Préparation de vésicules encapsulant géantes Microsphères par centrifugation d'une émulsion eau-dans-huile
24 janvier 2017
Les vésicules géantes contenant des composants de taille micrométrique très compacts sont des modèles de cellules utiles. La méthode de centrifugation par émulsion eau dans huile est un outil simple et puissant pour la préparation de vésicules géantes avec des matériaux encapsulés.
L’objectif global de cette méthode de centrifugation par émulsion eau dans huile est de préparer facilement une vésicule géante en couche mince. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie synthétique, telles que la création d’une cellule artificielle basée sur une vésicule géante. Pour commencer cette procédure, préparez une solution mère de 25 millimolaires de DOPC et une solution mère de DHPE Texas Red à point zéro de deux millimolaires dans du chloroforme.
Ensuite, formez un film lipidique sur la surface intérieure d’un flacon en verre de cinq millilitres en évaporant un mélange de solutions mères DOPC et Texas Red DHPE sous l’azote gazeux en circulation. Après avoir incubé le film sous pression réduite pendant la nuit, ajoutez un millilitre de paraffine liquide dans le flacon. Enveloppez le flacon dans du papier d’aluminium et incubez le mélange à 80 degrés Celsius pendant la nuit.
Dans un mélange de microtubes à couvercle d’un point de cinq millilitres, 237 points cinq microlitres de microsphères non fluorescentes d’un micromètre et 12 virgule cinq microlitres de microsphères fluorescentes d’un micromètre. Ajoutez maintenant 64 milligrammes de saccharose suivis de 125 microlitres d’une solution tamponnée molaire de Tris et de 875 microlitres d’eau désionisée dans le microtube. Agitez le mélange pendant 30 secondes, puis soniquez pendant 10 minutes.
Après la préparation de 10 millilitres d’une solution tamponnée Tris, placez un millilitre dans un microtube à couvercle de cinq millilitres. Une fois que la solution a été vortexée et soniquée, mélangez un millilitre de solution d’huile avec 300 microlitres de solution aqueuse interne dans un microtube d’un virgule de cinq millilitres. Émulsionner les deux composants dans le microtube à l’aide d’un homogénéisateur mécanique fonctionnant à 10 000 tr/min pendant deux minutes à température ambiante.
Ensuite, superposez doucement 300 microlitres de l’émulsion eau dans l’huile sur la surface supérieure d’un millilitre de solution aqueuse externe à quatre degrés Celsius dans un microtube à couvercle de cinq millilitres. Immédiatement après avoir refroidi le microtube pendant 10 minutes, centrifugez le mélange à 18 000 fois G pendant 30 minutes. Une fois terminé, obtenez les vésicules géantes précipitées ou GV en perçant le fond du microtube avec une punaise et en recueillant une gouttelette dans un microtube stérilisé d’un point cinq millilitres.
Placez une chambre d’incubation d’adhésif pour la réaction en chaîne par polymérase NC deux et l’hybridation sur le dessus d’un verre de couverture de microscope. À l’aide d’une micropipette, déposez 25 microlitres de GV précipités dilués sur la zone de l’échantillon et placez immédiatement un verre de couverture de cinq millimètres d’épaisseur sur le dessus de la chambre d’incubation. Après avoir enregistré des images microscopiques des vésicules, effectuez une microscopie à fluorescence en insérant d’abord les miroirs de fluorescence UFBNA et UFMCHE dans le microscope.
Équipez ensuite les unités de filtres d’excitation et de filtres d’émission pour l’analyse. Le facteur déterminant le plus important du succès de la méthode de l’eau dans l’huile est que la densité de la solution aqueuse interne doit être supérieure à celle de la solution aqueuse externe, de sorte que les GV précipitent pendant la centrifugation. La microscopie à interférence différentielle et la microscopie à fluorescence des GV sans microsphères et avec des microsphères ont confirmé la formation de GV à faible lamelle.
Sur les 160 GV obtenus, 55 microsphères encapsulées et 105 étaient vides, ce qui donne un taux d’encapsulation de 34 %. La fraction volumique des microsphères dans les GV a été estimée à environ 11 plus ou moins trois pour cent en volume et la précision de la fraction volumique calculée était de 10 à 30 %L’encapsulation d’autres matériaux dans des GV DOPC à 100 % molaires en utilisant la même solution aqueuse externe et le même protocole a été couronnée de succès, comme l’ont montré la microscopie à interférence différentielle et la microscopie à fluorescence. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la cytométrie en flux peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’élucidation de la cellule modélisée.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des vésicules géantes avec des matériaux encapsulés.
Aperçu
Cet article traite de la préparation de vésicules géantes par une méthode de centrifugation d'émulsion eau-dans-huile. Ces vésicules constituent des modèles utiles pour la recherche en biologie synthétique, en particulier dans la création de cellules artificielles.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie synthétique
- Préparation de vésicules
- Modèles cellulaires
Contexte
- Les vésicules géantes peuvent encapsuler des matériaux, ce qui les rend précieuses pour la recherche.
- La méthode de l'émulsion eau-dans-huile simplifie le processus de préparation.
- Comprendre la formation des vésicules est essentiel pour faire progresser la biologie synthétique.
- L'efficacité d'encapsulation est une métrique clé pour évaluer la méthode.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode simple pour la préparation de vésicules géantes.
- Explorer le potentiel de ces vésicules dans des applications de biologie synthétique.
- Évaluer l'encapsulation de divers matériaux au sein des vésicules.
Méthodes utilisées
- Préparation de films lipidiques à partir de DOPC et de Texas Red DHPE.
- Formation d'émulsions eau-dans-huile par homogénéisation mécanique.
- Centrifugation pour isoler les vésicules géantes.
- Techniques de microscopie pour analyser les propriétés des vésicules.
Résultats principaux
- Formation réussie de vésicules géantes avec des taux d'encapsulation variables.
- 34 % des vésicules ont encapsulé des microsphères.
- La fraction volumique des microsphères est estimée à environ 11 %.
- Autres matériaux encapsulés avec succès en utilisant le même protocole.
Conclusions
- La méthode eau-dans-huile est efficace pour la préparation de vésicules géantes.
- L'efficacité d'encapsulation peut être optimisée pour diverses applications.
- Cette technique ouvre des perspectives pour des recherches ultérieures en biologie synthétique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'encapsulation efficace de microsphères dans des vésicules géantes (GVs) permet la construction de modèles de cellules artificielles, soutenant ainsi les premières étapes de la biologie synthétique et la découverte en biopharmacie. Cette méthode fournit une plateforme reproductible pour étudier le compartimentage, l'encombrement moléculaire et l'efficacité d'encapsulation, des paramètres critiques pour la fiabilité prédictive des systèmes mimant la cellule. L'approche est directement pertinente pour les pipelines de validation de cibles et de développement d'essais, où les modèles de cellules artificielles contribuent à l'analyse mécanistique et à la continuité translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Facilite l'assemblage ascendant de modèles de cellules artificielles pour la vérification d'hypothèses.
- Permet l'encapsulation de diverses biomolécules ou particules afin de reproduire des environnements cellulaires.
- Permet une détection mécanistique des risques en modélisant l'encombrement moléculaire et la compartimentation.
- Offre une plateforme pour la validation fonctionnelle de cibles dans des systèmes synthétiques.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des systèmes normalisés à base de vésicules pour des procédés de criblage en aval.
- Fournit des mesures quantitatives de l'encapsulation afin d'évaluer la reproductibilité des tests.
- Permet une production échelonnée de vésicules destinées à des applications de criblage à contenu élevé.
- Facilite une évaluation fiable des interactions de composés ou de biomolécules au sein de compartiments définis.
Recherche translationnelle et préclinique
- Reproduit des caractéristiques cellulaires pertinentes pour la maladie, telles que l'encombrement moléculaire et la compartimentation.
- Permet une concordance entre les systèmes cellulaires artificiels et les études translationnelles de biomarqueurs lors de l'encapsulation de molécules pertinentes.
- Assure une continuité entre la validation des modèles synthétiques et le développement d'essais précliniques.
- Réduit les risques liés aux découvertes précoces en permettant une manipulation contrôlée et quantitative du système.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode de centrifugation d'une émulsion eau dans huile s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et le développement de tests, permettant la génération de modèles cellulaires artificiels pour la recherche fondée sur des hypothèses et le criblage.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur la compartimentation et l'efficacité d'encapsulation dans des systèmes synthétiques.
- Tri : Fournit des préparations reproductibles et quantitatives de vésicules pour la standardisation des tests.
- Analytique : Permet la mesure des rapports d'encapsulation et des fractions volumiques en vue d'analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats obtenus sur des modèles synthétiques et la conception d'essais précliniques lors de l'encapsulation de molécules pertinentes pour les maladies.
- Réutilisation en milieu professionnel : Propose un protocole réutilisable, adaptable à divers agents d'encapsulation et compositions de vésicules.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive des tests in vitro basés sur des cellules artificielles et la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Permet une préparation standardisée et évolutible de vésicules avec des résultats quantifiables.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en réduisant l'ambiguïté mécanistique au stade précoce de la découverte.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des projets de biologie synthétique et de systèmes mimant les cellules.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chimie des lipides, en manipulation d'émulsions et en analyse microscopique.
- Suppose l'accès à des homogénéisateurs, des centrifugeuses et à une infrastructure de microscopie à fluorescence.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'encapsulation et d'analyse.
- Peut être adapté à différents agents encapsulants et tailles de vésicules moyennant une optimisation du protocole.
- L'efficacité d'encapsulation et la lamellarité des vésicules peuvent varier et nécessitent une validation empirique.
