Un plexus choroïde épithéliale Modèle base de cellules de la barrière Fluid Human Blood-céphalo-rachidien pour étudier l'infection bactérienne du côté basolatéral

L’objectif global de cette méthode est de générer un modèle basé sur des cellules épithéliales du plexus choroïde de la barrière hémato-céphalo-rachidien humaine. Permettre l’étude des infections bactériennes du côté basal-latéral. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les maladies infectieuses du système nerveux central, telles que les processus impliqués lors des interactions bactériennes avec l’épithélium du plexus choroïde.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’analyser les interactions des agents pathogènes avec la face noire latérale basale des cellules épithéliales. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres études telles que l’étude de la transmigration des cellules immunitaires et des cellules tumorales à travers l’épithélium du plexus choroïde. J’ai eu l’idée d’utiliser le papillome du plexus chorcoïde humain, ou cellules HIBCCP, pour cette méthode lorsque j’ai lu le manuscrit de 2005 de Shibata et.al.

décrivant la lignée cellulaire. Commencez par utiliser une pince stérile pour placer des inserts filtrants de culture cellulaire de 0,33 centimètre carré, avec des pores de trois microns à l’envers dans des puits individuels d’une plaque à douze puits. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, inondez le puits avec environ trois millilitres de milieu préchauffé, en aspirant toute solution supplémentaire, jusqu’à ce que le compartiment inférieur soit à peine rempli.

Ensuite, ajoutez 100 micromètres de milieu de sous-culture à 37 degrés complété par dix pour cent de FCS sur le dessus du filtre. Lors de l’ajout du milieu, il est très important d’éviter la génération de bulles d’air, car les bulles empêcheront les cellules d’être suffisamment alimentées. Lorsque le milieu a été ajouté à tous les inserts, couvrez la plaque et transférez les inserts dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2.

Maintenant, lavez une fiole de cellules HIBCPP avec dix millilitres de PVS, deux fois en tourbillonnant. Après le deuxième lavage, ajoutez trois millilitres de 0,25 % de tripsyn EDTA dans les cellules et faites tourner le flacon. Ensuite, incubez les cellules pendant une vingtaine de minutes.

À la fin de l’incubation, vérifiez que les cellules se sont soulevées du fond du ballon et qu’elles présentent une forme ronde. Les cellules ne se détachent pas complètement les unes des autres et se trouvent souvent en agglomérats. Remettez la culture en suspension avec 17 millilitres de milieu pour arrêter la réaction et transférez la suspension dans un tube de 50 millilitres.

Ensuite, faites tourner les cellules et remettez la pastille en suspension dans un volume approprié de milieu pour le comptage. Ensuite, diluez les cellules à une fois dix à six cellules par millilitre de concentration et retournez le tube pour répartir uniformément les cellules. Ensuite, ajoutez 80 microlitres de cellules en haut de chaque insert filtrant.

Lorsque tous les inserts ont été ensemencés, couvrez la plaque et remettez-la dans l’incubateur pour une culture pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez un millilitre de milieu dans chaque puits d’une assiette de 24 puits. Ensuite, à l’aide d’une pince, soulevez chaque insert et jetez le milieu à l’intérieur, en plaçant les inserts à l’endroit dans les puits individuels de la plaque à 24 puits.

Lorsque les inserts filtrants sont retournés de la plaque à 12 puits à la plaque à 24 puits, veillez à ne pas toucher la membrane filtrante avec les cellules qui poussent sur le dessus. Remplissez les inserts avec 0,5 millilitre de milieu frais et remettez la plaque dans l’incubateur. Transférez les inserts dans une nouvelle plaque à 24 puits avec du milieu frais tous les deux jours, remplaçant ainsi le milieu dans le compartiment supérieur.

Pour mesurer la résistance électrique trans-épithéliale, ou TEER des cellules, plongez d’abord les pointes des électrodes d’un volt-ohmmètre de tissu épithélial dans de l’éthanol à 80 %. Après 15 minutes, retirez l’électrode de l’éthanol pour permettre à l’électrode de sécher. Ensuite, placez les pointes dans une aliquote de milieu de sous-culture pendant encore 15 minutes.

Lorsque l’électrode s’est équilibrée, positionnez le bras le plus long de manière à ce qu’il touche le bas du compartiment inférieur d’un puits de la plaque de culture cellulaire, et le bras le plus court de manière à ce qu’il atteigne le compartiment de l’insert filtrant. Mesurez les valeurs de résistance des inserts filtrants de culture cellulaire dans un milieu sans cellules pour obtenir les valeurs à blanc. Ensuite, mesurez le FEER de chacun des inserts ensemencés.

Après la mesure, replacez l’électrode dans de l’éthanol à 80 % pendant 15 minutes, puis stockez-la dans un tube sec. Lorsque les valeurs TEER des inserts ensemencés HIBCPP dépassent 70 ohms par centimètre carré, renouveler le milieu en utilisant un milieu de culture frais complété par cinq microgrammes par millilitre d’insuline et un pour cent de FCS, et remettre la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Pour déterminer la perméabilité paracellulaire des cultures d’insert, ajoutez 50 microgrammes par millilitre d’inuline FITC fraîchement préparée dans un milieu de culture de sérum frais à faible teneur en sérum dans le compartiment filtrant supérieur de chaque insert, et retournez les cellules dans l’incubateur.

Lorsque les cultures ont atteint un TEER d’environ 500 ohms par centimètre carré, infectez les cellules avec une suspension bactérienne d’intérêt à une multiplicité d’infection de dix, et retournez les cellules dans l’incubateur pour la période de culture appropriée. Ensuite, lavez les cellules trois fois en transférant le filtre dans un nouveau puits avec un millilitre de milieu sans sérum. À chaque fois, placez le milieu dans le compartiment filtrant avec 500 microlitres du même milieu, enfin, déterminez la concentration d’inuline qui est passée du compartiment filtrant à travers la couche cellulaire après l’infection bactérienne en prélevant des échantillons de milieu dans le puits inférieur de chaque insert filtrant de culture cellulaire, et en mesurant tous les échantillons dans un lecteur de microplaques contre dix une et deux dilutions standard FITC-inuline.

Les cellules HIBCCP présentent des fonctions barrières spécifiques qui leur permettent de restreindre leurs échanges moléculaires à un degré modeste. Par exemple, les analyses immunofluorescentes de la jonction de type associée à la protéine, ZO-1, Occludin et Claudin-1, révèlent un signal ininterrompu aux sites de contact entre cellules. Illustrant l’interconnexion des cellules par des brins continus de jonctions serrées.

Lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions appropriées, les cellules HIBCPP présentent un potentiel membranaire élevé, qui atteint jusqu’à environ 500 ohms par centimètre carré sans traitement, maintenant les fonctions de barrière typiques de la barrière hémato-céphalo-rachidienne, comme la formation d’un potentiel membranaire, ainsi qu’une faible perméabilité pour les macromolécules. Cependant, à mesure que des concentrations croissantes de DMSO sont appliquées, les valeurs TEER diminuent de manière dose-dépendante, avec une baisse significative similaire de la valeur TEER observée après un traitement à la cytochalasine D. De plus, l’ajout de deux pour cent en volume de DMSO, ou cytochalasine D, entraîne une augmentation significative de la perméabilité correspondante pour le flux de FITC-inuline.

De plus, l’infection bactérienne des cellules HIBCCP entraîne une invasion significative de la couche cellulaire par deux souches bactériennes pathogènes. MC58, et son mutant déficient en capsules. Alors que seule une invasion mineure est observée pour la souche apathogène alpha 14.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas toucher la membrane du filtre après l’ensemencement des cellules, car la couche intacte de HIBCCP sera perturbée par le contact. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que les tests de transmigration in vitro peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les mécanismes de migration des cellules immunitaires et tumorales à travers les cellules épithéliales du plexus choroïde. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la pharmacologie pour explorer le transfert de substrats à travers l’épithélium du plexus choroïde in vitro.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’un modèle basé sur des cellules HIBCCP de la barrière hémato-céphalo-rachidien pour l’infection latérale basale par des agents pathogènes. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail sous une cagoule de sécurité appropriée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.