La mise en œuvre d'un système d'infection à base Insertion Perméable Membrane pour étudier les effets de sécrétées bactériennes Toxines sur des cellules hôtes mammaliennes

L’objectif global de ce système d’infection basé sur des inserts membranaires perméables est d’étudier les effets des toxines bactériennes sécrétées sur les cellules hôtes pendant l’infection. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions hôte-pathogène, telles que la façon dont des composants bactériens sécrétés spécifiques contribuent aux réponses des cellules hôtes lors d’une infection bactérienne. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier les composants bactériens sécrétés et de modéliser plus précisément un environnement hôte-pathogène physiologiquement pertinent dans le contexte d’une infection humaine.

Rebecca Flaherty, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour préparer des souches isogéniques de streptocoque sauvage du groupe A, ou GAS, et des souches mutantes GAS M1T1 5448, commencez les cultures liquides pendant la nuit en inoculant cinq à 10 millilitres de bouillon Todd Hewitt et en incubant à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Centrifugez les cultures bactériennes pendant la nuit et utilisez le volume d’origine de milieu bactérien frais pour remettre la pastille en suspension.

Ensuite, normalisez les cultures bactériennes à des concentrations de départ égales en diluant les cultures remises en suspension dans un milieu supplémentaire pour arriver à la même OD600. Pour collecter des lysats en vue d’effectuer une analyse de signalisation et des tests de détermination de l’ATP, placez des cellules HaCaT dans des boîtes à six puits à une densité d’assise d’environ trois fois 10 à la cinquième cellule par puits, et cultivez à 90 % de confluence. Pour effectuer des tests de perméabilisation membranaire de l’homodimère d’éthidium et de libération de lactate déshydrogénase, placez les cellules HaCaT dans des boîtes de 24 puits à une densité d’assise d’environ cinq fois 10 à la quatrième cellule par puits, et augmentez jusqu’à 90 % de confluence.

Immédiatement avant le traitement, utilisez 1x PBS pour laver les cellules. Appliquez ensuite deux millilitres de milieu de croissance frais avec ou sans traitement pharmacologique sur les plaques à six puits, ou 0,5 millilitre de milieu sur les puits des plaques à 24 puits. Ensuite, sous une hotte à flux laminaire, utilisez une pince stérile pour placer soigneusement une membrane perméable stérile de 0,4 micron dans chaque puits.

Une manipulation douce et stérile des inserts perméables pendant la préparation de l’infection est essentielle pour éviter que la membrane ne soit compromise ou contaminée au cours de ce processus. Appliquez un milieu de culture cellulaire frais dans la chambre supérieure de chaque puits selon les instructions du fabricant. Ensuite, appliquez un volume approprié de cultures bactériennes normalisées dans la chambre supérieure du système d’insertion de membrane perméable et appliquez un milieu bactérien dans les puits de contrôle.

L’ajout soigneux des bactéries dans la chambre supérieure, ainsi que le transport en douceur des cellules infectées vers l’incubateur, sont essentiels, car il est essentiel que les bactéries ne contaminent pas la chambre inférieure pendant la configuration expérimentale. Pour évaluer la présence de protéines de l’hôte sécrétées, utilisez une pince stérile pour retirer soigneusement l’insert de membrane perméable. Ensuite, sans perturber la monocouche de cellules, collectez le milieu de la chambre inférieure dans des tubes de 1,5 millilitre.

Centrifugez les échantillons à 14 000 RCF et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler les débris cellulaires. Ensuite, retirez tous les microlitres sauf 50 microlitres de surnageant, transférez-les dans un tube frais de 1,5 millilitre et conservez-le à moins 20 degrés Celsius, ou utilisez-le immédiatement. Pour l’évaluation des lysats de cellules hôtes, aspirez doucement le milieu au-dessus de la monocouche sans perturber les cellules hôtes.

Ensuite, utilisez du PBS pour rincer les cellules une fois. Aspirez doucement le PBS et appliquez immédiatement un volume de tampon de lyse glacé pour obtenir, par exemple, une concentration en protéines de 0,5 à 1,5 milligramme par millilitre. Ensuite, incubez les échantillons sur de la glace pendant 15 minutes.

Ensuite, utilisez un grattoir pour détacher les cellules de la surface de la plaque de chaque puits et transférez tout le contenu de chaque puits dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez les échantillons à 14 000 RCF et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour évaluer les composants lystate solubles, transférez le surnageant dans un tube frais et conservez-le à moins 20 degrés Celsius, ou utilisez-le immédiatement.

Pour évaluer les composants nucléaires ou d’autres composants de lysat insolubles, réservez la pastille et stockez-la à moins 20 degrés Celsius, ou utilisez-la immédiatement. Pour l’évaluation par imagerie d’immunofluorescence, aspirez le milieu et utilisez 1x PBS froid pour laver les cellules. Ensuite, avec 4 % de PFA et de PBS, fixez les cellules pendant la nuit.

Effectuer d’autres analyses selon le protocole de texte. Les données du western blot présentées ici montrent une augmentation significative de l’activation de la kinase p38 MAP et des kératinocytes en présence de souches gazeuses productrices de streptolysine S ou de SLS, ce qui indique que ce système peut être utilisé pour évaluer les changements dans l’activation des protéines de signalisation de l’hôte indépendantes du contact. Dans cette figure, l’activation dépendante du SLS du médiateur inflammatoire clé du facteur nucléaire-kappa B, qui se déplace du cytoplasme au noyau lors de l’activation, est montrée, indiquant que ce système peut être utilisé pour visualiser les effets des facteurs bactériens sécrétés sur les réponses des protéines de l’hôte à l’aide d’approches de microscopie par immunofluorescence.

Ici, des augmentations significatives de la perméabilisation membranaire et de la libération de LDH par les cellules hôtes sont démontrées après une exposition à des souches gazeuses productrices de SLS, par rapport aux cellules non infectées ou exposées à une souche déficiente en SLS. Ces résultats indiquent que ce système peut évaluer les changements de cytotoxicité de l’hôte dépendants des toxines. Dans cette expérience, les niveaux d’ATP dans les kératinocytes et la réponse à l’infection gazeuse ont été déterminés.

16 heures après l’infection, une réduction significative de l’ATP a été observée, et la perte d’ATP était plus prononcée en présence de SLS, ce qui correspond à l’augmentation dépendante de la toxine de la signalisation de la réponse au stress de l’hôte et de la toxicité. Une fois établie, cette technique peut être utilisée pour étudier les réponses spécifiques de tout facteur microbien sécrété sur une variété de types de cellules hôtes. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de pratiquer la technique stérile tout au long des étapes de configuration expérimentale et de maintenir une manipulation soigneuse des inserts de membrane perméable, à la fois lors de la configuration initiale et pendant le prélèvement des échantillons.

À la suite de cette procédure, des méthodes telles que le western blot, l’imagerie par immunofluorescence et les tests de perméabilisation membranaire peuvent être effectuées, afin de déterminer comment le facteur bactérien d’intérêt contribue aux changements dans les cascades de signalisation et influence la cytotoxicité globale pendant l’infection. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons de cellules hôtes pour l’évaluation d’une variété de réponses de la cellule hôte après une exposition à un facteur bactérien sécrété spécifique d’intérêt. N’oubliez pas que la manipulation de matières biologiquement dangereuses, telles que les agents pathogènes bactériens, nécessite certaines considérations de sécurité.

L’utilisation appropriée de lunettes de sécurité, de gants et de blouses de laboratoire, ainsi que l’utilisation appropriée d’une cagoule de biosécurité, sont nécessaires pour réaliser ces expériences en toute sécurité.