Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

L’objectif global de cette technique de cytométrie spectrale est de distinguer différents fluorochromes en utilisant l’ensemble de leurs spectres d’émission. De plus, ce protocole permet la mise en œuvre de l’autofluorescence en tant que paramètre indépendant, permettant une analyse correcte des cellules isolées des organes solides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunologie et du développement de la biologie des cellules souches, telles que l’identification de populations de cellules rares.

Le principal avantage de cette technique est sa capacité unique à analyser simultanément un grand nombre de paramètres et à gérer l’autofluorescence des tissus solides. Bien que cette méthode soit utilisée pour la préparation d’une suspension de cellule unique dérivée de l’intestin et du cœur, elle peut également être appliquée à d’autres organes, tels que les poumons, les squelettes, les muscles, le foie, la graisse et les reins. Pour commencer, isolez et lavez l’intestin grêle d’une souris adulte.

Ensuite, placez le mouchoir sur une serviette en papier et, à l’aide de ciseaux bien aiguisés, retirez soigneusement les patchs de Peyer. Ouvrez l’intestin en le coupant longitudinalement et divisez-le en morceaux d’un centimètre. Ensuite, transférez le tissu dans un bécher rempli de 30 millilitres de HBSS complété par dix pour cent de FCS, et incubez-le à 37 degrés Celsius en remuant constamment pendant 30 minutes.

Une fois l’incubation terminée, transférez la suspension cellulaire dans un tube en plastique de 15 millilitres et agitez-la vigoureusement pendant cinq minutes. Ensuite, incubez la suspension sur de la glace pendant dix minutes pour permettre aux gros fragments non dissociés de sédimenter. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube et faites tourner les cellules à 120 fois G pendant sept minutes.

Une fois granulées, nous suspendons les cellules dans dix millilitres de 1 pour cent de FCS dans HBSS et les comptons à l’aide d’une chambre Neubauer. Avant la coloration cellulaire, transférez une fois dix cellules à la sixième cellules intestinales dans un tube de cinq millilitres pour préparer un contrôle négatif. Pour préparer un échantillon, ajoutez une fois dix fois au sixième des cellules intestinales, puis deux millilitres de HBSS avec un pour cent de FCS dans un nouveau tube de cinq millilitres et centrifugez la suspension à 120 fois G, à quatre degrés Celsius, pendant cinq minutes.

Après avoir jeté le surnageant, nous suspendons les cellules dans 50 microlitres de la solution d’anticorps. Enveloppez le tube de papier d’aluminium et incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois l’incubation terminée, ajoutez deux millilitres de FCS à un pour cent de HBSS à l’échantillon et centrifugez-le à 120 fois G, quatre degrés Celsius, pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de solution d’iodure de propidium à 0,5 microgramme par millilitre. Après avoir décapité un embryon de souris, trempez son corps dans une boîte de Pétri, tapissée d’une serviette en papier pré-humide et remplie de 50 millilitres de FCS à un pour cent dans HBSS. Au microscope stéréoscopique, faites une incision sur le côté droit de la poitrine de l’embryon et ouvrez soigneusement le thorax, en évitant d’endommager le cœur.

Saisissez les gros vaisseaux et extrayez le cœur relié aux poumons et au thymus. Transférez les organes dans une boîte de Pétri de 35 millilitres remplie de deux millilitres de FCS à un pour cent dans HBSS. Ensuite, isolez le cœur des organes environnants et du tissu conjonctif.

Après avoir lavé le cœur, trempez-le dans un millilitre de solution enzymatique préchauffée et, à l’aide d’une pince fine et d’un scalpel, hachez l’organe en morceaux d’un millimètre cube sous un stéréomicroscope. Ajoutez un millilitre supplémentaire de solution enzymatique préchauffée et transférez le tissu fragmenté dans un tube bouché de cinq millilitres. Incuber l’échantillon en position horizontale à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Une fois l’incubation terminée, homogénéiser le tissu par pipetage répétitif de la suspension avec une pipette P1000. Ensuite, mettez les échantillons, positionnés verticalement, de côté jusqu’à ce que les fragments des tissus non digérés se déposent. Transférez le surnageant dans un tube de 50 millilitres.

Ajoutez deux millilitres de FCS à dix pour cent dans HBSS et gardez les cellules isolées sur de la glace. Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution enzymatique préchauffée dans le tube de cinq millilitres contenant le sédiment tissulaire non digéré, et continuez à digérer le tissu comme indiqué précédemment jusqu’à ce qu’aucun tissu restant ne soit observé. Centrifugez la suspension cellulaire obtenue à 120 fois G pendant dix minutes.

Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de FCS pour cent dans HBSS, sans cations de calcium et de magnésium. Pour colorer les cellules cardiaques, transférez 200 microlitres de suspension cellulaire dans les puits d’une plaque à fond rond à 96 puits. Centrifugez la plaque à 480 fois G pendant une minute et jetez le surnageant.

Ensuite, mettez les cellules cardiaques en suspension dans 100 microlitres de la solution d’anticorps. Enveloppez l’assiette dans du papier d’aluminium et incubez-la à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois l’incubation terminée, lavez les cellules cardiaques avec 200 microlitres d’un pour cent de FCS dans du HBSS sans calcium ni magnésium, et centrifugez la suspension à 480 fois G pendant une minute.

Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de FCS à 1 % dans un HBSS sans ions calcium et magnésium, et transférez la suspension dans un tube de cinq millilitres prérempli de 200 microlitres de FCS à 1 % de HBSS sans calcium ni magnésium. Enfin, ajoutez 400 microlitres de 1 % de FCS dans un HBSS exempt de cations de calcium et de magnésium, contenant 0,5 microgramme par millilitre d’iodure de propidium et filtrez la suspension cellulaire à travers un maillage de 70 micro nylon. Pour visualiser les cellules, chargez l’échantillon coloré dans une cytométrie en flux et cliquez sur Aperçu, puis enregistrez jusqu’à deux fois dix jusqu’au sixième événements de l’échantillon en cliquant sur Acquérir.

Dans l’onglet analyse, ouvrez la fenêtre de la palette de couleurs et enregistrez tous les paramètres étudiés en ajoutant le fluorochrome avec son marqueur correspondant. Assurez-vous d’inclure les paramètres d’autofluorescence et de viabilité. Dans la fenêtre de contrôle, à l’intérieur de la liste des tubes, analysez le premier échantillon coloré unique contenant des billes de compensation.

Ensuite, dans la feuille de travail, cliquez sur l’outil de conception de polygone et bloquez la population de billes dans le graphique FSC SSC. Double-cliquez sur le portail pour créer un tracé fille des perles fermées. Et puis les perles positives et négatives séparément des portes.

Vérifiez la population fille sélectionnée par des contrôles successifs et l’élimination des valeurs aberrantes dans chaque fraction positive et négative. Ensuite, téléchargez les portes négatives et positives dans la fenêtre de démixage. Ensuite, sélectionnez l’échantillon de cellule non coloré dans la liste des tubes et concevez des portes distinctes pour les cellules autofluorescentes et non autofluorescentes.

Une fois que les portes négatives et positives sont définies pour tous les paramètres, y compris l’autofluorescence et la viabilité, cliquez sur calculer. Ensuite, appliquez le démélange aux échantillons analysés. Pour analyser les données, il suffit de placer les cellules dans un graphique de SSC en fonction de la FSC et d’exclure les cellules mortes colorées à l’iodure de propidium.

Enfin, déterminez des points de contrôle pour toutes les populations d’intérêt. Vous trouverez ici les résultats d’analyses de cytométrie en flux et de cytométrie spectrale de cellules isolées du cœur fœtal et colorées avec des anticorps anti-TER119, anti-CD45 et anti-Sca-1. Un sous-ensemble de cellules d’autofluorescence a été détecté par deux cytomètres conventionnels, tandis qu’en cytométrie spectrale, ces cellules n’étaient pas définies comme autofluorescentes et étaient comprises dans la population CD45 TER119 négative

Les cellules identifiées par la cytométrie en flux conventionnelle comme étant autofluorescentes, mais pas les cellules CD31 positives, ont ensuite été analysées pour l’expression des transcrits spécifiques des cardiomyocytes. Des niveaux élevés de troponine cardiaque et de myocytes auriculaires comme les transcrits de train ont été trouvés dans la population de cellules autofluorescentes, confirmant qu’un grand sous-ensemble de myocytes cardiaques n’est pas détecté dans la cytométrie en flux conventionnelle. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures environ, si elle est correctement préformée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que toutes les étapes doivent être effectuées sur la glace et dans un manoir en temps opportun pour s’assurer que les cellules restent viables. À la suite de ces procédures, des protéines intracellulaires et des analyses de marqueurs de surface supplémentaires peuvent être préformées afin de répondre à des questions concernant des voies moléculaires spécifiques. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie et de la biologie du développement ou des cellules souches pour explorer et isoler des populations rares de différents organes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de colorer les cellules des tissus cellulaires, et de la façon d’analyser l’expression des marqueurs de surface par cytométrie spectrale en flux qui surmonte les limites résultant de l’autofluorescence cellulaire. N’oubliez pas que travailler avec de l’iodure de propidium peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’EPI doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.