Une méthode de détermination et de Simulation de perméabilité et de la Diffusion dans un modèle de tissu 3D dans une Membrane insérer système pour plaques multipuits

L’objectif général de ce protocole est de déterminer la perméabilité et les coefficients de diffusion de modèles de peau 3D dans un système d’insertion de petites membranes. Ces questions peuvent aider à répondre à des questions clés sur l’ingénierie 3D des tissus cutanés pour des applications pharmaceutiques et cosmétiques, dans lesquelles la perméabilité et le coefficient de diffusion sont des facteurs de qualité essentiels. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer directement ces coefficients au sein d’un petit insert multi-puits.

Le système de petite insertion de membrane dans la simulation peut être modifié pour être utilisé dans les dispositifs d’orgue du vaisseau et d’autres applications qui utilisent des systèmes d’insertion de membrane. Pour préparer un gel d’agarose, commencez par appliquer 28,6 microlitres de gel d’agarose liquide à 80 degrés Celsius fraîchement préparé sur chaque membrane d’un système d’insertion de membrane à 96 puits. Après 10 minutes, le gel se sera solidifié et pourra être utilisé pour un test de perméabilité.

Pour préparer un modèle de cellule de collagène, mélangez d’abord 125 microlitres de HBSS et un millilitre de solution de collagène R sur de la glace, puis neutralisez avec de l’hydroxyde de sodium. Ajoutez ensuite 125 microlitres de fibroblastes primaires en suspension dans un milieu complet au mélange. Et ajoutez 28,6 microlitres de la solution cellulaire résultante à chaque puits d’un nouveau système d’insertion de membrane à 96 puits.

Après 30 minutes dans un incubateur de culture cellulaire, ajoutez 75 microlitres de milieu complet à la surface du gel et 300 microlitres de milieu complet au fond de chaque puits pour une incubation d’une nuit dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, remplacez le milieu par 75 microlitres de kératinocytes humains adultes à faible teneur en calcium et à haute température pour chaque modèle de cellule de collagène et retournez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours supplémentaires. Le quatrième jour, aspirez le milieu de la surface du modèle cellulaire et remettez la plaque dans l’incubateur pendant sept jours supplémentaires.

Pour effectuer un test de perméabilité, distribuez 75 microlitres de substance donneuse dans un système modèle d’intérêt à petit puits et ajoutez 300 microlitres de substance accepteuse au fond de chaque puits. Placez la plaque sur un agitateur à 37 degrés Celsius, 95 % d’humidité et environ 480 tr/min pendant cinq heures, en transférant le système d’insertion de membrane une fois par heure dans une plaque vide de 96 puits et en mesurant la fluorescence diffuse dans les puits inférieurs de la plaque expérimentale sur un lecteur de plaques. À la fin de l’expérience de perméabilité, ouvrez le logiciel de modélisation approprié et démarrez un nouveau modèle.

Sélectionnez Assistant de modèle et Modèle 3D. Ajoutez Transport d’espèces diluées et cliquez sur étude. Sélectionnez ensuite Dépendant du temps et cliquez sur OK.

Sous Définitions globales, cliquez avec le bouton droit de la souris pour ajouter des paramètres et entrez les paramètres géométriques et physiques dans la grille. Configurez la géométrie du système d’insertion membranaire à partir des expériences, et cliquez avec le bouton droit de la souris sur Définitions pour ajouter deux sondes de domaine, en sélectionnant une sonde comme domaine accepteur et l’autre comme domaine donneur. Définissez les deux domaines sur la moyenne avec une expression C et une unité de mols par mètre cube.

Et définissez le coefficient de diffusion sous les propriétés de transport un et le transport des espèces diluées. Faites un clic droit sur transport d’espèces diluées pour ajouter une deuxième propriété de transport deux et sélectionnez la deuxième barrière dans la sélection du domaine. Dans le cas du transport d’espèces diluées, pour les valeurs initiales un, définir la concentration comme étant nulle.

Faites un clic droit sur transport d’espèces diluées pour ajouter une deuxième valeur initiale deux et sélectionner le donneur comme troisième domaine. Définir la concentration comme concentration initiale de la substance donneuse fluorescente. Faites un clic droit sur le transport des espèces diluées pour ajouter la symétrie un et sélectionnez toutes les surfaces de la sélection de frontière qui reflètent la géométrie entière.

Faites un clic droit sur le maillage pour ajouter deux tétraèdres libres et définir la deuxième barrière comme domaine. Faites un clic droit sur le tétraédrique libre pour ajouter la taille du maillage prédéfini à extra-fin. Dans le deuxième tétraèdre libre, définissez l’accepteur et le donneur en tant que domaines et le maillage prédéfini à plus fin.

Ensuite, sous la première étude, cliquez sur calculer pour démarrer la simulation. Pour ajuster le coefficient de diffusion aux données générées par la simulation de diffusion, ouvrez le menu Ajouter un psychique et sélectionnez mathématiques. Localisez l’optimisation et la sensibilité.

Sélectionnez optimisation et cliquez sur Ajouter au composant. Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris sur les définitions pour ajouter des variables et entrez manuellement les variables de la table trois. Ensuite, sous le menu de couplage des composants, cliquez avec le bouton droit de la souris sur les définitions, ajoutez une moyenne suivie de l’ajout manuel de l’accepteur comme nom d’opérateur et sélectionnez le domaine un.

Exportez les données expérimentales dans un nouveau document texte. Utilisez un point-virgule pour séparer les données en colonnes et un saut de ligne pour séparer les données en lignes. Faites un clic droit sur optimisation pour ajouter l’objectif global des moindres carrés et joignez le document texte aux données expérimentales.

Cliquez sur l’objectif des moindres carrés globaux pour définir la première colonne en tant que première colonne de temps et la deuxième colonne en tant que première colonne de valeur. Dans la colonne expression de valeur, entrez la variable C.Clic droit sur optimisation pour ajouter les variables de contrôle globales une. Et déclarez la recherche de trait de soulignement D en tant que variable avec une valeur initiale de un, une limite inférieure de zéro et une limite supérieure de 1 000.

Faites un clic droit sur la première étude pour ajouter l’optimisation. Et sélectionnez SNOPT comme méthode de solveur d’optimisation. Réglez la tolérance d’optimalité à un à la puissance moins huit.

Réglez ensuite le coefficient de diffusion sur la barrière sur D.Réglez le temps de simulation à l’étude de zéro seconde à 22 000 secondes avec un intervalle de 100 secondes et cliquez sur calculer pour commencer l’optimisation des paramètres. L’analyse histologique d’un modèle de cellule de collagène révèle une légère coloration des fibroblastes au sein de la matrice centrale. Au sommet de la matrice de collagène, une couche contenant de nombreux noyaux probablement constitués de kératinocytes humains adultes à faible teneur en calcium et à haute température peut être observée.

L’utilisation du sel de sodium de fluorescéine et de l’isothyocyanate de fluorescéine vérifiée l’impact de la taille moléculaire de la substance diffusante révèle que pour les petites tailles moléculaires, la simulation et les données expérimentales sont en bon accord pour les deux molécules. Cependant, les tailles moléculaires plus grandes génèrent des écarts plus élevés dans les progressions des courbes dans les simulations, démontrant un retard au début et une augmentation plus forte au cours ultérieur des graphiques. En effet, le coefficient de perméation diminue à mesure que la taille moléculaire augmente, les coefficients simulés se comportant de manière similaire aux coefficients de perméabilité expérimentaux.

Il convient de noter que la plupart des modèles qui utilisent des kératinocytes humains adultes à faible teneur en calcium et à haute température ont des coefficients de perméation et de diffusion inférieurs à ceux des modèles sans kératinocytes humains adultes à faible teneur en calcium et à haute température. Le modèle de simulation de collagène peut être établi en 11 à 12 jours et la mesure de la perméation peut être effectuée en six heures si elle est effectuée correctement. Lors de l’exécution de la procédure, il est important de maintenir constantes les conditions limites telles que la température, le volume de remplissage, la concentration de la substance appliquée, l’humidité et le processus membranaire afin de réduire la variation du coefficient de perméation.

Avec l’aide de cette simulation de module, l’effort expérimental peut être réduit et les performances à long terme peuvent être prédites. Il peut également être adapté à d’autres dispositifs de perméation ou à des systèmes de propriété d’organes. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des applications pharmaceutiques et cosmétiques ainsi qu’au développement interactif en ingénierie tissulaire pour explorer les processus de perméation par diffusion dans les tissus artificiels.