Name: Une méthode de détermination et de Simulation de perméabilité et de la Diffusion dans un modèle de tissu 3D dans une Membrane insérer système pour plaques multipuits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Découvrez une méthode de simulation pour déterminer la perméabilité et la diffusion dans des modèles de peau 3D utilisant un système à inserts membranaires. Cette technique optimise les paramètres pour l'ingénierie tissulaire pharmaceutique et cosmétique.

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Ce travail a été créé avec le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Grant No. PO413/12-1 et LA 1028/7-1.

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Uwe Marx est le PDG et actionnaire et Gerd Lindner est un actionnaire de TissUse GmbH, une société de fabrication et la commercialisation de la technologie de la MOC. D’autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Cette étude documente une méthode mise au point afin de quantifier la perméation à travers un tissu-construct conçu sur une membrane. Perméation de substances avec diverses tailles moléculaires par gel d’agarose a d’abord examinée pour tester et valider la méthode et la simulation correspondante. Il est bien connu que les molécules plus petites imprègnent plus vite au travers d’une maille de matrice (à l’exception de l’effet de filtration sur gel par chromatographie de perméabilité). Des observations similaires ont été faites avec des expériences d’exclusion stérique des substances à travers la sclère26, membrane épidermique humain27,17de la peau humaine et rat peau28. Une corrélation inverse entre les coefficients de perméabilité et le rayon de Stokes correspondant (le rayon d’une sphère dure qui se déplace avec le même taux de diffusion que les molécules décrites, généralement plus petits que le rayon effectif de la molécule) a été établi 26 , 28et une relation similaire a été observé dans des expériences avec des matières de différentes tailles moléculaires. En traçant les coefficients de perméabilité sur rayon 1/Stokes, a trouvé une corrélation linéaire sur les quatre groupes avec la plus petite taille moléculaire (R2 = 0,93) (Figure 6). Cela montre que les coefficients de perméabilité simulé avec la méthode proposée sont dans une gamme réaliste.
L’erreur de 46,15 % dans les expériences est légèrement plus grand que celles rapportées pour des expériences de perméabilité avec le Franz diffusion cellulaire système10. Une explication possible pourrait être la distribution granulométrique de fluorescéine-isothiocyanate-dextran, dont nous parlerons plus tard.
La méthode décrite a importants avantages comparativement aux méthodes utilisant le système de cellule de diffusion Franz. Tout d’abord, la configuration est plus compacte ; les expériences sont exécutés directement dans un système d’insertion de membrane, qui a l’échelle d’une plaquette commerciale bien (∼ 13 cm x 8,5 cm). Cela permet à plusieurs échantillons à exécuter simultanément, alors qu’une cellule de diffusion Franz distincte est nécessaire pour chaque échantillon. Deuxièmement, la perméabilité d’un modèle de peau peut être mesurée directement à l’insertion de la membrane, où la culture se déroule. À l’aide de cellules de diffusion Franz, les échantillons doivent être sortis et monté sur le système, qui est plus lourde pour les petits échantillons et aussi plus de temps.
Expériences de perméation avec matrices de cellules de collagène ont montré que cette méthode peut être appliquée avec succès aux systèmes cellulaires graines. Le modèle présenté ici a été vérifié pour les modèles de peau ; Toutefois, la méthode peut être appliquée à d’autres types de cultures de cellules organiques, par exemple, des reins ou du foie.
Dans cette étude, a utilisé un modèle de collagène-cellule dans laquelle les cellules HaCaT entièrement recouvert la surface du modèle (voir Figure 5). Cela a conduit à une réduction du coefficient de perméabilité, ce qui démontre que la méthode est suffisamment sensible pour distinguer le coefficient de perméabilité entre un modèle de collagène-cellule avec et sans une couche de HaCaT. Dans l’idéal, un modèle de peau devrait constituer une barrière, qui s’approche de l’épiderme d’une peau réelle29, et il est donc important de vérifier la qualité (p. ex., bâtiment du derme, épiderme) du modèle de peau avant l’utilisation effective. L’élaboration d’un modèle de peau peut être visualisée à l’aide des techniques de coloration et quantifiée de la détection de la peau collagène et les protéines30,31,32. Le coefficient de perméabilité peut aussi être un facteur important pour évaluer l’évolution du modèle de peau, mais les autres expériences sont nécessaires pour confirmer cela. Tel que mentionné précédemment, cette méthode permet de multiples échantillons en cours d’exécution en parallèle. Il est également possible de prélever des échantillons au cours de la culture pour mesurer la perméabilité et ainsi observer le développement de ce paramètre du modèle de peau.
Il est à noter que la perméabilité est mesurée grâce à un gel/collagène-cellule-modèle et d’une membrane en même temps. Le coefficient de perméabilité détecté est spécifique au système, auquel cas les résultats des modèles de peau différente ne peuvent être comparés que lorsque vous utilisez le même foyer de membrane. En outre, le modèle de peau a besoin couvrir la zone de culture ensemble afin de s’assurer que la substance d’essai imprégnera uniquement via le modèle et pas adjacents à celui-ci, qui induirait erreurs dans la perméabilité mesurée. Un autre aspect qui devrait être considéré à l’avenir des expériences est l’environnement naturel qui entoure la peau. Normalement, la température de la surface de la peau est plus faible en comparaison de la région, qui peut influencer les conditions de perméation.
Afin d’aligner les expériences en laboratoire avec des simulations informatiques, une méthode qui permet l’optimisation des paramètres pour la simulation appliquée a été présentée. Des simulations ont été trouvées à coïncident bien avec les données expérimentales pour les substances dont la petite taille moléculaire. Les écarts entre la simulation et les données expérimentales ont cependant étaient observées pour les substances dont la taille moléculaire. Molécules de polysaccharides grand peuvent augmenter la friction et ralentir le processus de diffusion dans un gel. Cet effet provoque la diffusion anormale, qui est une raison possible de l’écart entre expérimentale et simulation des valeurs33,34. Une autre explication serait la présence de particules plus petites ou plus grandes en fluorescéine-isothiocyanate-dextran. Le fabricant spécifie le poids moléculaire de la substance comme la taille moyenne avec une plage donnée, ce qui permet à des particules plus petites et plus grandes d’être présent. On ignore également comment dispersées ces substances sont, comme les particules plus petites imprègnent plus rapidement à travers le gel et le canal de fluide. Il est possible d’étendre la simulation afin d’étudier ces diffusion et les effets de la friction.
L’expérience de la perméabilité et la simulation ont été développés pour une utilisation dans un 2-oC. Avec l’aide de la simulation, cette méthode expérimentale peut être transférée directement aux configurations expérimentales plus sophistiquées. Par exemple, la simulation de système insert membrane peut être facilement transférée à la géométrie d’un 2-OC ou à d’autres systèmes avec des configurations similaires. Cette option de modulation de la simulation peut servir à appuyer la conception de futures expériences. En outre, les effets secondaires tels que l’évaporation, diffusion anormale et effets membranaires peut être intégrés pour améliorer la simulation, augmentant ainsi la précision. Le programme de simulation donne la possibilité de changer ou améliorer l’équation de simulation, ainsi que d’intégrer d’autres modules physiques afin d’enquêter sur d’autres aspects du développement de modèle de peau. Un exemple est la simulation de la production de la consommation et de lactate de glucose dans un modèle de cellules de collagène.
Un aspect particulièrement intéressant dans les essais de substances médicales est la façon dont les substances sont distribués dans un système d’orgue-on-a-chip. Le paramètre de simulation et de perméabilité mon aide pour répondre à des questions telles que comment rapidement une substance pénètre dans le système et dont la concentration sera disponible pour les autres tissus dans une puce multi-organes. Cette méthode peut appuyer et d’améliorer le développement et le test de tels systèmes d’organe-on-chip.

Organo-typiques cultures 3D sont devenus des outils puissants pour le développement de médicaments et de la substance test1. À cet égard, les modèles de peau humaine sont d’un intérêt particulier en raison des exigences réglementaires, telles que celles de la cosmétique. Ils ont ensuite conduit à l’élaboration de nombreux modèles de peau 3D, pour une utilisation soit sur leur propre comme culture unique-orgue en plaques multipuits, ou en multi-organes-copeaux en combinaison avec les modèles d’organes supplémentaires, par exemple, le foie2.
En ce qui concerne la culture d’un équivalent de la peau, l’interface air-liquide (ALI) est un élément essentiel pour la bonne différenciation épidermique3. Inserts de culture cellulaire, composés d’un récipient contenant une membrane perméable au liquide en bas sont généralement utilisés pour mettre en place un ALI. ALIs sont largement utilisés dans des modèles de peau disponible dans le commerce comme EpiDerm4, Phenion5et Episkin6, pour la culture des modèles de peau avec des tailles de 96 puits (4,26 mm de diamètre) jusqu'à plaques de 12 puits (12,2 mm de diamètre). La méthode décrite ici détermine la pénétration de substances dans un système d’insertion de membrane.
Le coefficient de perméabilité est un paramètre important pour évaluer la qualité de n’importe quel cultivée-modèle de peau contre peau native5et est utilisé pour évaluer la vitesse à laquelle les substances actives migrent à travers la peau. Surtout si les médicaments ou cosmétiques produits doivent être appliqués sur la peau, ce paramètre est essentiel de comprendre quand précisément les principes actifs passent par elle. Une simulation plus peut aider à prédire le comportement du système et de réduire par la suite l’effort expérimental de temps nécessaire, surtout lorsqu’un grand nombre de substances est impliqué.
La cellule de diffusion Franz est state-of-the-art pour perméation expérimente la peau et peau modèles5,6,7,8,9. Ce dispositif se compose de deux compartiments avec un échantillon fixe (barrière de diffusion) entre les deux. La substance d’essai est appliquée directement sur la partie supérieure de l’échantillon (compartiment donneur) et la concentration du composé PERMÉANTES peut être détectée dans le compartiment opposé à (accepteur). Du côté de l’accepteur, température constante et la concentration de la substance homogène sont assurées grâce à une chambre froide et un agitateur magnétique. Échantillons peuvent être prélevés à un échantillonnage du bras sur le côté de l’accepteur de la cellule de Franz. Avec une gamme de hauteur de 19 cm 179, ce système est relativement important de10,11. Une autre méthode pour la détermination des coefficients de diffusion des substances gélatineuse et de tissus est FRAP. Cette technique utilise le principe de blanchiment fluorescent étiqueté des particules dans le gel et puis en déterminant le temps de récupération de la zone blanchie pour calculer la diffusion coefficient12,13,14.
En outre, la spectroscopie Fourier transform-infrarouge (FTIR) peut servir à détecter le mouvement de la particule avec absorption de lumière infrarouge afin de déterminer le processus de percolation des substances dans la peau15,16. Cependant, ceux-ci ou autres méthodes d’imagerie (par exemple, de la spectroscopie par fluorescence biphotonique corrélation17) doivent coûter instruments intensives.
Dans cet article, on présente une méthode pour mesurer directement la perméabilité d’une barrière au sein d’un système d’insertion de membrane, où un modèle de peau peut être cultivé. Cette méthode permet aux expériences de perméabilité être exécuté avec un grand nombre de petits échantillons (bien taille vers le haut à 4,26 mm) dans un système compact. C’est contrairement à la cellule de diffusion Franz, où un dispositif distinct est nécessaire pour chaque sonde, ce qui doit être monté sur l’appareil et est difficile à réaliser pour les petits échantillons (taille de 4,26 mm). En outre, étant donné que la méthode ne nécessite pas de grands instruments (p. ex., un microscope confocal ou multiphoton), une réduction dans le temps et le coût est atteint.
Toutes les expériences ont été réalisées en membrane microporeuse insérer systèmes auprès d’un échantillon (barrière) consistant en gel d’agarose ou d’un modèle de cellules de collagène mis en place sur la membrane. Les substances fluorescentes (donneur) avec diverses tailles moléculaires ont été appliquées à la partie supérieure de l’échantillon et la concentration de substance perméabilisée a été détectée sur le fond (accepteur) à l’aide d’un lecteur de fluorescence (voir Figure 1). Afin de valider la méthode et de vérifier l’exactitude de cette simulation, les gels d’agarose ont été produits et utilisés comme une barrière. Les hydrogels sont généralement utilisés pour l’étude des processus de diffusion et de perméabilité dans un milieu poreux dans les sciences biologiques13. La méthode a été testée puis dans un système cellulaire graines consistant en une matrice de collagène de fibroblastes primaires et adultes faible Calcium haute température kératinocytes (HaCaT) des cellules humaines (modèle de cellule-matrice), qui est une peau simplifiée modèle18,19 .
En outre, le processus de percolation a été simulé au moyen de simulations de flux avec la dynamique des fluides computationnelle. Il a été constaté que, au moyen de l’optimisation des paramètres, le coefficient de diffusion pourrait être calculé à partir des données expérimentales. En général, cette simulation vous propose différentes applications ; par exemple, il est possible de prévoir un processus de perméation basé sur des expériences courtes et la simulation peut réduire considérablement le nombre d’expériences.
Simulation et méthode expérimentale ont été conçus pour l’application sur un système d’orgue-on-a-chip1,20,21, plus précisément le 2-orgue-puce (2-OC) développé commercialement1,22, 23,24,25. En principe, le processus de perméation de n’importe quel modèle d’orgue basé sur des systèmes de membrane insert peut être décrit de cette façon.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>Poudre haute résolution</td></tr><tr><td>Collagène</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Solution de collagène R 0,4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>Glycémie élevée avec L-glutamine</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Sérum de veau fœtal</td></tr><tr><td>Fluorescéine Sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescéine Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescéine Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescéine Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>sans calcium, sans magnésium, avec rouge de phénol</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granulé</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>comprimés Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 puits, 0,4 &micro ; m pore size</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 puits, 0,4 & micro ; taille des pores</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>avec EDTA</td></tr></tbody></table>

une méthode de détermination et de simulation de perméabilité et de la diffusion dans un modèle de tissu 3d dans une membrane insérer système pour plaques multipuits

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

Modèles de peau in vitro cultivées sont devenus de plus en plus pertinentes pour les applications pharmaceutiques et cosmétiques et sont également utilisés dans le développement de médicaments ainsi qu’aux essais de la substance. Ces modèles sont principalement cultivés dans les systèmes de membrane-insertion, leur perméabilité vers différentes substances étant un facteur essentiel. En général, les méthodes appliquées pour la détermination de ces paramètres exigent habituellement de grands échantillons (par exemple, la cellule de diffusion Franz) ou équipement laborieux (p. ex., récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)). Cette étude présente une méthode de détermination des coefficients de perméabilité directement dans les systèmes de membrane-insert avec diamètre de corps de 4,26 et 12,2 mm (zone de production). La méthode a été validée avec agarose et gels collagène ainsi qu’un modèle de cellule de collagène représentant des modèles de peau. Les processus de perméation des substances avec différentes tailles moléculaires et perméation à travers des modèles de cellules différentes (composé de gel de collagène, fibroblaste et HaCaT) ont été décrites avec précision.
En outre, pour prendre en charge la méthode expérimentale qui précède, une simulation a été créée. La simulation s’insère les données expérimentales bien pour les substances dont la petite taille moléculaire, jusqu'à à 14 x 10-10 m rayon de Stokes (4 000 MW), et est donc un outil prometteur pour décrire le système. En outre, la simulation peut réduire considérablement les efforts expérimentaux et est assez robuste pour être reconduites ou adaptés à des configurations plus complexes.

Expériences de perméabilité de la membrane de 96 puits insérer système avec du gel d’agarose à 2 % comme une barrière ont été menées afin d’évaluer l’exactitude d’une simulation. Sel de sodium de fluorescéine (NaFl) et fluorescéine isothiocyanate-dextranes (FD) ont servi à vérifier l’impact de la taille moléculaire de la substance de diffusion de 5 x 10-10 m vers le haut à 45 x 10-10 m rayon de Stokes (376.27-40 000 mol wt). Optimisation de paramètres native de la simulation a été utilisée pour ajuster la simulation aux données expérimentales.
À cette fin, pentes d’uniquement les éléments linéaires de la perméabilité simulée ont été comparés aux résultats expérimentaux. De petite taille moléculaire, simulation et les données expérimentales sont en bon accord avec 99,2 % pour NaFl et 80,2 % pour FD 4 000 (voir Figure 4 a et 4 b de la Figure). Plus grande taille moléculaire générée déviations supérieures montrant les corrélations de 50,5 % pour 10 000 FD, 79,7 % pour 20 000 FD et 53,6 % pour 40.000 FD. Courbe de progression dans les simulations ont montré un retard au début et à une hausse plus forte dans le cours des graphes (voir Figure 4 c–4e).
Coefficients de perméabilité et de coefficients de diffusion simulées sont indiquées en tableau 4. Le coefficient de perméabilité diminue avec l’augmentation de la taille moléculaire. Écart-type est entre 0,08 x 10-8 m/s et 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), qui correspond à une erreur absolue d’entre 4,18 % et 46,15 %. Expériences avec des molécules plus grosses ont montré une plus grande erreur absolue. Les coefficients de diffusion simulées se sont comportés très similaire aux coefficients de perméabilité expérimentale. Substances à plus grand rayon de Stokes a montré baisse des coefficients de diffusion et l’erreur absolue variait de 9,09 % à 18.46 % (N = 3).
Dans les expériences de perméation supplémentaires, quatre types de modèles de cellule de collagène différents furent utilisés comme barrières dans une membrane de 12 puits insérer système. Ces modèles comprennent un modèle acellulaire et un modèle de cellule avec différentes combinaisons de fibroblastes primaires dans le gel de collagène et HaCaT sur la surface. Les combinaisons suivantes ont été utilisés : collagène (colonel) comme un modèle acellulaire, collagène + fibroblastes (col. + F.), HaCaT (col. + H.) et collagène + fibroblastes, collagène + HaCaT (col. + F. + H.). Sel de sodium de fluorescéine avec DMEM + FCS de 10 % a été utilisé comme substance de donateurs. Image pour l’analyse du modèle de cellule de collagène, coloration à l’hématoxyline et éosine (HE) a été utilisée. Cette coloration a été faite à l’aide du protocole par le fabricant. Dans la Figure 5, montre une telle tache avec un modèle représentatif du colonel + F. + H.. Le HE taches légèrement la structure tissulaire de la matrice de collagène. Les fibroblastes sont situés dans la matrice, et les noyaux des fibroblastes et les cellules HaCaT sont colorés en violet foncé. Sur le dessus de la matrice de collagène, il y a une couche contenant plusieurs noyaux, qui devraient être le noyau de la HaCaTs, création d’une couche englobante sur le dessus du modèle.
Dans le tableau 5, coefficients de perméation expérimentale et des coefficients de diffusion simulées sont répertoriés. Une tendance est visible pour la plupart des modèles avec HaCaT, qui ont des coefficients de percolation/diffusion plus faibles en comparaison avec les modèles sans HaCaT. L’erreur absolue des coefficients de perméation est 10,9-24,4 % et pour la diffusion coefficients de 5.2 à 12,9 %.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> Figure 1 : vue latérale de l’expérience de la perméabilité de la membrane insérer système. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> Figure 2 : graphique exemplaire d’une expérience de perméabilité. La concentration de l’accepteur est tracée au fil du temps. Support de deux lignes en pointillés la partie quasi linéaire de la courbe. La pente de la partie linéaire est utilisée pour déterminer le coefficient de perméabilité. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> Figure 3 : géométrie et mesh de la membrane insérer système dans la simulation. (a) la géométrie de la membrane de 96 puits système d’insert. (b), à la géométrie de la membrane de 12 puits insert système. système d’insertion (c), à la maille de la membrane de 96 puits. (d), à la maille de la membrane de 12 puits insert système. (e) paramètres de la membrane et la section insèrent système. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> Figure 4 : comparaison des données expérimentales d’une expérience de perméation à la simulation optimisée. (un) sel de sodium de fluorescéine, (b) fluorescéine isothiocyanate-dextran 4 000 mol en poids, poids mol (c), 10 000, (d) 20 000 mol en poids et en poids mol de (e), 40 000 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> Figure 5 : représentant HE coloration d’un modèle de cellules de collagène (fibroblastes, collagène + HaCaT). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> Figure 6 : coefficient de perméabilité en fonction du rayon 1/Stokes à l’aide de sel de sodium de fluorescéine et fluorescéine isothiocyanate-dextran dans une membrane de 96 puits insérer système. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Expression pour 96 système bien en mm</td>
			<td>Experssion pour système de 12 puits en mm</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14,7 [mm]</td>
			<td>Diamètre du puits</td>
		</tr>
<tr>
<td>D_A</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>Diamètre de la Membrane</td>
		</tr>
<tr>
<td>D_W</td>
			<td>8,79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>Diamètre de l’accepteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>Hauteur de la barrière</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>Distance entre les deux bien et en bas</td>
		</tr>
<tr>
<td>dejlal</td>
			<td>4,73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>Forte de l’accepteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Profondeur d’immersion</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>Rayon de la boule d’Immersion+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>r_z</td>
			<td>r + h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>z-Position de la balle d’Immersion+
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : paramètres de géométrie de simulation « Transport d’espèces chimiques ». + Uniquement pour être utilisé pour la simulation d’agarose gel dans 96 membrane bien insérer système.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Expression</td>
			<td>Valeur</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Concentration de Fl.So.</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4</td>
			<td>2 mg/ml [] / 4000 [g/mol]</td>
			<td>0,5 mol/m2</td>
			<td>Concentration de FD 4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 mg/ml [] / 10000 [g/mol]</td>
			<td>0,2 mol/m2</td>
			<td>Concentration de FD 10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 mg/ml [] / 20000 [g/mol]</td>
			<td>0.1 mol/m2</td>
			<td>Concentration de FD 20.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 mg/ml [] / 40000 [g/mol]</td>
			<td>0,05 mol/m2</td>
			<td>Concentration de FD 40.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^ 2/s]</td>
			<td>1e - 9m2/s</td>
			<td>Coefficient de diffusion de l’eau de gâchage</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Paramètres physiques pour la simulation de « Transport des espèces chimiques ».
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Expression</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Définition de la concentration de l’accepteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e-10</td>
			<td>Changement de facteur pour D</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Paramètres pour la simulation de le « Optimisation ».
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Perméat</td>
			<td>Coefficient de perméabilité (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coefficient de diffusion (m/s2) x 10-10</td>
			<td>Rayon de Stokes de perméat (m) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So.</td>
			<td>4.79 ± 0,20</td>
			<td>1.94 ± 0,34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4 000</td>
			<td>2,37 ± 0,31</td>
			<td>0,65 ± 0,12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1,67 ± 0,47</td>
			<td>0.22 ± 0,02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20 000</td>
			<td>0,65 ± 0,30</td>
			<td>0,29 ± 0,04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40 000</td>
			<td>0,27 ± 0,08</td>
			<td>0,14 ± 0,02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : coefficient de perméabilité et de la diffusion de substances avec rayon de Stokes différent par le biais de gel d’Agarose à 2 % + membrane dans une membrane de 96 puits insérer système. (sel de sodium de fluorescéine = Fl. So., fitc dextran = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modèle</td>
			<td>Coefficient de perméabilité (m/s) x 10-8</td>
			<td>Coefficient de diffusion (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Col.</td>
			<td>2.18 ± 0,29</td>
			<td>1.22 ± 0,06</td>
		</tr>
<tr>
<td>Le colonel + F.</td>
			<td>1,77 ± 0,38</td>
			<td>0,93 ± 0,12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Le colonel + H.</td>
			<td>1,64 ± 0,40</td>
			<td>0,96 ± 0,05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Le colonel + F. + H.</td>
			<td>1,65 ± 0,18</td>
			<td>0,88 ± 0,11</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 5 : coefficient de perméabilité et de la diffusion du sel de sodium de fluorescéine à travers un modèle de cellules de collagène dans un 12-membrane bien insérer système (col = collagène, F. = fibroblastes, H. = HaCaT).

Une méthode de détermination de la perméabilité de la membrane insérer système pour plaques multipuits et in silico optimisation de paramètres pour le calcul des coefficients de diffusion à l’aide de la simulation sont présentés.

Une méthode de détermination et de Simulation de perméabilité et de la Diffusion dans un modèle de tissu 3D dans une Membrane insérer système pour plaques multipuits

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

L’objectif général de ce protocole est de déterminer la perméabilité et les coefficients de diffusion de modèles de peau 3D dans un système d’insertion de petites membranes. Ces questions peuvent aider à répondre à des questions clés sur l’ingénierie 3D des tissus cutanés pour des applications pharmaceutiques et cosmétiques, dans lesquelles la perméabilité et le coefficient de diffusion sont des facteurs de qualité essentiels. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer directement ces coefficients au sein d’un petit insert multi-puits.Le système de petite insertion de membrane dans la simulation peut être modifié pour être utilisé dans les dispositifs d’orgue du vaisseau et d’autres applications qui utilisent des systèmes d’insertion de membrane. Pour préparer un gel d’agarose, commencez par appliquer 28,6 microlitres de gel d’agarose liquide à 80 degrés Celsius fraîchement préparé sur chaque membrane d’un système d’insertion de membrane à 96 puits. Après 10 minutes, le gel se sera solidifié et pourra être utilisé pour un test de perméabilité.Pour préparer un modèle de cellule de collagène, mélangez d’abord 125 microlitres de HBSS et un millilitre de solution de collagène R sur de la glace, puis neutralisez avec de l’hydroxyde de sodium. Ajoutez ensuite 125 microlitres de fibroblastes primaires en suspension dans un milieu complet au mélange. Et ajoutez 28,6 microlitres de la solution cellulaire résultante à chaque puits d’un nouveau système d’insertion de membrane à 96 puits.Après 30 minutes dans un incubateur de culture cellulaire, ajoutez 75 microlitres de milieu complet à la surface du gel et 300 microlitres de milieu complet au fond de chaque puits pour une incubation d’une nuit dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, remplacez le milieu par 75 microlitres de kératinocytes humains adultes à faible teneur en calcium et à haute température pour chaque modèle de cellule de collagène et retournez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours supplémentaires. Le quatrième jour, aspirez le milieu de la surface du modèle cellulaire et remettez la plaque dans l’incubateur pendant sept jours supplémentaires.Pour effectuer un test de perméabilité, distribuez 75 microlitres de substance donneuse dans un système modèle d’intérêt à petit puits et ajoutez 300 microlitres de substance accepteuse au fond de chaque puits. Placez la plaque sur un agitateur à 37 degrés Celsius, 95 % d’humidité et environ 480 tr/min pendant cinq heures, en transférant le système d’insertion de membrane une fois par heure dans une plaque vide de 96 puits et en mesurant la fluorescence diffuse dans les puits inférieurs de la plaque expérimentale sur un lecteur de plaques. À la fin de l’expérience de perméabilité, ouvrez le logiciel de modélisation approprié et démarrez un nouveau modèle.Sélectionnez Assistant de modèle et Modèle 3D. Ajoutez Transport d’espèces diluées et cliquez sur étude. Sélectionnez ensuite Dépendant du temps et cliquez sur OK.Sous Définitions globales, cliquez avec le bouton droit de la souris pour ajouter des paramètres et entrez les paramètres géométriques et physiques dans la grille. Configurez la géométrie du système d’insertion membranaire à partir des expériences, et cliquez avec le bouton droit de la souris sur Définitions pour ajouter deux sondes de domaine, en sélectionnant une sonde comme domaine accepteur et l’autre comme domaine donneur. Définissez les deux domaines sur la moyenne avec une expression C et une unité de mols par mètre cube.Et définissez le coefficient de diffusion sous les propriétés de transport un et le transport des espèces diluées. Faites un clic droit sur transport d’espèces diluées pour ajouter une deuxième propriété de transport deux et sélectionnez la deuxième barrière dans la sélection du domaine. Dans le cas du transport d’espèces diluées, pour les valeurs initiales un, définir la concentration comme étant nulle.Faites un clic droit sur transport d’espèces diluées pour ajouter une deuxième valeur initiale deux et sélectionner le donneur comme troisième domaine. Définir la concentration comme concentration initiale de la substance donneuse fluorescente. Faites un clic droit sur le transport des espèces diluées pour ajouter la symétrie un et sélectionnez toutes les surfaces de la sélection de frontière qui reflètent la géométrie entière.Faites un clic droit sur le maillage pour ajouter deux tétraèdres libres et définir la deuxième barrière comme domaine. Faites un clic droit sur le tétraédrique libre pour ajouter la taille du maillage prédéfini à extra-fin. Dans le deuxième tétraèdre libre, définissez l’accepteur et le donneur en tant que domaines et le maillage prédéfini à plus fin.Ensuite, sous la première étude, cliquez sur calculer pour démarrer la simulation. Pour ajuster le coefficient de diffusion aux données générées par la simulation de diffusion, ouvrez le menu Ajouter un psychique et sélectionnez mathématiques. Localisez l’optimisation et la sensibilité.Sélectionnez optimisation et cliquez sur Ajouter au composant. Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris sur les définitions pour ajouter des variables et entrez manuellement les variables de la table trois. Ensuite, sous le menu de couplage des composants, cliquez avec le bouton droit de la souris sur les définitions, ajoutez une moyenne suivie de l’ajout manuel de l’accepteur comme nom d’opérateur et sélectionnez le domaine un.Exportez les données expérimentales dans un nouveau document texte. Utilisez un point-virgule pour séparer les données en colonnes et un saut de ligne pour séparer les données en lignes. Faites un clic droit sur optimisation pour ajouter l’objectif global des moindres carrés et joignez le document texte aux données expérimentales.Cliquez sur l’objectif des moindres carrés globaux pour définir la première colonne en tant que première colonne de temps et la deuxième colonne en tant que première colonne de valeur. Dans la colonne expression de valeur, entrez la variable C.Clic droit sur optimisation pour ajouter les variables de contrôle globales une. Et déclarez la recherche de trait de soulignement D en tant que variable avec une valeur initiale de un, une limite inférieure de zéro et une limite supérieure de 1 000.Faites un clic droit sur la première étude pour ajouter l’optimisation. Et sélectionnez SNOPT comme méthode de solveur d’optimisation. Réglez la tolérance d’optimalité à un à la puissance moins huit.Réglez ensuite le coefficient de diffusion sur la barrière sur D.Réglez le temps de simulation à l’étude de zéro seconde à 22 000 secondes avec un intervalle de 100 secondes et cliquez sur calculer pour commencer l’optimisation des paramètres. L’analyse histologique d’un modèle de cellule de collagène révèle une légère coloration des fibroblastes au sein de la matrice centrale. Au sommet de la matrice de collagène, une couche contenant de nombreux noyaux probablement constitués de kératinocytes humains adultes à faible teneur en calcium et à haute température peut être observée.L’utilisation du sel de sodium de fluorescéine et de l’isothyocyanate de fluorescéine vérifiée l’impact de la taille moléculaire de la substance diffusante révèle que pour les petites tailles moléculaires, la simulation et les données expérimentales sont en bon accord pour les deux molécules. Cependant, les tailles moléculaires plus grandes génèrent des écarts plus élevés dans les progressions des courbes dans les simulations, démontrant un retard au début et une augmentation plus forte au cours ultérieur des graphiques. En effet, le coefficient de perméation diminue à mesure que la taille moléculaire augmente, les coefficients simulés se comportant de manière similaire aux coefficients de perméabilité expérimentaux.Il convient de noter que la plupart des modèles qui utilisent des kératinocytes humains adultes à faible teneur en calcium et à haute température ont des coefficients de perméation et de diffusion inférieurs à ceux des modèles sans kératinocytes humains adultes à faible teneur en calcium et à haute température. Le modèle de simulation de collagène peut être établi en 11 à 12 jours et la mesure de la perméation peut être effectuée en six heures si elle est effectuée correctement. Lors de l’exécution de la procédure, il est important de maintenir constantes les conditions limites telles que la température, le volume de remplissage, la concentration de la substance appliquée, l’humidité et le processus membranaire afin de réduire la variation du coefficient de perméation.Avec l’aide de cette simulation de module, l’effort expérimental peut être réduit et les performances à long terme peuvent être prédites. Il peut également être adapté à d’autres dispositifs de perméation ou à des systèmes de propriété d’organes. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des applications pharmaceutiques et cosmétiques ainsi qu’au développement interactif en ingénierie tissulaire pour explorer les processus de perméation par diffusion dans les tissus artificiels.

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La barrière hémato-encéphalique humaine empêche sélectivement la pénétration des molécules hydrophiles et des agents pathogènes dans le cerveau. Plusieurs pathologies, y compris la méningite et le délire postopératoire, sont associées à une perméabilité accrue de la barrière hémato-encéphalique. Ici, nous décrivons un modèle de culture cellulaire endothéliale pour tester la perméabilité de barrière par traversal microbien.

Analyse de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique par traversale microbienne à travers les cellules endothéliales microvasculaires

Ce protocole présente un modèle biomimétique 3D avec compartiment stromal fibrotique d’accompagnement. Préparé avec des hydrogels physiologiquement pertinents dans des rapports imitant les propriétés biophysiques de la matrice extracellulaire stromal, un médiateur actif des interactions cellulaires, de la croissance tumorale et de la métastase.

Un modèle biomimétique pour le cancer du foie pour étudier les interactions tumeur-stroma dans un environnement 3D avec tunable propriétés bio-physiques

Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

Ce rapport fournit des protocoles d’assemblage, de culture cellulaire et de dosage sur la plateforme μSiM pour la construction de modèles de barrière hémato-encéphalique.

Utilisation de la plateforme tissulaire barrière MicroSiM (μSiM) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique

Nous présentons un protocole pour la production à haut débit de canaux vasculaires avec des tailles flexibles et des motifs souhaités sur une plaque standard à six puits en utilisant la technologie de bio-impression 3D, appelée vaisseaux sur plaque (VOP). Cette plateforme a le potentiel de faire progresser le développement de traitements pour les troubles associés à l’endothélium compromis.

Procédé de bio-impression à haut débit pour modéliser la perméabilité vasculaire dans des plaques standard à six puits avec flexibilité de taille et de motif

Découvrez une méthode de simulation pour déterminer la perméabilité et la diffusion dans des modèles de peau 3D utilisant un système à inserts membranaires. Cette technique optimise les paramètres pour l'ingénierie tissulaire pharmaceutique et cosmétique.

Une méthode de détermination et de Simulation de perméabilité et de la Diffusion dans un modèle de tissu 3D dans une Membrane insérer système pour plaques multipuits (Vidéo) | JoVE Journal

Une méthode de détermination et de Simulation de perméabilité et de la Diffusion dans un modèle de tissu 3D dans une Membrane insérer système pour plaques multipuits

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