Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

L’objectif global de ce protocole est d’isoler les lymphocytes des sites inductifs intestinaux, y compris les plaques de Peyer et les ganglions lymphatiques mésentériques, et les sites effecteurs, y compris la lamina propria et l’épithélium. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des muqueuses, telles que la compréhension des réponses immunitaires aux infections gastro-intestinales, aux cancers et aux maladies inflammatoires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle assure l’isolement de lymphocytes hautement purifiés et viables à partir de compartiments distincts de l’intestin grêle avec une contamination intercompartimentale minimale.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à identifier et à isoler les ganglions lymphatiques du mésentère et les plaques de Peyer et à trouver un équilibre entre vitesse et précision pour des rendements optimaux. Pour commencer le protocole, placez une souris préalablement anesthésiée sur son dos et vaporisez-la avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux pour faire une incision médiane et ouvrez la peau et la paroi abdominale pour exposer la cavité péritonéale.

Ensuite, localisez le caecum et utilisez une pince pour tirer doucement le cæcum vers le bas. À l’aide d’une pince, déplacez soigneusement l’intestin grêle vers la droite, exposant ainsi l’ensemble des ganglions lymphatiques mésentériques ou la chaîne MLN, qui est alignée avec le côlon. Identifiez le nœud inférieur de la chaîne situé le plus près du cæcum.

Utilisez une paire de pinces pour saisir la graisse du mésentère autour de celle-ci et déplacez doucement la chaîne MLN de bas en haut en épilant la graisse autour du ganglion lymphatique avec une autre paire de pinces. Ensuite, humidifiez une serviette avec du milieu de récolte et posez la chaîne MLN sur la serviette en papier. Enlevez la graisse du mésentère en roulant la chaîne sur l’essuie-tout et en retirant la graisse avec deux paires de pinces.

Placez le MLN dans un substrat de récolte froid pour les étapes d’isolement ultérieures. À l’aide de ciseaux, coupez l’intestin grêle sous le sphincter pylorique et au-dessus du caïcum. Tirez lentement l’intestin de l’iléon vers le duodénum à l’aide d’une paire de pinces tout en retirant la graisse du mésentère attachée à l’aide d’une autre paire de pinces.

Placez l’intestin sur une serviette en papier imbibée de milieu de récolte et retirez la graisse de mésentère restante avec deux paires de pinces. Gardez l’intestin humidifié tout au long de ces étapes en appliquant périodiquement des milieux de récolte. Prélevez les patchs de Peyer en les retirant de l’intestin avec des ciseaux incurvés.

Récupérez 5 à 11 plaques de Peyer dans l’intestin grêle. Placez les plaques de Peyer dans un substrat de récolte à froid pour les étapes d’isolement ultérieures. Utilisez le côté plat de la pince et glissez doucement du duodénum vers l’iléon pour expulser le contenu fécal et le mucus.

Répétez cette étape une fois pour éliminer la majeure partie du mucus. Utilisez des ciseaux fins avec une extrémité émoussée sur un point, insérez l’extrémité émoussée dans l’intestin et coupez l’intestin ouvert longitudinalement du duodénum à l’iléon. Coupez latéralement l’intestin ouvert en morceaux de deux centimètres.

Placez les morceaux intestinaux dans un tube conique de 50 millilitres avec un milieu de récolte froid de 25 millilitres pour les étapes d’isolement ultérieures. Isolez les lymphocytes du MLN en les dissociant doucement à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres à l’aide du piston d’une seringue de trois millilitres. Lavez la passoire cellulaire avec cinq millilitres de substrat de récolte à froid.

Granulez les cellules MLN en les centrifugeant à 400 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de substrat de récolte à froid. Lavez les morceaux de l’intestin grêle trois fois avec 25 millilitres de milieu de récolte froid en inversant le tube 10 fois.

Laissez les morceaux intestinaux se déposer et évacuez le surnageant. Ajoutez ensuite 20 millilitres de solution préchauffée de dithioérythritol ou de DTE dans le tube conique de 50 millilitres contenant des morceaux d’intestin et transférez le contenu dans un erlenmeyer siliconé de 50 millilitres avec un agitateur. Utilisez un gros aimant à l’extérieur du ballon pour maintenir le brasseur et transférez le tissu et la solution dans le tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, faites tourbillonner le tube au réglage maximum pendant 10 secondes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres à travers une passoire à cellules de 70 micromètres, en prenant soin de garder les morceaux de tissu dans le tube d’origine. Granulez les cellules.

Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un substrat de récolte à froid de 10 millilitres et l’entreposer sur de la glace. Ajoutez 20 millilitres de solution DTE préchauffée dans le tube conique de 50 millilitres contenant des morceaux d’intestin et transférez dans le flacon Erlenmeyer siliconé de 50 millilitres contenant une barre d’agitation. Utilisez un gros aimant à l’extérieur du ballon pour maintenir le brasseur et transférez le tissu et la solution dans le tube conique de 50 millilitres.

Vortex le tube au réglage maximum pendant 10 secondes. Transférez le surnageant à travers une crépine de cellules de 70 micromètres dans le tube contenant les cellules du surnageant du premier traitement DTE et centrifugez les cellules. Remettez en suspension la pastille de cellule dans huit millilitres de solution à gradient de densité à 44 % ou DG à température ambiante.

Transférez la solution de 8 millilitres de 44 % de DG et la suspension cellulaire dans un tube à fond rond en polypropylène de 17 millimètres sur 100 millimètres de 14 millilitres. Sous-couche les cellules avec cinq millilitres de solution RT 67 %DG. Centrifugeuse à 1 600 fois la gravité pendant 25 minutes à RT sans utiliser le frein.

Les cellules viables forment une couche leucocytaire à l’interface 44 % et 67 %. Retirez la couche de graisse sur le dessus par aspiration sous vide. À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever la couche leucocytaire à l’interface et la transférer dans un tube conique de 50 millilitres contenant 40 millilitres de milieu de récolte à froid.

Centrifuger les cellules à 400 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et remettre en suspension la cellule dans un milieu de récolte à froid d’un millilitre. Retirez les cellules épithéliales des morceaux de tissu intestinal en ajoutant 25 millilitres de solution EDTA préchauffée aux morceaux intestinaux restants et transférez le contenu dans un erlenmeyer siliconé de 50 millilitres avec un barreau d’agitation et remuez. Tenez le barreau d’agitation et jetez soigneusement le surnageant tout en gardant les morceaux intestinaux dans le ballon.

Répétez l’étape d’élimination des cellules épithéliales une fois de plus. Ajoutez ensuite 50 millilitres de milieu de récolte à température ambiante et remuez brièvement le contenu avec un aimant. Laissez ensuite les morceaux intestinaux se déposer et jetez soigneusement le surnageant.

Ajoutez 30 millilitres de solution de collagénase préchauffée et remuez les morceaux intestinaux. Après avoir agité, transférez le tissu digéré et le surnageant dans un tube conique de 50 millilitres à travers une crépine à cellules de 70 micromètres. Dissociez doucement les morceaux de tissu restants à l’aide du piston d’une seringue de trois millilitres pour écraser le filtre.

Lavez le filtre avec 10 millilitres de média de récolte froid et granulez les cellules. Après l’essorage, remettre en suspension la pastille de cellule dans huit millilitres de solution à température ambiante 44 % DG. Transférez les huit millilitres de suspension de cellules de solution à 44 % DG dans un tube à fond rond en polypropylène frais de 70 millimètres sur 100 millimètres.

Sous-couche avec cinq millilitres de solution de température ambiante 67 % DG puis centrifuger les gradients. Retirez la couche de graisse sur le dessus par aspiration sous vide. À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever la couche leucocytaire à l’interface et la transférer dans un tube conique de 50 millilitres contenant 40 millilitres de milieu de récolte à froid.

Enfin, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de substrat de récolte froid. Chaque compartiment immunitaire intestinal est caractérisé par une composition unique de sous-ensembles de lymphocytes. Le MLN est principalement composé de lymphocytes T alpha-bêta, tandis que les lymphocytes PP sont principalement des lymphocytes B.

La composition des lymphocytes LP est principalement composée de lymphocytes T alpha-bêta et de lymphocytes B. Les IEL sont principalement des lymphocytes T gamma delta et des lymphocytes T alpha bêta sans cellules B. Les lymphocytes T CD8 alpha bêta positifs dans les compartiments LP et IEL exprimaient l’homodimère CD8 alpha ou l’hétérodimère CD8 alpha bêta tandis que les lymphocytes T CD8 alpha positif alpha bêta exprimaient principalement l’hétérodimère CD8 alpha bêta

La majorité des lymphocytes T gamma delta du compartiment IEL expriment CD8 alpha, tandis que les lymphocytes T gamma delta du MLN sont dépourvus de CD8 alpha. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de consacrer suffisamment de temps et de soins lors des étapes d’isolement des tissus pour limiter la contamination entre les compartiments intestinaux. À la suite de cette procédure, les lymphocytes isolés peuvent être soumis à une stimulation ex vivo, à une cytométrie en flux et à d’autres techniques pour une analyse phénotypique et fonctionnelle plus poussée.