifiant les ILC du groupe un qui sont NK 1.1 et NKP 46 positifs. Dans les ILC du groupe un, les EM NÉGATIFS CD49A positifs sont des cellules NK conventionnelles. Les cellules Ems positives CD49A sont des cellules NK résidentes dans les tissus.

Et les cellules Ems négatives CD49 positives sont des ILC utérins du premier groupe. La coloration des lymphocytes spléniques et utérins avec des anticorps anti NK P46 et anti NK 1.1 montre que les lymphocytes spléniques expriment des quantités plus élevées de NKP 46 à leur surface que leur homologue utérin. Dans la dissociation enzymatique des tissus, les épitopes de surface peuvent être modifiés en fonction des enzymes utilisées dans le milieu de digestion.

Par exemple, la coloration du récepteur CD49 NKG2A du CMH est faible lorsque la libérase TM est utilisée. Cependant, la digestion avec la libérase DH préserve la reconnaissance NKG2A par le clone d’anticorps 1611. Environ 6,5% des ILC du groupe un présents dans les échantillons de tissu utérin au jour de gestation 8,5 sont dérivés du sang.

Les contaminants sanguins peuvent être exclus par coloration intravitale avec des anticorps anti CD45 conjugués à un fluorochrome. Lors de la mise en place de réunions de temps, vous devez prendre en considération que les souris sont nocturnes. Par conséquent, ils doivent être installés le plus tard possible dans l’après-midi car l’accouplement aura lieu pendant la nuit.

De plus, lors de la sélection des femmes, vous devez vous assurer qu’elles n’ont pas de cloison vaginale. Nous effectuons généralement des analyses de cytométrie en flux pour examiner de nombreuses protéines à l’extérieur des cellules et à l’intérieur des cellules. Nous faisons également de l’extraction d’acides nucléiques pour étudier l’expression des gènes, y compris le séquençage de l’ARN.

Et nous parvenons également à contourner les tests fonctionnels pour étudier les réponses des cellules lymphoïdes innées utérines.