La mise en œuvre d'un système d'infection à base Insertion Perméable Membrane pour étudier les effets de sécrétées bactériennes Toxines sur des cellules hôtes mammaliennes

L'objectif général de ce système d'infection basé sur des inserts à membrane perméable est d'étudier les effets des toxines bactériennes sécrétées sur les cellules hôtes durant l'infection. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions hôte-pathogène, telles que la manière dont des composants bactériens spécifiques sécrétés contribuent aux réponses des cellules hôtes durant une infection bactérienne. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'étudier les composants bactériens sécrétés et modélise plus fidèlement un environnement hôte-pathogène physiologiquement pertinent dans le contexte d'une infection humaine.

La procédure sera démontrée par Rebecca Flaherty, étudiante diplômée senior de mon laboratoire. Pour préparer des souches isogéniques de streptocoque du groupe A de type sauvage, ou GAS, et des souches mutantes GAS M1T1 5448, démarrez des cultures liquides nocturnes en inoculant cinq à dix millilitres de bouillon Todd Hewitt et en incubant à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Centrifugez les cultures bactériennes nocturnes et utilisez le volume initial de milieu bactérien frais pour resuspendre le culot.

Ensuite, normalisez les cultures bactériennes à des concentrations initiales égales en diluant les cultures re-suspendues dans du milieu supplémentaire afin d'obtenir la même DO600. Pour recueillir les lysats destinés à l'analyse de la signalisation et aux dosages de détermination de l'ATP, semez les cellules HaCaT dans des boîtes de six puits à une densité d'ensemencement d'environ trois fois 10 à la puissance cinq cellules par puits, et cultivez-les jusqu'à une confluence de 90 %. Pour réaliser les dosages de perméabilisation membranaire par l'éthidium homodimère et de libération de la lactate déshydrogénase, semez les cellules HaCaT dans des plaques de 24 puits à une densité d'ensemencement d'environ cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par puits, et laissez-les croître jusqu'à une confluence de 90 %.

Juste avant le traitement, laver les cellules avec du PBS 1x. Ensuite, ajouter deux millilitres de milieu de croissance frais avec ou sans traitement pharmacologique dans les plaques à six puits, ou 0,5 millilitre de milieu dans les puits des plaques à 24 puits. Puis, sous une hotte à flux laminaire, utiliser des pinces stériles pour placer soigneusement un insert stérile à membrane perméable de 0,4 micron dans chaque puits.

Une manipulation douce et stérile des inserts perméables lors de la préparation de l'infection est essentielle pour éviter que la membrane ne soit endommagée ou contaminée durant ce processus. Ajoutez du milieu frais de culture cellulaire dans la chambre supérieure de chaque puits conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, appliquez un volume approprié des cultures bactériennes normalisées dans la chambre supérieure du système d'insert à membrane perméable, et ajoutez du milieu bactérien dans les puits témoins.

L'ajout soigneux des bactéries dans la chambre supérieure, ainsi que le transport délicat des cellules infectées vers l'incubateur, sont essentiels, car il est crucial que les bactéries n'entraînent pas de contamination de la chambre inférieure pendant la mise en place de l'expérience. Pour évaluer les protéines de l'hôte sécrétées, utilisez des pinces stériles pour retirer soigneusement l'insert à membrane perméable. Ensuite, sans perturber la monocouche de cellules, récupérez le milieu de la chambre inférieure dans des tubes de 1,5 millilitre.

Centrifuger les échantillons à 14 000 RCF et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes afin de faire précipiter les débris cellulaires. Ensuite, éliminer tout le surnageant sauf 50 microlitres, transférer dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et conserver à moins 20 degrés Celsius, ou utiliser immédiatement. Pour l'évaluation des lysats de cellules hôtes, aspirer délicatement le milieu au-dessus de la monocouche sans perturber les cellules hôtes.

Ensuite, rincer les cellules une fois avec du PBS. Aspirer délicatement le PBS et appliquer immédiatement un volume de tampon de lyse glacé pour obtenir, par exemple, une concentration en protéines comprise entre 0,5 et 1,5 milligramme par millilitre. Incuber ensuite les échantillons sur de la glace pendant 15 minutes.

Ensuite, utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules de la surface de chaque puits, puis transférez l'ensemble du contenu de chaque puits dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez les échantillons à 14 000 RCF et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour évaluer les composants solubles du lysat, transférez le surnageant dans un tube neuf et conservez-le à moins 20 degrés Celsius ou utilisez-le immédiatement.

Pour évaluer les composants nucléaires ou autres composants insolubles du lysat, conserver le culot à moins 20 degrés Celsius ou l'utiliser immédiatement. Pour l'évaluation par imagerie en immunofluorescence, aspirer le milieu et laver les cellules avec du PBS froid 1x. Ensuite, fixer les cellules une nuit avec du PFA 4 % dans du PBS.

Effectuez des analyses supplémentaires conformément au protocole décrit dans le texte. Les données de western blot présentées ici démontrent une activation significativement accrue de la kinase p38 MAP et des kératinocytes en présence de streptolysine S ou de souches de gaz productrices de SLS, indiquant que ce système pourrait être utilisé pour évaluer les modifications de l'activation de protéines de signalisation de l'hôte indépendantes du contact. Sur cette image, l'activation dépendante de la SLS du médiateur inflammatoire clé facteur nucléaire-kappa B, qui transloque du cytoplasme vers le noyau lorsqu'il est activé, est illustrée, ce qui indique que ce système peut être utilisé pour visualiser les effets des facteurs bactériens sécrétés sur les réponses protéiques de l'hôte à l'aide d'approches de microscopie en immunofluorescence.

Ici, des augmentations significatives de la perméabilisation membranaire ainsi que de la libération de la LDH à partir des cellules hôtes sont démontrées après exposition à des souches de gaz productrices de SLS, par comparaison avec des cellules non infectées ou exposées à une souche déficiente en SLS. Ces résultats indiquent que ce système permet d'évaluer les modifications de la cytotoxicité hôte dépendantes des toxines. Dans cette expérience, les niveaux d'ATP dans les kératinocytes et leur réponse à l'infection par le gaz ont été déterminés.

16 heures après l'infection, une réduction significative de l'ATP a été observée, et la perte d'ATP était plus marquée en présence de SLS, ce qui est compatible avec l'augmentation dépendante de la toxine des signaux de réponse au stress de l'hôte et de la toxicité. Une fois établie, cette technique peut être utilisée pour étudier les réponses spécifiques de tout facteur microbien sécrété sur divers types de cellules hôtes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'appliquer une technique stérile tout au long des étapes de mise en place expérimentale, ainsi que de manipuler soigneusement les inserts à membrane perméable, tant lors de la configuration initiale que lors du prélèvement des échantillons.

Après avoir suivi cette procédure, des méthodes telles que le western blot, l'imagerie en immunofluorescence et les tests de perméabilisation membranaire peuvent être réalisées afin de déterminer comment le facteur bactérien d'intérêt contribue aux modifications des cascades de signalisation et influence la cytotoxicité globale durant l'infection. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons de cellules hôtes pour évaluer diverses réponses cellulaires suite à l'exposition à un facteur bactérien sécrété spécifique d'intérêt. N'oubliez pas que la manipulation de matières dangereuses pour la santé, telles que les agents pathogènes bactériens, nécessite certaines précautions de sécurité.

L'utilisation appropriée de lunettes de sécurité, de gants et de blouses de laboratoire, ainsi que l'utilisation correcte d'une hotte de sécurité biologique, sont nécessaires pour réaliser ces expériences en toute sécurité.