Name: Reconstitution de base mitotique Spindles dans Spherical Droplets Emulsion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez la reconstitution de fuseaux mitotiques dans des gouttelettes d'émulsion sphériques pour étudier l'assemblage cellulaire. Cette méthode microfluidique permet d'analyser la dynamique des microtubules et le positionnement des centrosomes en confinement géométrique.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Dogterom pour les précieuses discussions. Nous remercions Stefan Diez et Marcel Janson pour leurs réactifs, ainsi que Samara Reck-Peterson pour leur aide dans la purification de la dynéine. Ces travaux ont été soutenus par un financement du Conseil européen de la recherche (ERC Synergy grant : MODEL-CELL).

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<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les méthodes décrites ici présents récents efforts pour reconstituer les broches mitotiques de base dans des gouttelettes d&#39;eau dans l&#39;huile émulsion. Etudier ensemble de broche dans les limites géométriques offre de nombreux avantages. des mécanismes de rétroaction importantes existent entre les microtubules du fuseau mitotique et les contraintes géométriques dans lesquelles ils sont assemblés. Les microtubules peuvent générer des forces de poussée quand ils grandissent dans les limites géométriques, ce qui peut entraîner le déplacement du fuseau mitotique. En outre, de plus en plus dans une barrière physique peut provoquer des catastrophes des microtubules. En outre, l&#39; assemblage de la broche dans une géométrie confinée peut conduire à un épuisement progressif des composants individuels, comme la tubuline, ce qui se répercute directement sur ​​le taux de croissance des 36 microtubules. Ce sont tous des facteurs essentiels de l&#39;ensemble de broche, qui peuvent être étudiés en utilisant les dosages décrits ici. Les essais décrits sont très sensibles à de petites différe de concentrationrences des composants de gouttelettes. Tel est le cas pour la tubuline, dans lequel les différences de concentrations mineures peuvent se traduire soit par une croissance des microtubules trop lent ou trop rapide. Dans ce cas, les taux de croissance microtubules peuvent souvent encore être corrigées en ajustant la température au cours de la ~ 30 premières minutes de l&#39;expérience. l&#39;assemblage du fuseau mitotique et le positionnement est également très sensible aux variations de la concentration de générateurs (corticale) de force. Ceci est susceptible de dépendre de la concentration, de la pureté et l&#39;activité des composants purifiés et ils doivent être titrés avec soin pour chaque nouvelle protéine purifiée. En outre, certains des compromis doivent être faits dans les paramètres d&#39;imagerie, selon la nature de l&#39;essai. Dans un premier temps, des niveaux élevés d&#39;solubles dimères de tubuline fluorescentes rendent difficiles à imager microtubules individuels. Microtubules de tubuline et rallongent soluble est lentement consumée, le rapport signal à bruit devient progressivement plus élevée et permet l&#39;imagerie de Individumicrotubules al. Contrairement aux configurations avec des systèmes ouverts, le confinement géométrique empêche l&#39;échange des molécules fluorescentes et les composants du système d&#39;absorbeur d&#39;oxygène à l&#39;intérieur d&#39;un réservoir en vrac, ce qui entraîne le blanchiment significatif. En particulier pour la surveillance de l&#39;assemblage de la broche et le positionnement dans le temps, il est nécessaire d&#39;image avec des intensités lumineuses faibles, même en présence d&#39;un système de piège à oxygène actif. Ces méthodes permettent la reconstitution ascendante des structures de broche comme simplifiées in vitro. En plus des composants introduits ici, de nombreux autres facteurs ont été décrits pour influencer la formation bipolaire de la broche, le positionnement, l&#39; orientation, la mise en forme, etc. 3. Ce système peut être étendu pour étudier les effets individuels et combinés de générateurs de force supplémentaires. contributeurs importants à la formation du fuseau qui sont actuellement absents de ce système sont les chromosomes mitotiques. chromatine mitotique a été démontréformation de broche directe par (1) chromokinesins qui peut générer des soi-disant «forces polaire éjection» 3, (2) la formation d&#39;un gradient de RanGTP par la chromatine liée RanGEF RCC1 38, (3) kinétochores qui peut interagir avec (dépolymérisation microtubules) 39 et (4) la chromatine lui - même, qui peut fonctionner comme un ressort mécanique entre les microtubules opposées 40. Enfin, le système décrit fournit actuellement le contrôle spatial et temporel limité sur l&#39;activité et la localisation des forces génératrices introduites. Dans les cellules, de nombreux facteurs d&#39;assemblage broche localisent à des compartiments spécifiques ou sont actifs dans une fenêtre de temps limitée. Un exemple frappant est l&#39;activité de la dynéine, qui est spécifiquement enrichi au niveau du côté postérieur du C. elegans , une cellule d&#39; embryon de stade pour favoriser le positionnement de la broche asymétrique et la division cellulaire. Dans ce système, nous étudions actuellement la possibilité d&#39;imiter telle tméthodes d&#39;activité utilisant emporal et asymétriques empruntés à des techniques opto-génétiques. En outre, comme est le cas pour le C. elegans embryon et les cellules avec une paroi cellulaire rigide, de nombreuses cellules ne complètent dans la mitose. La forme du confinement géométrique aura un impact fondamental sur les forces agissant sur ​​la broche 41. Il sera donc important de reconstituer l&#39; assemblage de la broche et le positionnement dans des gouttelettes non-sphériques ainsi, potentiellement en utilisant des systèmes microfluidiques plus complexes qui permettent de façonner et de stockage de l&#39; émulsion gouttelettes 42,43. Enfin, dans les tissus, cellule-cellule et la signalisation cellulaire substrat et d&#39;attachement fournissent des indices externes qui peuvent être traduits en orientation de la broche dirigée, comme il est souvent observé dans les cellules épithéliales et les cellules souches. Tous ces aspects spécialisés ont pas été prises en compte dans cette étude et pourrait fournir des défis à venir pour construire vers plus in vivo -comme reconstitutions de assemb du fuseau mitotiquement et de positionnement.

Au cours de la mitose, les chromosomes du génome répliqué sont organisées à l&#39;équateur de la cellule pour assurer une répartition égale des chromatides sœurs dans les cellules filles nouvellement formées. le positionnement du Chromosome et de la ségrégation est médiée par leur attachement aux microtubules broche provenant de deux centrosomes opposées. En plus d&#39;assurer la distribution des chromosomes fidèles, l&#39;orientation du fuseau mitotique dicte également le plan de division cellulaire 1. Orientation coordonnée de la division cellulaire est essentielle pendant de nombreuses étapes de développement et pour les tissus homéostasie 2. Plus précisément, le positionnement du fuseau mitotique régulée peut entraîner la distribution asymétrique des contenus cellulaires ou même de produire des cellules filles de tailles différentes 2. L&#39; assemblage du fuseau mitotique et l&#39; orientation commence en prophase et est orchestré par une interaction complexe entre coopération et antagoniser forces génératrices 3,4. Les forces engendrées sont constituées de btraction et de poussée des forces OTH. Ces forces proviennent à la fois de la broche de contacts avec le cortex cellulaire, ainsi que de l&#39; intérieur de la broche, et peuvent être générés par la dynamique des microtubules, ainsi que par des moteurs moléculaires et les agents de réticulation (figure 1). les forces de poussée peuvent être générés lorsque les microtubules poussent contre des structures rigides telles que le cortex cellulaire. En fonction de la force de résistance totale générée au sein du système, ce qui peut entraîner un repositionnement du fuseau mitotique (forces faibles) ou de déclencher le flambage des microtubules ou d&#39;une catastrophe (forces élevées) 8/5. La quantité de force qui peut être produite en poussant dépend de la longueur des microtubules, étant donné que la longueur est un facteur déterminant de microtubules flambage 9. En outre, les microtubules qui proviennent d&#39;une centrosome peut pousser contre l&#39;autre centrosome, un mécanisme a été proposé pour entraîner la séparation des centrosomes dans la prophase précoce 3,10. En additionà condition de pousser les forces générées par les microtubules croissantes, microtubules extrémités en contact avec le cortex cellulaire peut également servir de médiateur des forces de traction 11. Des études provenant de plusieurs laboratoires ont montré que l&#39;activité contrôlée des générateurs de force corticaux est nécessaire pour le positionnement asymétrique des fuseaux mitotiques 1 in vivo. Essentiel à ces forces de traction est dynein cortex localisé cytoplasmique (ci - après dénommé «dynein»), un moins-end microtubules dirigé protéine moteur 8,12,13. Par exemple, dans une levure bourgeonnante, les interactions latérales de la dynéine corticale avec le résultat du réseau de microtubules dans le moteur dépendant microtubules coulissant le long du cortex 14. Cependant, les forces de traction corticales peuvent également être générés par la capacité de la dynéine pour former des attaches d&#39;extrémité sur la dépolymérisation des microtubules à 8. L&#39;énergie générée par microtubules retrait peut conduire à des forces qui sont généralement un ordre de grandeur plus élevé (~ 50 pN (référence 15 </sup&gt;)) que les forces générées par les protéines motrices individuelles (7-8 ~ pn (réf. 16)). Fixation de fin sur des dynein corticale aux microtubules dépolymérisation favorise le positionnement de la broche dans la levure bourgeonnante 17 et C. 13 elegans. Que ce soit à la fois dépolymérisation du moteur dépendant de glissement et microtubules entraîné des forces de traction corticales peuvent coopérer ou sont mutuellement exclusifs in vivo est actuellement inconnue. En plus de microtubules forces de poussée et des forces de traction corticales dynéine médiée, le positionnement centrosome est contrôlé à l&#39;intérieur du fuseau mitotique par de nombreuses autres protéines. Kinésine 5 moteurs, par exemple, existent sous forme de tétramères qui peuvent réticuler microtubules antiparallèles interpolaires, ce qui entraîne la génération de forces de glissement vers l&#39; extérieur 18-20. Les membres de la famille du moteur kinésine 5 sont nécessaires pour la séparation des centrosomes et l&#39; assemblage du fuseau bipolaire dans tous les eucaryotes étudiés, à l&#39;exception de C. elegans<html> (revue en référence 21). En outre, des agents de réticulation diffusible de la famille / PRC1 ASE1 sont également connus pour localiser les régions de chevauchement des microtubules interpolaires de microtubules in vivo et in vitro 22-27. Les forces générées par l&#39; expansion ASE1-entraînée de la microtubules zone de chevauchement sont assez grandes pour contrebalancer kinésine-14 forces de glissement médiées in vitro 28,29. Dans les cellules, ASE1 / PRC1 est nécessaire pour la formation stable de chevauchement des régions de microtubules dans le milieu du fuseau 25-27,30, ce qui suggère que les forces générées par des agents de réticulation diffusibles peuvent contribuer de manière significative à l&#39; organisation broche. Enfin, les forces de la chromatine mitotique et cinétochores influencent l&#39; assemblage du fuseau mitotique et de positionnement par différentes voies 3. Etant donné que ces éléments ne font pas partie des essais de reconstitution décrits ici, ils ne seront pas décrits en détail. jove_content &quot;&gt; Différentes théories existent sur ​​la façon dont les différents composants moléculaires et les forces décrites ci - dessus coopèrent dans l&#39; assemblage de broche et de positionnement, mais nous sommes encore loin d&#39;une compréhension quantitative. En plus des expériences dans les cellules vivantes, des expériences in vitro avec des composants purifiés fournissent un puissant route pour aider à atteindre cet objectif. nous présentons ici un guide visuel pour une version adaptée et étendue des méthodes publiées récemment (Roth et al. 31), dans lequel les broches de base sont reconstituées dans des gouttelettes d&#39; eau dans l&#39;huile en émulsion, en commençant par nombre minimal de composants. en utilisant des techniques microfluidiques, des gouttelettes sphériques sont générés avec des tailles qui sont comparables à des cellules mitotiques. au sein de ces gouttelettes, centrosomes purifiées et tubuline peuvent être combinés afin d&#39;étudier la dynamique de l&#39;aster des microtubules, la force des interactions de production et de aster-aster. par l&#39;introduction corticales (comme dynein) et inter-polaires (tels que kinésine-5 / ASE1) force de générateurs, nousreconstituer les structures de broche comme de plus en plus complexes qui commencent à ressembler à la situation in vivo.

<table><tbody><tr><td><fort>1. Préparation de puces microfluidiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Photomask sur substrat de film)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (plaquette de silicium de 4 pouces p/Boron < 1-0-0>10-20 &Omega ;-cm, 500-550 &mu ; m, SSP, avec 2 plats)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Coucheuse par centrifugation&nbsp ;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pré-polymère RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Traitement corona</td><td>Produits électrotechniques</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. Configuration microfluidique </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-( biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td></td><td></td><td></td>en verre</tr><tr><td>Tubes en verre Pompe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>à vide</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Chambre à vide</td><td>Kartell</td><td>Polypropylène Dessiccateur</td><td></td></tr><tr><td>sous vide Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Tensioactif (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de</td><td></td><td></td> recouvrement <td>24 mm x 60 mm, épaisseur 1,5</td></tr><tr><td>Lames de</td><td></td><td></td> verre <td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Perforateur</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Etanchéité de laboratoire film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (vaseline, lanoline, cire de paraffine fondues à concentrations égales)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fond clair</td> fait maison <td>Leica</td><td>PMIRB&nbsp ;</td><td>N’importe quel fond clair inversé suffirait</td></tr><tr><td>Régulateur de pression</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tube PEEK</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacons microfluidiques (Tubes Micrew 0,5 ml et 1 ml)</td><td>VWR, Pays-Bas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. Reconstitution de la formation et du positionnement de la broche </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10 000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxydase (Glucose oxydase d’Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-dithioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase forme foie bovin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline (tubuline du cerveau bovin)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubuline-488/561 (tubuline marquée à la rhodamine HiLyte-488/Rhodamine provenant de cerveau porcin)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (guanosine-'5-triphosphate, hydrate de sel de sodium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa ;-caséine (&kappa ;-caséine de lait sérique de bovin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (ultracentrifugeuse à air)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><<tr><td>strong>4. Présentation des facteurs d’assemblage de la broche </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (adénosine-'5-triphosphate, hydrate de sel disodique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Acide phospho(énol)pyruvique sel monosodique hydraté &ge ; 97 % (enzymatique))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(enzymes pyruvate kinase/lactique déshydrogénase du muscle de lapin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution de base mitotique spindles dans spherical droplets emulsion

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

L’assemblage, le positionnement et l’orientation du fuseau mitotique dépendent des forces combinées générées par la dynamique des microtubules, les protéines motrices des microtubules et les réticulants. La croissance des microtubules peut générer des forces de poussée, tandis que la dépolymérisation des microtubules peut convertir l’énergie du retrait des microtubules en forces de traction, lorsqu’ils sont attachés, par exemple, à la dynéine corticale ou aux chromosomes. De plus, les protéines motrices et les réticulants diffusibles à l’intérieur du fuseau contribuent à l’architecture du fuseau en connectant et en glissant des microtubules anti-parallèles. In vivo, il s’est avéré difficile de démêler la contribution relative des acteurs individuels à l’équilibre global des forces. Nous présentons ici les méthodes que nous avons récemment développées dans le cadre de nos efforts pour reconstituer des fuseaux mitotiques basiques de bas en haut in vitro. À l’aide de techniques microfluidiques, les centrosomes et la tubuline sont encapsulés dans des gouttelettes d’émulsion eau dans l’huile, conduisant à la formation d’asters de microtubules géométriquement confinés (doubles). En introduisant en outre de la dynéine à ancrage cortical, des moteurs de microtubules dirigés vers l’extrémité supérieure et des réticulants diffusibles, ce système est utilisé pour reconstituer des structures en forme de fuseau. Les méthodes présentées ici fournissent un point de départ pour la reconstitution de fuseaux mitotiques plus complets, permettant une étude détaillée de la contribution de chaque composant individuel, et pour obtenir une vue quantitative intégrée de l’équilibre des forces à l’intérieur du fuseau mitotique.

Les méthodes présentées dans les sections précédentes permettent la reconstitution des structures de broche comme avec l&#39;augmentation de la complexité en utilisant le confinement géométrique des gouttelettes d&#39;eau dans l&#39;huile émulsion. Cette section décrit les résultats représentatifs qui illustrent qualitativement la capacité de ces essais. Au cours de la mitose, lorsque la broche bipolaire est assemblé, les cellules complètent pour former des sphères d&#39;un diamètre d&#39;environ 15 um, telle que mesurée pour les cellules humaines. Cette forme caractéristique de la cellule mitotique fournit une limite géométrique que les deux restreint et dirige la taille et de l&#39; orientation 35,36 broche. Techniques microfluidiques, offrent un niveau de confinement géométrique qui ressemble exactement la situation observée dans les cellules vivantes et donc permet la reconstruction de bas en haut des fuseaux mitotiques in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; asters microtubules sont par eux-mêmes déjà capables de comportements complexes lorsque la croissance des microtubules est restreinte par les limites géométriques. Microtubules croissent, des forces de poussée générées par l&#39;incorporation de nouveaux dimères de tubuline entraînent les deux centrosomes à côtés des gouttelettes d&#39;émulsion opposées. Dans un premier temps , les centrosomes diffusent librement dans le volume confiné (Figure 4a, panneau de gauche). Après environ 20-30 minutes, les premiers microtubules deviennent visibles et la diffusion centrosome devient restreint comme microtubules poussent contre le cortex dans toutes les directions. Asters avec microtubules de longueur intermédiaire (environ 50% du diamètre des gouttelettes) peuvent (stérique) se repousser une autre, avec les microtubules qui poussent les uns contre les autres, les autres centrosome et le cortex. Il en résulte un arrangement de broche comme «bipolaire» typique avec les deux centrosomes opposées l&#39; une à l&#39; autre (figure 4a, panneau du milieu). Quand les microtubules croissent plus longue que ~ 50% des gouttelettes de diamètremètres, centrosomes sont poussés plus loin aux limites opposées de la goutte, avec les microtubules qui poussent le long du cortex de gouttelettes (figure 4a, à droite). Il est important de noter que les taux de croissance des microtubules dans ces essais sont très sensibles à la température et la tubuline-concentrations. Ces paramètres seront donc affecter fortement le moment où la nucléation est d&#39;abord observé et lorsque les positions de l&#39;aster l&#39;état d&#39;équilibre sont atteintes. Dans les cellules, les forces de traction corticales sont générées par la formation d&#39;attaches de support de charge entre les microtubules ainsi que les fins et dynéine cortex associée. Dans les cellules animales, cette association dépend du complexe Gai / CGL / NUMA qui est ciblé sur la membrane plasmique par l&#39; intermédiaire d&#39;une myristoylation N-terminale de 1 Gai. Dans ces essais de reconstitution, l&#39;exigence du complexe Gai / CGL / NuMA est contournée par couplage direct dynéine aux lipides biotinylés par laformation de complexes biotine-streptavidine-biotine. Ces liaisons sont relativement stables (Kd ~ 10 -14 M) 37 et forment rapidement (habituellement dans les 10 minutes après la formation de gouttelettes d&#39; émulsion, avant la nucléation des microtubules devient apparent) (figure 4b). En présence d&#39;dynéine cortical centrosomes conservent généralement une position plus centrale, alors qu&#39;en l&#39;absence de la dynéine, centrosomes sont poussés vers les côtés opposés du cortex de gouttelettes (figure 4c). Nous raisonnons ceci est le résultat de deux effets, prévenir et contrecarrer les forces de microtubules pousser. (1) Dynein favorise directement les catastrophes de microtubules, limitant ainsi la longueur des microtubules et la prévention excessive microtubules flambage, et (2) des forces de traction corticales conduire à des forces de centrage nettes sur les asters individuelles 8, qui neutralisent les forces de répulsion aster-aster. L&#39;agent de réticulation diffusible ASE1 induit forces qui ont tendance à augmenter la zone de chevauchement des microtubules antiparallèles 29. Conformément à cela, en présence d&#39;ASE1 (et en l&#39; absence de la dynéine) centrosomes se trouvent proches les uns des ASE1 localisant à empaqueté microtubules interpolaires (figure 4d). Les membres de la famille kinésine-5 voiture séparation centrosome en fournissant des forces qui poussent à partir de la broche (voir introduction). En présence d&#39;cut7 (S. pombe kinésine-5 orthologue) centrosomes sont poussés vers les côtés opposés des gouttelettes d&#39;émulsion, même en présence d&#39;ASE1 (figure 4E). En combinant des générateurs de force corticale et inter-polaires, le niveau de complexité peut encore être augmentée dans ces expériences, pour aboutir finalement à une compréhension globale de l&#39;ensemble de fuseau mitotique bipolaire. Une description quantitative détaillée de ces résultats seront disponibles à l&#39;avenir (Roth et al., Manuscrit en préparation). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; En plus d&#39;observer la position des centrosomes à des moments fixes dans le temps, et concernant leur comportement aux longueurs observées des microtubules, des informations précieuses peuvent être obtenues en suivant le processus de positionnement sur temps. En réduisant les temps d&#39;exposition et de l&#39;intensité du laser, il est maintenant possible de suivre le positionnement de l&#39;aster à intervalles de 2 min pendant au moins 1 h avec seulement ~ 30% de blanchiment. Ceci permet la surveillance de l&#39; ensemble de l&#39; aster et le positionnement de centrosomes diffusant librement (0 min.) Par l&#39; intermédiaire centralisé (12 min.) À asters décentralisées (36 min et plus) (Figure 5c). Cela facilite l&#39;étude des deux comportements à l&#39;état d&#39;équilibre et de la cinétique d&#39;assemblage broche. En combinant des gouttelettes avec des contenus différents dans le même échantillon, il est, par exemple, possible de comparer directement le positionnement et l&#39; assemblage de broche cinétique centrosome dans des gouttelettes avec et sans générateurs de force corticale (figure 5b). Figure 1: Les forces agissant sur ​​la broche mitotique Plusieurs molécules de génération de force agissent sur ​​les microtubules du fuseau mitotique pour favoriser la formation de la broche et de positionnement.. Les microtubules qui poussent dans le cortex cellulaire génèrent une force de poussée sur le centrosome. dynein corticale (violet) capture microtubules dépolymérisation et génère une force de traction sur les centrosomes. Dans l&#39;axe, kinésine-5 protéines motrices / cut7 fournissent une force de glissement vers l&#39; extérieur sur les microtubules anti-parallèles, alors que les agents de réticulation de la famille PRC1 / ASE1 génèrent un opposant à l&#39; extérieur force de glissement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Figure 2:. Microfluidique Chip Design (A) Conception de photomasque 4 pouces contenant 4 puces microfluidiques. (B) Représentation détaillée d&#39;une seule puce. Puces contiennent un canal de sortie et de trois canaux d&#39;entrée suivie d&#39;un filtre à poussière. Entrée du canal 1 contient la phase aqueuse, le canal 2 du lipide / phase huileuse et le canal 3 peut être utilisé pour diluer les gouttelettes formées avec des lipides / phase huileuse supplémentaire. (C) de la représentation détaillée de la jonction où le lipide / phase huileuse (venant du haut et en bas) se réunit avec l&#39;eau-phase (venant de la gauche). A la jonction, des gouttelettes se forment et l&#39;écoulement vers le canal de sortie sur la droite. (D) de la représentation détaillée d&#39;un filtre à poussière avec 2 um canaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Figure 3:. Méthodologie de l&#39; eau dans huile Emulsion Droplet Formation (A) puce microfluidique et tubes microfluidique sur un microscope à champ clair. Les deux tubes d&#39;eau et à des lipides / phase huileuse sont connectées aux entrées de la puce 1 et 2 respectivement. (B) Restriction à la microfluidique puce où l&#39;eau et de lipides / pétrole phases se rencontrent. En changeant la pression, des gouttelettes de taille peut être contrôlée. (C) La conception des cellules flux PDMS revêtues. Après le chargement des gouttelettes dans le flux de cellules, les extrémités ouvertes sont fermées avec plus valap. (D) Schéma de la formation de gouttelettes. Gouttelettes sont utilisées pour encapsuler centrosomes, la tubuline et des composants supplémentaires nécessaires à la formation du fuseau mitotique. (E) Schéma de ciblage corticale-dynéine. Biotinylé (Bio) dynein est destiné aux lipides biotinylés par la streptavidine (GEST). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Figure 4:. Les résultats représentatifs de la broche-Reconstitutions avec la complexité croissante (A) des projections maximales d&#39;intensité des gouttelettes contenant deux centrosomes montrant des exemples de court, moyen, et long microtubules. Centrosomes et les microtubules sont visualisés par l&#39;addition de 10% HiLyte-488 marqué tubuline. Les barres d&#39;échelle = 10 pm. (B) La localisation de la GFP-biotine-dynein-TMR en l&#39;absence (-, à gauche) et en présence (+, droite) de streptavidine (GEST). (C) microtubules aster positionnement en l&#39;absence (-, à gauche) ou en présence (+, droite) de la corticale GFP-biotine-dynein-TMR. (D) microtubules aster (panneau de gauche, green) positionnement en présence d&#39;ASE1 (panneau du milieu, rouge). (E) microtubules aster (panneau de gauche, vert) positionnement en présence d&#39;ASE1 et cut7 (kinésine-5) (panneau du milieu, rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Figure 5: Imagerie Aster Positionnement Dynamique in vitro (liste a) Sous la conception d&#39;une tasse PDMS qui permet l&#39; imagerie des gouttelettes jusqu&#39;à plusieurs heures.. (B) Production, stockage et imagerie de gouttelettes (transmis) contenant des contenus différents, illustrés par l&#39; absence ( à gauche) l&#39; inclusion ( à droite) de dextran fluorescent (Alexa 647). (C) simples images planes d&#39;un 60 min time-lapse (intervalles de 2 min) prises à partir d&#39; un z-stack (2 pm distances) de l&#39; annonceroplet contenant un seul centrosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

L’assemblage et le positionnement du fuseau mitotique dépendent des forces combinées générées par la dynamique des microtubules, les protéines motrices et les réticulants. Nous présentons ici nos méthodes récemment développées dans lesquelles le confinement géométrique de gouttelettes d’émulsion sphériques est utilisé pour la reconstitution ascendante de fuseaux mitotiques basiques.

Reconstitution de base mitotique Spindles dans Spherical Droplets Emulsion

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

L'objectif général de cette procédure est de reconstituer des structures semblables au fuseau mitotique dans un confinement géométrique constitué de gouttelettes d'émulsion eau dans l'huile. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'assemblage du fuseau mitotique, telles que la manière dont les fuseaux sont positionnés et assemblés, et quelle est la contribution spécifique des composants individuels à ces processus. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'une approche ascendante (« bottom-up ») pour reconstituer des structures semblables à un fuseau dans un confinement géométrique qui imite la forme d'une cellule en mitose.Cette méthode peut également être utilisée pour étudier d'autres processus dépendant du confinement cellulaire. Mélanger 10 parties de prépolymère de PDMS avec une partie d'agent de réticulation, pour une masse totale d'environ 40 grammes. Ensuite, placer le mélange dans une chambre à vide pendant environ 30 minutes afin d'éliminer les bulles d'air.Pendant ce temps, enroulez du papier d'aluminium autour du moule pour former une cupule d'un centimètre de profondeur et de quatre pouces de diamètre. Une fois prêt, versez environ les 3/4 du mélange de PDMS dans le moule. Ensuite, remettez le PDMS dans une chambre à vide pendant encore 30 minutes.Après le dégazage, polymériser le PDMS pendant une heure à 100 degrés Celsius. Pendant ce temps, préparer quelques lames de verre pour le dépôt par centrifugation en les nettoyant avec de l'air comprimé. Ensuite, déposer par centrifugation le mélange de PDMS restant sur les lames.Incubez ces lames pendant une heure à 100 degrés Celsius pour durcir le PDMS. Ensuite, retirez délicatement le PDMS à l’aide d’une lame de rasoir et percez les trous nécessaires dans les bandes de PDMS afin de fabriquer des puces microfluidiques. Maintenant, traitez la puce microfluidique et une lame de verre recouverte de PDMS au corona pendant quelques secondes.Enfin, placer une puce microfluidique sur chaque lame de verre, les canaux orientés vers le bas, puis faire cuire les puces toute la nuit à 100 degrés Celsius. Premièrement, à l’aide de matériel en verre lavé au chloroforme, préparer environ 250 microgrammes de lipides dissous dans le chloroforme. Sécher soigneusement le mélange lipidique à l’aide d’un gaz inerte.Puis placez-le dans une chambre à vide pendant une heure. Ensuite, dissolvez les lipides dans de l'huile minérale et 2,5 % de tensioactif à 0,5 milligramme par millilitre, soit environ 500 microlitres. Pour dissoudre complètement les lipides, soumettez le mélange à une sonication pendant 30 minutes à 40 kilohertz.Ensuite, appliquez par centrifugation du PDMS sur des lamelles avec une épaisseur adaptée à l'objectif du microscope. Puis, appliquez par centrifugation du PDMS sur des lames de verre. Incubez maintenant les lamelles et lames de verre recouvertes de PDMS pendant une heure à 100 degrés Celsius.Ensuite, réalisez les cellules d'écoulement en disposant de manière rapprochée des tranches fines de film d'étanchéité de laboratoire sur les lames de verre revêtues de PDMS. Placez des bandes de trois millimètres espacées d'environ deux millimètres. Puis, recouvrez les cellules d'écoulement d'une lame couvre-objet revêtue de PDMS, et scellez l'ensemble en faisant fondre le film à 100 degrés Celsius pendant une minute environ.Une fois chauffé, appuyez doucement sur la lamelle et scellez-la avec du Valap. Préparez ensuite un récipient en PDMS pour l'imagerie à long terme. Percez un trou de quatre millimètres de diamètre dans une tranche de PDMS de trois millimètres d'épaisseur.Ensuite, soumettez la tranche de PDMS et une lame de verre recouverte de PDMS à un traitement au corona. Une fois le traitement effectué, placez-les l'une sur l'autre et faites cuire l'assemblage toute la nuit à 100 degrés Celsius. Surveillez la formation des gouttelettes au microscope inversé en champ clair.Reliez la phase huileuse lipidique au contrôleur de pression et augmentez la pression jusqu'à ce qu'une goutte d'huile sorte du tube capillaire. Connectez le tube capillaire à l'entrée deux de la puce microfluidique. Ensuite, remplissez complètement les puces microfluidiques avec la phase huileuse lipidique par l'entrée deux.Ensuite, introduisez la phase aqueuse à base de MRB-80 par l'entrée un. Contrôlez la taille des gouttelettes en ajustant les pressions de la phase huileuse lipidique et de la phase aqueuse afin de former des gouttelettes d'un diamètre d'environ 15 microns. Une pression d'environ 800 millibars pour la phase huileuse lipidique et de 200 millibars pour la phase aqueuse constitue un bon point de départ.Après avoir obtenu la taille de gouttelettes souhaitée, remplir complètement la cellule d'écoulement avec les gouttelettes. Celles-ci sont formées à l'aide de petits volumes de la phase aqueuse. Cela signifie que le dispositif microfluidique doit fonctionner rapidement afin de ne pas perdre toute la phase aqueuse avant la formation de gouttelettes de la taille correcte.Une fois rempli, fermer soigneusement les extrémités de la chambre d'écoulement à l'aide de Valap. Si les gouttelettes ne cessent pas de bouger, le scellement n'est pas complet ou des bulles d'air ont pu être introduites. Pour une observation à long terme, transférer les gouttelettes dans un récipient en PDMS et recouvrir d'une couche de mélange d'huile et de lipides.Décongeler les centrosomes à température ambiante, puis les placer à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes afin de garantir une nucléation correcte des microtubules. En attendant, préparer le mélange d'essai sur de la glace. Celui-ci doit contenir de la tubuline, du GTP, un système de piégeage de l'oxygène, des générateurs de force moléculaire tels que des réticulateurs de microtubules, de l'ATP et un système de régénération de l'ATP.Une fois le mélange effectué, centrifuger l'échantillon dans le rotor Airfuge refroidi à 30 psi pendant trois minutes. Ensuite, ajouter les centrosomes préalablement chauffés au mélange. Optimiser la quantité de centrosomes ajoutée afin d'obtenir un ou deux centrosomes par gouttelette.Ensuite, utilisez ce mélange pour produire des gouttelettes d'émulsion comme décrit précédemment. Afin de recruter la dynamine sur les lipides biotinylés au niveau du cortex des gouttelettes, ajoutez GFP-dynein TMR et la streptavidine à la phase aqueuse. Sur un microscope confocal à disque tournant, visualisez la croissance des microtubules après 30 minutes à 26 degrés Celsius.Pendant l'acquisition d'images, la croissance des microtubules peut être favorisée en augmentant la température à 28 ou même 30 degrés Celsius. Pour les projections Z, acquérez des séries d'images avec des intervalles d'un micron, ce qui devrait nécessiter environ 20 images par goutte. Allez au panneau principal de la caméra, cliquez sur Modifier Z, puis réglez le pas Z à 1,0.Cliquez sur Suivant pour enregistrer les paramètres. Ensuite, réglez le gain EM linéaire maximal en cliquant sur l'onglet Caméra dans le panneau d'acquisition, puis en faisant glisser la barre de gain EM jusqu'à 300. Réglez ensuite le temps d'exposition à 200 millisecondes dans le même onglet.Cliquez sur Enregistrer pour sauvegarder les paramètres. Pour les expériences d'imagerie en temps réel, effectuez des projections en Z toutes les deux minutes pendant deux heures en réduisant les temps d'exposition à environ 100 millisecondes et en augmentant les intervalles en Z à deux micromètres. Pour les expériences d'imagerie en temps réel, utilisez une cupule en PDMS plutôt qu'une cellule d'écoulement classique afin d'immobiliser au maximum l'échantillon.À l'aide des protocoles décrits, la formation des asters a été étudiée dans des gouttelettes d'émulsion eau-huile contenant des centrosomes. Initialement, les centrosomes diffusent librement au sein des volumes confinés. Après environ 20 à 30 minutes, les premiers microtubules deviennent visibles et la diffusion des centrosomes devient restreinte lorsque les microtubules poussent contre le cortex dans toutes les directions.Lorsque les microtubules s'allongent au-delà de la moitié du diamètre de la gouttelette, les centrosomes sont repoussés vers des bords opposés, les microtubules s'étendant alors le long du cortex de la gouttelette. En l'absence de streptavidine, la dynamine est diffuse à l'intérieur de la gouttelette. En revanche, en présence de streptavidine, environ 10 minutes après la formation de la gouttelette, la dynamine s'associe aux lipides biotinylés.Lorsqu'on observe la tubuline fluorescente en présence de la dynéine corticale, il est clair que les centrosomes sont positionnés au centre. En revanche, en l'absence de dynéine, les centrosomes sont repoussés vers des côtés opposés de la gouttelette. Cela est probablement dû au fait que la dynéine favorise les catastrophes des microtubules et les forces de traction corticales, ce qui entraîne le centrage des asters.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser les technologies microfluidiques pour créer des structures en forme de fuseau dans des gouttelettes sphériques d'émulsion. Une fois maîtrisées, la formation des gouttelettes et l'acquisition d'images peuvent être réalisées en deux à trois heures si elles sont correctement effectuées. Grâce à cette procédure, d'autres facteurs d'assemblage du fuseau peuvent être encapsulés afin d'étudier leur effet sur la morphologie et le positionnement du fuseau.Des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l'utilisation de chloroforme ou de PDMS.

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