Reconstitution de base mitotique Spindles dans Spherical Droplets Emulsion

L’objectif global de cette procédure est de reconstituer des structures mitotiques en forme de fuseau dans le confinement géométrique de l’eau dans des gouttelettes d’émulsion d’huile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’assemblage des broches mitotiques, telles que la façon dont les broches sont positionnées et assemblées, et quelle est la contribution spécifique des composants individuels à ces processus ? Le principal avantage de cette technique est que nous utilisons une approche ascendante pour reconstituer des structures fusiformes dans le confinement géométrique qui imite la forme d’une cellule mitotique.

Cette méthode peut également être utilisée pour étudier d’autres processus qui dépendent du confinement cellulaire. Mélangez 10 parties de prépolymère PDMS avec une partie d’agent de durcissement dans une masse totale d’environ 40 grammes. Ensuite, placez le mélange dans une chambre à vide pendant environ 30 minutes pour éliminer les bulles d’air.

Pendant ce temps, enroulez du papier d’aluminium autour du moule pour créer une tasse d’un centimètre de profondeur avec un diamètre de quatre pouces. Lorsque vous êtes prêt, versez environ 3/4 du mélange PDMS dans le moule. Ensuite, remettez le PDMS dans une chambre à vide pendant encore 30 minutes.

Après le dégazage, durcissez le PDMS pendant une heure à 100 degrés Celsius. Pendant ce temps, préparez quelques lames de verre pour le revêtement par centrifugation en les dépoussiérant avec de l’air comprimé. Ensuite, essorez l’enrobage du mélange PDMS restant sur les lames.

Faites durcir ces lames pendant une heure à 100 degrés Celsius pour durcir le PDMS. Ensuite, retirez délicatement le PDMS à l’aide d’une lame de rasoir et percez les trous requis dans les bandes PDMS pour fabriquer des puces microfluidiques. Maintenant, traitez la puce microfluidique et une lame de verre recouverte de PDMS pendant quelques secondes.

Enfin, placez une puce microfluidique sur chaque lame de verre avec les canaux vers le bas, et faites cuire les puces pendant la nuit à 100 degrés Celsius. Tout d’abord, à l’aide de verrerie lavée au chloroforme, préparez environ 250 microgrammes de lipides dissous au chloroforme. Séchez soigneusement le mélange de lipides avec un gaz inerte.

Et puis placez-le dans une chambre à vide pendant une heure. Ensuite, dissolvez les lipides dans de l’huile minérale et 2,5 % de tensioactif à 0,5 milligramme par millilitre, soit environ 500 microlitres. Pour dissoudre complètement les lipides, sonicez le mélange pendant 30 minutes à 40 kilohertz.

Ensuite, appliquez une couche de PDMS sur des verres de protection d’une épaisseur correspondant à l’objectif du microscope. Ensuite, faites tourner l’enduit PDMS sur des lames de verre. Maintenant, faites durcir les verres de protection recouverts de PDMS et les lames de verre pendant une heure à 100 degrés Celsius.

Ensuite, fabriquez les cellules d’écoulement en espaçant étroitement de fines tranches de film d’étanchéité de laboratoire sur les lames de verre recouvertes de PDMS. Positionnez trois bandes millimétriques à environ deux millimètres l’une de l’autre. Ensuite, couvrez les cellules d’écoulement avec une lamelle recouverte de PDMS et scellez l’ensemble en faisant fondre le film à 100 degrés Celsius pendant une minute rapide.

Une fois chauffé, appuyez doucement sur la glissière du couvercle et scellez-le avec Valap. Ensuite, préparez une tasse PDMS pour l’imagerie à long terme. Percez un trou de quatre millimètres de diamètre dans une tranche de PDMS de trois millimètres d’épaisseur.

Ensuite, traitez la tranche de PDMS et un verre de couverture recouvert de PDMS. Une fois traités, placez-les les uns sur les autres et faites cuire l’ensemble toute la nuit à 100 degrés Celsius. Surveiller la formation de gouttelettes à l’aide d’un microscope à fond clair inversé.

Connectez la phase huile-lipidique au régulateur de pression et augmentez la pression jusqu’à ce qu’une goutte d’huile sorte du tube de pointe. Connectez le tube de pointe à l’entrée deux de la puce microfluidique. Ensuite, remplissez complètement les puces microfluidiques avec la phase huileuse lipidique à partir de l’entrée deux.

Ensuite, introduisez la phase aqueuse basée sur MRB-80 à partir de la première entrée. Contrôlez la taille des gouttelettes en modifiant les pressions de la phase huileuse lipidique et de la phase aqueuse pour créer des gouttelettes d’un diamètre d’environ 15 microns. Environ 800 millibars pour la phase huileuse lipidique, et 200 millibars pour la phase aqueuse, est un bon point de départ.

Après avoir obtenu la taille de gouttelettes souhaitée, remplissez complètement la cellule d’écoulement avec des gouttelettes. Ces gouttelettes sont formées à l’aide de petits volumes de phase aqueuse. Cela signifie que la configuration microfluidique doit fonctionner rapidement afin de ne pas perdre toute la phase aqueuse avant que des gouttelettes de la bonne taille ne se soient formées.

Une fois rempli, fermez soigneusement les extrémités de la cellule d’écoulement à l’aide de Valap. Si les gouttelettes ne s’arrêtent pas de bouger, c’est que l’étanchéité n’est pas complète ou que des bulles d’air ont peut-être été introduites. Pour une imagerie à long terme, transférez les gouttelettes dans une tasse PDMS et recouvrez d’une couche de mélange huile-lipides.

Décongelez les centrosomes à température ambiante et placez-les à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes pour assurer une bonne nucléation des microtubules. Pendant ce temps, préparez le mélange de dosage sur de la glace. Cela devrait contenir de la tubuline, du GTP, un système de piégeage de l’oxygène, des générateurs de force moléculaire tels que des réticulants de microtubules, de l’ATP et un système de régénération de l’ATP.

Une fois mélangé, faites tourner l’échantillon dans le rotor Airfuge refroidi à 30 psi pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez les centrosomes préchauffés au mélange. Optimisez la quantité de centrosomes ajoutés pour obtenir un ou deux centrosomes par gouttelette.

Ensuite, utilisez ce mélange pour produire des gouttelettes d’émulsion comme décrit précédemment. Afin de recruter la dynéine dans les lipides biotinylés au niveau du cortex des gouttelettes, incluez la GFP-dynéine TMR et la streptavidine dans la phase aqueuse. Sur un microscope confocal à disque rotatif, visualisez la croissance des microtubules après 30 minutes à 26 degrés Celsius.

Pendant l’imagerie, la croissance des microtubules peut être favorisée en augmentant la température à 28 ou même 30 degrés Celsius. Pour les projections Z, prenez des piles avec des intervalles d’un micron, ce qui devrait nécessiter environ 20 images par gouttelette. Allez dans le panneau principal de l’appareil photo, cliquez sur Modifier Z et réglez Z Step sur 1.0.

Cliquez sur Suivant pour enregistrer les paramètres. Ensuite, réglez le gain EM linéaire maximum en cliquant sur l’onglet Appareil photo dans le panneau d’acquisition et en faisant glisser la barre de gain EM sur 300. Ensuite, réglez le temps d’exposition sur 200 millisecondes dans le même onglet.

Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les paramètres. Pour les expériences d’imagerie en direct, effectuez des projections Z toutes les deux minutes pendant deux heures en réduisant les temps d’exposition à environ 100 millisecondes et en augmentant les intervalles Z à deux microns. Pour les expériences d’imagerie en direct, utilisez une coupelle PDMS au lieu d’une cellule d’écoulement normale pour une immobilisation maximale de l’échantillon.

À l’aide des protocoles décrits, la formation de l’aster a été étudiée dans des gouttelettes d’émulsion d’eau et d’huile contenant des centrosomes. Initialement, les centrosomes diffusent librement à l’intérieur des volumes confinés. Après environ 20 à 30 minutes, les premiers microtubules deviennent visibles et la diffusion des centrosomes devient restreinte à mesure que les microtubules se développent contre le cortex dans toutes les directions.

Lorsque les microtubules dépassent la moitié du diamètre de la gouttelette, les centrosomes sont poussés vers des limites opposées, les microtubules se développant le long du cortex des gouttelettes. Sans streptavidine, la dyméine est diffuse dans la gouttelette. Cependant, avec la streptavidine, dans les 10 minutes environ suivant la formation des gouttelettes, la dynéine est liée aux lipides biotinylés.

Lorsque l’on observe une tubuline fluorescente en présence de dynéine corticale, il est clair que les centrosomes sont positionnés au centre. Alors qu’en l’absence de dynéine, les centrosomes sont poussés vers les côtés opposés de la gouttelette. Cela est probablement dû à la dynéine favorisant les catastrophes des microtubules et aux forces de traction corticales, ce qui entraîne le centrage des asters.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les technologies microfluidiques pour créer des structures en forme de fuseau dans des gouttelettes d’émulsion sphériques. Une fois maîtrisées, la formation et l’imagerie des gouttelettes peuvent être effectuées en deux à trois heures lorsqu’elles sont effectuées correctement. En utilisant cette procédure, d’autres facteurs d’assemblage du fuseau peuvent être encapsulés afin d’étudier leur effet sur la morphologie et le positionnement du fuseau.

Des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l’utilisation de chloroforme ou de PDMS.