Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

L'objectif général de cette technique de cytométrie spectrale est de distinguer différents fluorochromes en utilisant leurs spectres d'émission complets. De plus, ce protocole permet d'utiliser la fluorescence autofluorescente comme paramètre indépendant, autorisant ainsi une analyse adéquate des cellules isolées d'organes solides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'immunologie et du développement de la biologie des cellules souches, comme la manière d'identifier des populations cellulaires rares.

Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité unique à analyser simultanément un grand nombre de paramètres et à gérer l'autofluorescence des tissus solides. Bien que cette méthode soit utilisée pour la préparation d'une suspension de cellules uniques provenant de l'intestin et du cœur, elle peut également être appliquée à d'autres organes, tels que le poumon, le muscle squelettique, le foie, la graisse et le rein. Pour commencer, isoler et laver l'intestin grêle d'une souris adulte.

Ensuite, placez le tissu sur une serviette en papier et, à l’aide de ciseaux bien aiguisés, retirez soigneusement les plaques de Peyer. Ouvrez l’intestin en effectuant une incision longitudinale et divisez-le en morceaux d’un centimètre. Transférez ensuite le tissu dans un bécher contenant 30 millilitres de HBSS enrichi en 10 % de SFC, puis incubez à 37 degrés Celsius avec agitation constante pendant 30 minutes.

Une fois l'incubation terminée, transférez la suspension cellulaire dans un tube en plastique de 15 millilitres et vortexez vigoureusement pendant cinq minutes. Incubez ensuite la suspension sur de la glace pendant dix minutes afin de permettre la sédimentation des grands fragments non dissociés. Par la suite, transférez le surnageant dans un nouveau tube et centrifugez les cellules à 120 ×g pendant sept minutes.

Une fois pelletées, nous suspendons les cellules dans dix millilitres de FCS à un pour cent dans du HBSS et nous les comptons à l’aide d’une chambre de Neubauer. Avant la coloration des cellules, transférez un fois dix puissance six cellules intestinales dans un tube de cinq millilitres afin de préparer un témoin négatif. Pour préparer un échantillon, ajoutez un fois dix puissance six cellules intestinales, suivies de deux millilitres de HBSS contenant un pour cent de FCS, dans un nouveau tube de cinq millilitres, puis centrifugez la suspension à 120 ×g, à quatre degrés Celsius, pendant cinq minutes.

Après avoir éliminé le surnageant, on suspend les cellules dans 50 microlitres de solution d'anticorps. Envelopper le tube dans du papier d'aluminium et incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois l'incubation terminée, ajouter deux millilitres de FCS à un pour cent dans du HBSS à l'échantillon et centrifuger à 120 fois G, à quatre degrés Celsius, pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et resuspendez le culot dans 200 microlitres de solution d'iodure de propidium à 0,5 microgrammes par millilitre. Après avoir décapité un embryon de souris, faites tremper son corps dans une boîte de Pétri, tapissée d'une serviette en papier préalablement humidifiée, et remplie de 50 millilitres de HBSS contenant un pour cent de FCS. Sous un microscope stéréo, faites une incision sur le côté droit de la poitrine de l'embryon et ouvrez soigneusement le thorax, en évitant d'endommager le cœur.

Saisir les gros vaisseaux et extraire le cœur relié aux poumons et au thymus. Transférer les organes dans une boîte de Pétri de 35 millilitres remplie de deux millilitres d'HBSS contenant un pour cent de FCS. Ensuite, isoler le cœur des organes environnants et du tissu conjonctif.

Après avoir lavé le cœur, immergez-le dans un millilitre de solution enzymatique préchauffée et, à l’aide de pinces fines et d’un scalpel, hachez l’organe en morceaux d’un millimètre cube sous un stéréomicroscope. Ajoutez un millilitre supplémentaire de solution enzymatique préchauffée et transférez le tissu fragmenté dans un tube de cinq millilitres fermé par un bouchon. Incubez l’échantillon en position horizontale à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Une fois l'incubation terminée, homogénéisez le tissu par des pipetages répétés de la suspension à l’aide d’une pipette P1000. Ensuite, mettez de côté les échantillons placés verticalement jusqu’à ce que les fragments de tissus non digérés sédimentent. Transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres.

Ajoutez deux millilitres de FCS à dix pour cent dans du HBSS et maintenez les cellules isolées sur de la glace. Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution enzymatique préchauffée dans le tube de cinq millilitres contenant le sédiment de tissu non digéré, puis poursuivez la digestion du tissu comme indiqué précédemment jusqu’à disparition complète du tissu. Centrifugez la suspension cellulaire obtenue à 120 ×g pendant dix minutes.

Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans un millilitre de FCS à un pour cent dans du HBSS, sans cations calcium et magnésium. Pour colorer les cellules cardiaques, transférer 200 microlitres de la suspension cellulaire dans des puits d'une plaque ronde de 96 puits. Centrifuger la plaque à 480 ×g pendant une minute et éliminer le surnageant.

Ensuite, resuspendez les cellules cardiaques dans 100 microlitres de la solution d'anticorps. Enveloppez la plaque dans du papier d'aluminium et incubez-la à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois l'incubation terminée, lavez les cellules cardiaques avec 200 microlitres de FCS à un pour cent dans du HBSS sans calcium ni magnésium, puis centrifugez la suspension à 480 ×g pendant une minute.

Ensuite, resuspendre les cellules dans 200 microlitres d’HBSS contenant un pour cent de FCS et dépourvu d'ions calcium et magnésium, puis transférer la suspension dans un tube de cinq millilitres prérempli avec 200 microlitres d’HBSS contenant un pour cent de FCS et dépourvu de calcium et de magnésium. Enfin, ajouter 400 microlitres d’HBSS contenant un pour cent de FCS et dépourvu de cations calcium et magnésium, comprenant 0,5 microgramme par millilitre d’iodure de propidium, et filtrer la suspension cellulaire à travers une maille en nylon de 70 micromètres. Pour visualiser les cellules, charger l’échantillon marqué en cytométrie en flux et cliquer sur aperçu, puis enregistrer jusqu’à deux fois dix à la puissance six événements dans l’échantillon en cliquant sur acquérir.

Dans l'onglet analyse, ouvrez la fenêtre de la palette de couleurs et enregistrez tous les paramètres étudiés en ajoutant le fluorochrome ainsi que son marqueur correspondant. Veillez à inclure les paramètres d'autofluorescence et de viabilité. Dans la fenêtre de contrôle, dans la liste des tubes, analysez le premier échantillon simple coloré contenant les billes de compensation.

Ensuite, dans la feuille de travail, cliquez sur l'outil de dessin de polygone et délimitez la population de billes sur le graphique FSC SSC. Double-cliquez sur la zone délimitée pour créer un graphique fils des billes sélectionnées. Puis, délimitez séparément les billes positives et négatives.

Vérifiez la population fille sélectionnée par une sélection successive et l'élimination des valeurs aberrantes dans chaque fraction positive et négative. Ensuite, téléversez les portes négatives et positives dans la fenêtre de séparation. Puis, sélectionnez l'échantillon de cellules non marquées dans la liste des tubes et créez des portes distinctes pour les cellules autofluorescentes et non autofluorescentes.

Une fois les seuils négatifs et positifs définis pour tous les paramètres, y compris l'autofluorescence et la viabilité, cliquez sur « calculer ». Ensuite, appliquez le démixage aux échantillons analysés. Pour analyser les données, sélectionnez les cellules sur un graphique de la SSC en fonction de la FSC et excluez les cellules mortes marquées par l'iodure de propidium.

Enfin, déterminez les fenêtres pour toutes les populations d'intérêt. Les résultats présentés ici proviennent d'analyses de cytométrie en flux et de cytométrie spectrale des cellules isolées du cœur fœtal et marquées avec des anticorps anti-TER119, anti-CD45 et anti-Sca-1. Un sous-ensemble de cellules autofluorescentes a été détecté par deux cytomètres conventionnels, tandis qu'en cytométrie spectrale, ces cellules n'ont pas été identifiées comme autofluorescentes et ont été incluses dans la population négative pour CD45 et TER119.

Les cellules identifiées par cytométrie en flux classique comme autofluorescentes, mais non positives pour CD31, ont ensuite été analysées pour l'expression de transcrits spécifiques aux cardiomyocytes. Des niveaux élevés de troponine cardiaque et de transcrits semblables à ceux des myocytes atriaux ont été détectés dans la population de cellules autofluorescentes, confirmant qu'un large sous-ensemble de myocytes cardiaques échappe à la cytométrie en flux classique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ huit heures, à condition qu'elle soit correctement effectuée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que toutes les étapes doivent être effectuées sur de la glace et dans les délais appropriés afin de garantir la viabilité des cellules. Après cette procédure, des protéines intracellulaires peuvent être analysées et des marqueurs de surface supplémentaires peuvent être étudiés afin de répondre à des questions concernant des voies moléculaires spécifiques. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie ainsi que de la biologie du développement ou des cellules souches, leur permettant d'explorer et d'isoler des populations rares provenant de différents organes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler et de colorer des cellules provenant de tissus cellulaires, ainsi que de la façon d'analyser l'expression des marqueurs de surface par cytométrie spectrale en flux, qui permet de surmonter les limitations dues à la fluorescence autofluorescente des cellules. N'oubliez pas que le travail avec l'iodure de propidium peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle (EPI) doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.