Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

Ce protocole guidera ceux qui travaillent sur les protéines de liaison membranaire pour déterminer comment la forme de la membrane joue un rôle dans l’organisation des assemblages de protéines. Le principal avantage de cette technique est sa polyvalence pour le type de protéine, la composition de la membrane et la géométrie de la membrane. Il permet également d’interroger sur la façon dont une bicouche lipidique peut modifier les propriétés des protéines associées.

Pour identifier une bonne membrane pour l’expérience, nous suggérons d’établir une liste de contrôle qui pourrait inclure les taux de diffusion des lipides, la mobilité de la protéine d’intérêt et s’il existe des liposomes non éclatés ou des liposomes fusionnés collés à la surface. Pour commencer le nettoyage plasma des lames, purgez le nettoyant plasma pendant cinq minutes avec de l’oxygène pour éliminer l’air des conduites et de la chambre. Disposez les glissières de verre à couvercle sec dans un berceau en céramique.

Pendant la purge, faites couler un gaz inerte sur les lames de verre du micro-couvercle pour éliminer la poussière et les particules. Placez le berceau à l’arrière de la chambre à plasma de manière à ce que les lamelles de couverture soient parallèles au long bord de la chambre. Faites fonctionner le nettoyeur plasma pendant 15 minutes avec de l’oxygène à puissance maximale.

Pour la préparation de la chambre, coupez le bouchon juste en dessous de la partie givrée d’un tube PCR de 0,2 millilitre. Peignez le bord du tube PCR avec un adhésif activé par UV en évitant l’intérieur du tube. Placez délicatement la colle du tube PCR au centre d’une lamelle de couverture nettoyée au plasma, puis placez la chambre sous une lumière UV à grande longueur d’onde pendant cinq à sept minutes pour durcir l’adhésif.

Pour former une bicouche, ajoutez les réactifs au puits. Secouez doucement les chambres d’un côté à l’autre pour perturber les VUS, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, rincer la bicouche six fois avec 150 microlitres de SLBB par pipetage pour éliminer l’excès de lipides, puis laver la bicouche six fois avec 150 microlitres de tampon réactionnel avant d’incuber avec les septines.

Lors de la dernière étape de lavage, retirez le tampon de réaction, en laissant 75 microlitres dans le puits. Ajouter 25 microlitres de septines diluées dans du SSB et l’image par microscopie TIRF. Tout d’abord, vortex la bouteille contenant des microsphères de silice pendant 15 secondes, puis bain soniqué pendant une minute et vortex à nouveau pendant 15 secondes pour briser les amas.

Mélanger les billes avec SLBB et 10 microlitres de VUS à cinq millimolaires dans un tube microcentrifuge à faible adhérence. Incuber le mélange lipidique de billes pendant une heure à température ambiante sur un agitateur pour éviter la sédimentation. Pendant ce temps, décongelez une lamelle de couverture pégylée et collez-y un tube PCR coupé de 0,2 millilitre.

Après l’incubation, centrifuger les billes pendant 30 secondes au RCF désigné. Après le premier essorage, retirer 50 microlitres de surnageant, puis ajouter 200 microlitres de PRB et mélanger par pipetage vigoureux. Pour les prochains tours, retirez 200 microlitres de PRB et ajoutez 200 microlitres supplémentaires après le deuxième et le troisième spin et ajoutez 220 microlitres de PRB après le quatrième spin.

Si vous effectuez un essai de compétition avec plusieurs tailles de billes, préparez la réaction en mélangeant des volumes égaux de chaque taille de bille et en diluant 29 microlitres de ce mélange de billes avec 721 microlitres de tampon de réaction, puis ajoutez 75 microlitres de billes diluées et 25 microlitres de protéine diluée dans du BSR dans les puits et mélangez. Si vous mesurez des septines à l’état d’équilibre, incuber le mélange à température ambiante pendant une heure, puis imager par microscopie confocale ou près de la FRBR. Les micrographies TIRF de SLB planaires incubés avec des septines montrées en vert ont montré une distribution homogène des protéines.

Les SLB fabriqués avec des lamelles de verre mal nettoyées présentaient des trous ou des trous dans la bicouche dans les régions de faible septine. Les liposomes non éclatés et tubulés peuvent s’accumuler à la surface si de vieux liposomes sont utilisés ou si les lavages ne sont pas stricts. Dans les micrographies de microsphères recouvertes de lipides, visualisées à l’aide de rhodamine PE a montré un dépôt bicouche lisse.

Les supports sphériques étaient uniformément recouverts par la membrane et il y avait peu de grappes de perles. Un lavage insuffisant de l’excès de lipides a entraîné un revêtement membranaire inégal observé par des amas lipidiques et une mauvaise manipulation a causé des lacunes dans la bicouche. Un mélange insuffisant des billes a provoqué une agglutination, ce qui n’est pas idéal pour mesurer l’absorption totale des protéines.

En utilisant les bicouches lipidiques prises en charge présentées ici, d’autres méthodes telles que la microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence, la cytométrie de masse des membranes et la microscopie à force atomique à grande vitesse peuvent être effectuées pour examiner différentes dynamiques protéine-protéine ou protéine-membrane.