Reconstitution de base mitotique Spindles dans Spherical Droplets Emulsion

L'objectif général de cette procédure est de reconstituer des structures semblables au fuseau mitotique dans un confinement géométrique constitué de gouttelettes d'émulsion eau dans l'huile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'assemblage du fuseau mitotique, telles que la manière dont les fuseaux sont positionnés et assemblés, et quelle est la contribution spécifique des composants individuels à ces processus. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'une approche ascendante (« bottom-up ») pour reconstituer des structures semblables à un fuseau dans un confinement géométrique qui imite la forme d'une cellule en mitose.

Cette méthode peut également être utilisée pour étudier d'autres processus dépendant du confinement cellulaire. Mélanger 10 parties de prépolymère de PDMS avec une partie d'agent de réticulation, pour une masse totale d'environ 40 grammes. Ensuite, placer le mélange dans une chambre à vide pendant environ 30 minutes afin d'éliminer les bulles d'air.

Pendant ce temps, enroulez du papier d'aluminium autour du moule pour former une cupule d'un centimètre de profondeur et de quatre pouces de diamètre. Une fois prêt, versez environ les 3/4 du mélange de PDMS dans le moule. Ensuite, remettez le PDMS dans une chambre à vide pendant encore 30 minutes.

Après le dégazage, polymériser le PDMS pendant une heure à 100 degrés Celsius. Pendant ce temps, préparer quelques lames de verre pour le dépôt par centrifugation en les nettoyant avec de l'air comprimé. Ensuite, déposer par centrifugation le mélange de PDMS restant sur les lames.

Incubez ces lames pendant une heure à 100 degrés Celsius pour durcir le PDMS. Ensuite, retirez délicatement le PDMS à l’aide d’une lame de rasoir et percez les trous nécessaires dans les bandes de PDMS afin de fabriquer des puces microfluidiques. Maintenant, traitez la puce microfluidique et une lame de verre recouverte de PDMS au corona pendant quelques secondes.

Enfin, placer une puce microfluidique sur chaque lame de verre, les canaux orientés vers le bas, puis faire cuire les puces toute la nuit à 100 degrés Celsius. Premièrement, à l’aide de matériel en verre lavé au chloroforme, préparer environ 250 microgrammes de lipides dissous dans le chloroforme. Sécher soigneusement le mélange lipidique à l’aide d’un gaz inerte.

Puis placez-le dans une chambre à vide pendant une heure. Ensuite, dissolvez les lipides dans de l'huile minérale et 2,5 % de tensioactif à 0,5 milligramme par millilitre, soit environ 500 microlitres. Pour dissoudre complètement les lipides, soumettez le mélange à une sonication pendant 30 minutes à 40 kilohertz.

Ensuite, appliquez par centrifugation du PDMS sur des lamelles avec une épaisseur adaptée à l'objectif du microscope. Puis, appliquez par centrifugation du PDMS sur des lames de verre. Incubez maintenant les lamelles et lames de verre recouvertes de PDMS pendant une heure à 100 degrés Celsius.

Ensuite, réalisez les cellules d'écoulement en disposant de manière rapprochée des tranches fines de film d'étanchéité de laboratoire sur les lames de verre revêtues de PDMS. Placez des bandes de trois millimètres espacées d'environ deux millimètres. Puis, recouvrez les cellules d'écoulement d'une lame couvre-objet revêtue de PDMS, et scellez l'ensemble en faisant fondre le film à 100 degrés Celsius pendant une minute environ.

Une fois chauffé, appuyez doucement sur la lamelle et scellez-la avec du Valap. Préparez ensuite un récipient en PDMS pour l'imagerie à long terme. Percez un trou de quatre millimètres de diamètre dans une tranche de PDMS de trois millimètres d'épaisseur.

Ensuite, soumettez la tranche de PDMS et une lame de verre recouverte de PDMS à un traitement au corona. Une fois le traitement effectué, placez-les l'une sur l'autre et faites cuire l'assemblage toute la nuit à 100 degrés Celsius. Surveillez la formation des gouttelettes au microscope inversé en champ clair.

Reliez la phase huileuse lipidique au contrôleur de pression et augmentez la pression jusqu'à ce qu'une goutte d'huile sorte du tube capillaire. Connectez le tube capillaire à l'entrée deux de la puce microfluidique. Ensuite, remplissez complètement les puces microfluidiques avec la phase huileuse lipidique par l'entrée deux.

Ensuite, introduisez la phase aqueuse à base de MRB-80 par l'entrée un. Contrôlez la taille des gouttelettes en ajustant les pressions de la phase huileuse lipidique et de la phase aqueuse afin de former des gouttelettes d'un diamètre d'environ 15 microns. Une pression d'environ 800 millibars pour la phase huileuse lipidique et de 200 millibars pour la phase aqueuse constitue un bon point de départ.

Après avoir obtenu la taille de gouttelettes souhaitée, remplir complètement la cellule d'écoulement avec les gouttelettes. Celles-ci sont formées à l'aide de petits volumes de la phase aqueuse. Cela signifie que le dispositif microfluidique doit fonctionner rapidement afin de ne pas perdre toute la phase aqueuse avant la formation de gouttelettes de la taille correcte.

Une fois rempli, fermer soigneusement les extrémités de la chambre d'écoulement à l'aide de Valap. Si les gouttelettes ne cessent pas de bouger, le scellement n'est pas complet ou des bulles d'air ont pu être introduites. Pour une observation à long terme, transférer les gouttelettes dans un récipient en PDMS et recouvrir d'une couche de mélange d'huile et de lipides.

Décongeler les centrosomes à température ambiante, puis les placer à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes afin de garantir une nucléation correcte des microtubules. En attendant, préparer le mélange d'essai sur de la glace. Celui-ci doit contenir de la tubuline, du GTP, un système de piégeage de l'oxygène, des générateurs de force moléculaire tels que des réticulateurs de microtubules, de l'ATP et un système de régénération de l'ATP.

Une fois le mélange effectué, centrifuger l'échantillon dans le rotor Airfuge refroidi à 30 psi pendant trois minutes. Ensuite, ajouter les centrosomes préalablement chauffés au mélange. Optimiser la quantité de centrosomes ajoutée afin d'obtenir un ou deux centrosomes par gouttelette.

Ensuite, utilisez ce mélange pour produire des gouttelettes d'émulsion comme décrit précédemment. Afin de recruter la dynamine sur les lipides biotinylés au niveau du cortex des gouttelettes, ajoutez GFP-dynein TMR et la streptavidine à la phase aqueuse. Sur un microscope confocal à disque tournant, visualisez la croissance des microtubules après 30 minutes à 26 degrés Celsius.

Pendant l'acquisition d'images, la croissance des microtubules peut être favorisée en augmentant la température à 28 ou même 30 degrés Celsius. Pour les projections Z, acquérez des séries d'images avec des intervalles d'un micron, ce qui devrait nécessiter environ 20 images par goutte. Allez au panneau principal de la caméra, cliquez sur Modifier Z, puis réglez le pas Z à 1,0.

Cliquez sur Suivant pour enregistrer les paramètres. Ensuite, réglez le gain EM linéaire maximal en cliquant sur l'onglet Caméra dans le panneau d'acquisition, puis en faisant glisser la barre de gain EM jusqu'à 300. Réglez ensuite le temps d'exposition à 200 millisecondes dans le même onglet.

Cliquez sur Enregistrer pour sauvegarder les paramètres. Pour les expériences d'imagerie en temps réel, effectuez des projections en Z toutes les deux minutes pendant deux heures en réduisant les temps d'exposition à environ 100 millisecondes et en augmentant les intervalles en Z à deux micromètres. Pour les expériences d'imagerie en temps réel, utilisez une cupule en PDMS plutôt qu'une cellule d'écoulement classique afin d'immobiliser au maximum l'échantillon.

À l'aide des protocoles décrits, la formation des asters a été étudiée dans des gouttelettes d'émulsion eau-huile contenant des centrosomes. Initialement, les centrosomes diffusent librement au sein des volumes confinés. Après environ 20 à 30 minutes, les premiers microtubules deviennent visibles et la diffusion des centrosomes devient restreinte lorsque les microtubules poussent contre le cortex dans toutes les directions.

Lorsque les microtubules s'allongent au-delà de la moitié du diamètre de la gouttelette, les centrosomes sont repoussés vers des bords opposés, les microtubules s'étendant alors le long du cortex de la gouttelette. En l'absence de streptavidine, la dynamine est diffuse à l'intérieur de la gouttelette. En revanche, en présence de streptavidine, environ 10 minutes après la formation de la gouttelette, la dynamine s'associe aux lipides biotinylés.

Lorsqu'on observe la tubuline fluorescente en présence de la dynéine corticale, il est clair que les centrosomes sont positionnés au centre. En revanche, en l'absence de dynéine, les centrosomes sont repoussés vers des côtés opposés de la gouttelette. Cela est probablement dû au fait que la dynéine favorise les catastrophes des microtubules et les forces de traction corticales, ce qui entraîne le centrage des asters.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser les technologies microfluidiques pour créer des structures en forme de fuseau dans des gouttelettes sphériques d'émulsion. Une fois maîtrisées, la formation des gouttelettes et l'acquisition d'images peuvent être réalisées en deux à trois heures si elles sont correctement effectuées. Grâce à cette procédure, d'autres facteurs d'assemblage du fuseau peuvent être encapsulés afin d'étudier leur effet sur la morphologie et le positionnement du fuseau.

Des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l'utilisation de chloroforme ou de PDMS.