Préparation de vésicules encapsulant géantes Microsphères par centrifugation d'une émulsion eau-dans-huile

Les vésicules géantes contenant des composants de taille micrométrique très compacts sont des modèles de cellules utiles. La méthode de centrifugation par émulsion eau dans huile est un outil simple et puissant pour la préparation de vésicules géantes avec des matériaux encapsulés.

L’objectif global de cette méthode de centrifugation par émulsion eau dans huile est de préparer facilement une vésicule géante en couche mince. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie synthétique, telles que la création d’une cellule artificielle basée sur une vésicule géante. Pour commencer cette procédure, préparez une solution mère de 25 millimolaires de DOPC et une solution mère de DHPE Texas Red à point zéro de deux millimolaires dans du chloroforme.

Ensuite, formez un film lipidique sur la surface intérieure d’un flacon en verre de cinq millilitres en évaporant un mélange de solutions mères DOPC et Texas Red DHPE sous l’azote gazeux en circulation. Après avoir incubé le film sous pression réduite pendant la nuit, ajoutez un millilitre de paraffine liquide dans le flacon. Enveloppez le flacon dans du papier d’aluminium et incubez le mélange à 80 degrés Celsius pendant la nuit.

Dans un mélange de microtubes à couvercle d’un point de cinq millilitres, 237 points cinq microlitres de microsphères non fluorescentes d’un micromètre et 12 virgule cinq microlitres de microsphères fluorescentes d’un micromètre. Ajoutez maintenant 64 milligrammes de saccharose suivis de 125 microlitres d’une solution tamponnée molaire de Tris et de 875 microlitres d’eau désionisée dans le microtube. Agitez le mélange pendant 30 secondes, puis soniquez pendant 10 minutes.

Après la préparation de 10 millilitres d’une solution tamponnée Tris, placez un millilitre dans un microtube à couvercle de cinq millilitres. Une fois que la solution a été vortexée et soniquée, mélangez un millilitre de solution d’huile avec 300 microlitres de solution aqueuse interne dans un microtube d’un virgule de cinq millilitres. Émulsionner les deux composants dans le microtube à l’aide d’un homogénéisateur mécanique fonctionnant à 10 000 tr/min pendant deux minutes à température ambiante.

Ensuite, superposez doucement 300 microlitres de l’émulsion eau dans l’huile sur la surface supérieure d’un millilitre de solution aqueuse externe à quatre degrés Celsius dans un microtube à couvercle de cinq millilitres. Immédiatement après avoir refroidi le microtube pendant 10 minutes, centrifugez le mélange à 18 000 fois G pendant 30 minutes. Une fois terminé, obtenez les vésicules géantes précipitées ou GV en perçant le fond du microtube avec une punaise et en recueillant une gouttelette dans un microtube stérilisé d’un point cinq millilitres.

Placez une chambre d’incubation d’adhésif pour la réaction en chaîne par polymérase NC deux et l’hybridation sur le dessus d’un verre de couverture de microscope. À l’aide d’une micropipette, déposez 25 microlitres de GV précipités dilués sur la zone de l’échantillon et placez immédiatement un verre de couverture de cinq millimètres d’épaisseur sur le dessus de la chambre d’incubation. Après avoir enregistré des images microscopiques des vésicules, effectuez une microscopie à fluorescence en insérant d’abord les miroirs de fluorescence UFBNA et UFMCHE dans le microscope.

Équipez ensuite les unités de filtres d’excitation et de filtres d’émission pour l’analyse. Le facteur déterminant le plus important du succès de la méthode de l’eau dans l’huile est que la densité de la solution aqueuse interne doit être supérieure à celle de la solution aqueuse externe, de sorte que les GV précipitent pendant la centrifugation. La microscopie à interférence différentielle et la microscopie à fluorescence des GV sans microsphères et avec des microsphères ont confirmé la formation de GV à faible lamelle.

Sur les 160 GV obtenus, 55 microsphères encapsulées et 105 étaient vides, ce qui donne un taux d’encapsulation de 34 %. La fraction volumique des microsphères dans les GV a été estimée à environ 11 plus ou moins trois pour cent en volume et la précision de la fraction volumique calculée était de 10 à 30 %L’encapsulation d’autres matériaux dans des GV DOPC à 100 % molaires en utilisant la même solution aqueuse externe et le même protocole a été couronnée de succès, comme l’ont montré la microscopie à interférence différentielle et la microscopie à fluorescence. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la cytométrie en flux peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’élucidation de la cellule modélisée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des vésicules géantes avec des matériaux encapsulés.