Name: Un plexus choroïde épithéliale Modèle base de cellules de la barrière Fluid Human Blood-céphalo-rachidien pour étudier linfection bactérienne du côté basolatéral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez une méthode pour modéliser la barrière sang-liquide céphalo-rachidien avec des cellules épithéliales du plexus choroïde HIBCPP. Cette technique permet d'étudier les infections bactériennes depuis le côté basolatéral et d'analyser les interactions pathogènes.

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Les auteurs tiennent à remercier le Prof. Hartwig Wolburg pour la réalisation de la microscopie électronique.

1. Préparer Culture cellulaire Filter Inserts pour cellules Semis HIBCPP dans un système Inverted Modèle <ol><li> Préchauffer DMEM / F12 (HAM) supplémenté avec 5 pg / ml d&#39;insuline, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 10% de sérum de foetus de veau (FCS). </li><li> Utiliser des pinces stériles pour placer la zone de croissance des inserts de filtres de culture cellulaire 0,33 cm² avec une taille de pores de 3 um à l&#39; envers dans une plaque à 12 puits (figure 1E). </li><li> Remplissage moyen dans le compartiment inférieur de la culture cellulaire élément filtrant (environ 3 ml) et 100 ul sur le dessus de la cartouche filtrante. Inonder la plaque ainsi que le compartiment inférieur avec le milieu. Aspirer le milieu en excès de telle manière que le compartiment inférieur de la garniture de filtre reste rempli (figure 1E). Note: Il est recommandé d&#39;utiliser une pipette sérologique pour cette étape. </li><li> Couverture plaque de 12 puits avec le couvercle et transférer les inserts filtrants disposés de culture de cellules dans l&#39;incubateur à 37 ° C,5% de CO 2 jusqu&#39;à ce que l&#39; addition de cellules. </li></ol> 2. La culture et repiquage des cellules HIBCPP <ol><li> Préparer DMEM / F12 (HAM) supplémenté avec 5 pg / ml, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 10% de FCS. </li><li> moyen pré-chaud et PBS dans un bain d&#39;eau C 37 °. milieu de Aspirer de flacon. Ajouter 10 ml de PBS dans le ballon et tourbillonnement. Répétez cette étape une fois. </li><li> Ajouter 3 ml de 0,25% de trypsine-EDTA dans le flacon et tourbillonnement. Placer dans l&#39;incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Après environ 20 minutes enlever le ballon de l&#39;incubateur. Faire en sorte que les cellules se détachent du fond du flacon et présentent une forme ronde au moment du sondage au moyen du microscope. Remarque: Les cellules ne se détachent pas complètement l&#39;une de l&#39;autre et sont souvent trouvés dans les agglomérats. Il est recommandé d&#39;utiliser les cellules jusqu&#39;à passage 38. </li><li> Pour arrêter trypsinisation ajouter 17 ml de milieu. Resuspendre les cellules par pipetage de haut en bas et de transférer la suspensiondans un tube de 50 ml. Centrifuger à 50 xg pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de milieu et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Remarque: La concentration des cellules remises en suspension HIBCPP doit être de 1 x 10 6 cellules / ml. Pour le maintien de cellules HIBCPP il est proposé de transférer une quantité de 1-6 x 10 6 cellules dans 10 ml de milieu dans un flacon T75,. Changer le milieu tous les deux jours. </li></ol> 3. Semis cellulaire Inversé Culture Filter Inserts avec cellules HIBCPP <ol><li> Au - dessus de chaque cartouche de filtre inversé ( à savoir le côté inférieur du filtre) , ajouter 80 pl de suspension cellulaire (p. 8 x 10 4 cellules) (figure 1E). Remarque: Assurez-vous que les cellules sont réparties uniformément dans la suspension en inversant le tube avant l&#39;ensemencement. </li><li> Couvrir les inserts de filtre de culture ensemencé des cellules avec le couvercle de la plaque de 12 puits et transfert à l&#39;incubateur, 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Le premier jour, remplir 1 ml de milieu dans les puits d&#39;une plaque de 24 puits. Soulever la culture cellulaire inserts de filtre en utilisant une pince sur la plaque de 12 puits, jeter le milieu à l&#39; intérieur, tourner les inserts de filtre et les placer dans l&#39;orientation standard dans la plaque 24 puits préparée (figure 1E). </li><li> Placez les cellules dans un milieu frais tous les deux jours. Préparer 24 puits avec du milieu frais et transférer les inserts de filtre à elle. Remplissez inserts avec 0,5 ml de milieu frais. Vérifiez TEER tous les jours, comme décrit dans la section 4. </li><li> Lorsque les valeurs TEER des cellules ensemencées sur HIBCPP inserts de culture cellulaire est supérieure à 70 Ω x cm (environ 4 jours après le semis), puis continuer la culture de cellules dans un milieu contenant 1% de FCS et 5 pg / ml d&#39;insuline. Préparer des plaques à 24 puits avec 1 ml de milieu pour chaque puits. Transfert inserts de filtre pour les puits préparés et moyen d&#39;échange dans le compartiment supérieur. Remarque: Ce retrait de sérum après la confluence conduit à la formation deun potentiel de membrane supérieur. </li><li> milieu Aspirer du compartiment de filtration, transfert au bien préparé et remplir avec 500 ul de milieu. Répétez cette étape une fois. Mettez les cellules pendant la nuit dans l&#39;incubateur, 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 4. Mesure de la résistance électrique transépithélial (TEER) <ol><li> Immerger les pointes d&#39;électrodes de voltohmmeter de tissu épithélial pendant 15 min dans 80% d&#39;éthanol. Transfert voltohmmeter sous le capot et laisser électrode sèche pendant un moment. Placer l&#39;électrode dans un milieu de culture respectif utilisé pour les cellules pendant encore 15 minutes pour atteindre l&#39;équilibre. </li><li> Effectuer des mesures en positionnant le bras le plus long de l&#39;électrode, de façon à ce qu&#39;elle touche le fond du compartiment inférieur à chaque fois, placer le bras le plus court dans le compartiment de cartouche de filtre. Note: Les valeurs de résistance de culture cellulaire inserts filtrants sans cellules dans le milieu doit être utilisé en tant que valeurs vides ((valeur mesurée (Ω) - valeur à blanc (Ω)) x filtrela surface ( à savoir 0,33 cm)). </li><li> Après avoir mesuré lieu l&#39;électrode arrière dans 80% d&#39;éthanol pendant 15 min. Conserver dans un tube sec. </li></ol> 5. Détermination de la perméabilité paracellulaire <ol><li> Dissoudre 1 g de FITC-inuline dans 200 ml de milieu de culture supplémenté avec 5 pg / ml d&#39;insuline à 1% de FCS. Appliquer 50 pg / ml de la solution dans le compartiment supérieur du filtre avant l&#39;infection des cellules. </li><li> Après l&#39;infection de prélever des échantillons de la moyenne inférieure et de déterminer combien inuline passé du compartiment du filtre à travers la couche cellulaire. </li><li> Préparer une solution standard FITC Inuline et effectuer des dilutions 1: 2, 10 fois (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% et 0%) . Déterminer la fluorescence par la mesure de tous les échantillons dans un lecteur de microplaques. </li></ol> 6. Préparation des bactéries pour l&#39;infection de cellules HIBCPP sur culture cellulaire Filtre Inserts <ol><li> Un jour avant l&#39;expérience, scrape til N. congelé meningitidis souches hors glycérol-stock et strie sur Chocolate Agar avec Vitox. Croître pendant une nuit dans l&#39;incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Extraire 20-30 colonies de la culture pendant une nuit et transférer dans un tube contenant 8 ml Proteose Peptone milieu additionné de 0,042% de NaHCO 3, de 0,01 M de MgCl2 et 1% Polyvitex. </li><li> Agiter les bactéries pendant 1,25 heure à 220 tours par minute, 37 ° C. Sédimenter les bactéries par centrifugation à 2684 g pendant 10 min à température ambiante. Rejeter le surnageant et resuspendre le culot bactérien avec un milieu sans sérum 8 ml. Vortex pour assurer une suspension uniforme. </li><li> Pour déterminer la densité de la culture, mesurer une dilution de 1:10 à une densité optique (DO) de 600 nm. Ajuster la suspension bactérienne à une DO 600 de 0,1. Remarque: Cette suspension contient environ. 1 x 10 8 CFU / ml. </li><li> Pour confirmer que la concentration de cellules bactériennes, on dilue la suspension par étapes (1:10) jusqu&#39;à unedilution de 10 -5 et plaque sur des plaques de gélose chocolat. Remarque: des dilutions en série similaires doivent être effectuées pour calculer les courbes de croissance bactérienne. </li></ol> 7. Infection des cellules HIBCPP sur culture cellulaire Filtre Inserts et détermination de bactéries Invasion par Double immunofluorescence <ol><li> Après avoir poursuivi la culture de cellules dans un milieu contenant 1% de FCS et 5 pg / ml d&#39;insuline, de mesurer les cellules chaque jour en utilisant un voltohmmeter de tissu épithélial. Si les cellules ont atteint un TEER d&#39;environ 500 Ω x cm², effectuer l&#39;infection. </li><li> Infecter les cellules avec la suspension bactérienne préparée à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 10. Stockez les cellules infectées dans l&#39;incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant la période de temps indiquée. Remarque: Le MOI peut être calculé en prenant en compte le nombre de cellules par culture cellulaire élément filtrant à confluence (1.21 x 10 6 cellules / cm 2). </li><li> Arrêtez le infections en lavant trois fois avec du milieu sans sérum 500 ul (SFM) contenant de l&#39;albumine de sérum bovin à 1% (BSA) appliquée sur le compartiment du filtre, 1 ml dans le compartiment inférieur. </li><li> Poulie à 500 pi contenant un tampon GFD BSA à 1% dans le compartiment du filtre et 1 ml dans le compartiment inférieur pendant 20 min à température ambiante pour empêcher l&#39;adhérence des anticorps dirigés contre des sites de liaison non spécifiques. </li><li> Incuber avec 100 ul anticorps primaire anti- N. meningtidis α-OMP (1: 200) dans le compartiment du filtre et à 500 pi dans le compartiment inférieur pendant 20 min à température ambiante. Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée. </li><li> Laver les cellules en aspirant le milieu à partir du compartiment de filtre, transférer la cartouche filtrante à un GFD puits avec 1 ml préparée contenant 1% de BSA et de remplir le compartiment du filtre à vide SFM 500 ul contenant 1% de BSA. Répéter deux fois cette étape. </li><li> Fixer les cellules avec 500 pi 4% de formaldéhyde dans le compa filtrertement, 1 ml dans le compartiment inférieur pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules en aspirant le milieu à partir du compartiment de filtre, transférer la cartouche filtrante à un puits préparé avec 1 ml de PBS et remplir le compartiment du filtre vide avec 500 ul de PBS. Répétez cette étape une fois. Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit dans du PBS à 4 ° C. </li><li> Coupe la culture cellulaire fixe filtre des inserts et laver avec 250 pl de PBS contenant 1% de BSA. Incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante avec 250 ul fluorescent marqué (longueur d&#39;onde d&#39;excitation 594 nm) de poulet anticorps secondaire anti-lapin (1: 500) pour colorer les bactéries extracellulaires. Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 250 pl de PBS contenant 1% de BSA et 0,5% de Triton X-100 pendant 1 heure à température ambiante. Laver les cellules trois fois avec 250 ul de PBS contenant 1% de BSA. </li><li> Incuber avec 250 pi de l&#39; anticorps primaire anti- N. meningitidis </em&gt; α-OMP (1: 200) pendant 30 minutes pour colorer les bactéries extra- et intracellulaires. Laver les cellules trois fois avec 250 ul de PBS contenant 1% de BSA. </li><li> Appliquer 250 pi de marquage fluorescent (excitation de longueur d&#39;onde 488 nm) d&#39;anticorps secondaire (1: 500), marqué par fluorescence (excitation de longueur d&#39;onde 660 nm) phalloïdine (1: 250) et 4&#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ( 1: 50 000) pendant 1 h à température ambiante pour colorer les bactéries extra- et intracellulaires, et les noyaux cytosquelette d&#39;actine. Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 250 ul de PBS contenant 1% de BSA. Incluez les cellules dans un milieu et conserver à 4 ° C de montage jusqu&#39;à l&#39;examen par microscope. </li><li> Déterminer le nombre de bactéries envahies par champ prédéfini. Pour ce faire, en comptant 20 champs par membrane filtrante. Calculer le pourcentage de bactéries envahies. Remarque: Multipliez le nombre de bactéries moyenne des 20 champs microscopiques avec une Coeffic zoneient. Le résultat exprime la quantité de bactéries totales présentes dans un 0,33 cm² culture cellulaire élément filtrant. Diviser cette valeur par la quantité de bactéries cultivées dans un milieu pendant la durée de l&#39;infection. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les cellules épithéliales du CP forment le BCSFB qui sépare le LCR de 2,3 sanguin. Nous avons récemment établi la lignée cellulaire HIBCPP comme un modèle humain fonctionnel du BCSFB. Les cellules présentent des fonctions de barrière importantes du BCSFB in vitro, y compris le développement d&#39;un potentiel de membrane élevé, une faible perméabilité pour les macromolécules, ainsi que la présence de fils continus de TJs 5. Les protéines TJ contribuent à une polarité apicale / basolatérale...

La barrière hémato-céphalorachidien (BCSFB) est l&#39; un des trois sites de barrière entre le sang et le cerveau 1. Corrélat morphologique sont les cellules epitheliales du plexus choroïde (CP) 2,3, une spire endothéliale épithéliale, qui est fortement vascularisée et situé dans les ventricules du cerveau. Le CP sert à produire le liquide céphalorachidien (LCR), ainsi que pour séparer celui-ci du sang. Afin d&#39;obtenir la fonction de barrière, les cellules épithéliales CP présentent une activité faible pinocytose, expriment des transporteurs spécifiques, et sont fortement connectés par un réseau continu de jonctions serrées (TJS) 2,3. Human papilloma du plexus choroïde (HIBCPP) cellules, dérivées d&#39;une maligne plexus choroïde papillome d&#39;une femme japonaise 4, ont été utilisés pour construire une fonctionnelle dans le modèle in vitro de l&#39;BCSFB. HIBCPP cellules présentent quelques caractéristiques d&#39;une BCSFB fonctionnelle que la formation de TJbrins, le développement d&#39;un potentiel de membrane transépithélial élevée qui peut être déterminé que la résistance électrique transépithélial (TEER), et des perméabilités mineures pour macromolécules. En outre, les cellules HIBCPP expriment les transporteurs caractéristiques, qui peuvent servir à réguler le microenvironnement ionique, et de montrer apical / basolateral 5,6,7 de polarité. Le BCSFB a été montré pour fonctionner comme un site d&#39;entrée pour les agents pathogènes (bactéries, virus et champignons) dans le système nerveux central (SNC) 8. L&#39;invasion de pathogènes, y compris Neisseria meningitidis (meningitidis N.), une bactérie à Gram négatif, peut provoquer des maladies graves comme la méningite. Preuve qu&#39;il surmonte la barrière épithéliale protectrice du CP est pris en charge par des observations histopathologiques chez les patients avec une maladie méningococcique présentant des quantités accrues de méningocoques dans les vaisseaux et les cellules CP épithéliales 9,10. Pour gagner l&#39;entrée dans des cellules hôtes bacteria détournent souvent des mécanismes d&#39;endocytose, qui sont médiées par des récepteurs ou déclenchées de surface spécifiques situés sur les cellules hôtes. Depuis les interactions des agents pathogènes avec ces récepteurs peuvent être des espèces modèles spécifiques 11, animaux ne peuvent être consultés dans une mesure restreinte. La lignée cellulaire HIBCPP offre la possibilité d&#39;étudier le processus d&#39;invasion, ainsi que les mécanismes moléculaires sous-jacents dans un système de modèle humain. En utilisant des inserts de culture cellulaire permet d&#39;analyser les interactions des agents pathogènes avec les cellules hôtes à partir de deux côtés de cellule distincts. Beaucoup de bactéries, y compris N. meningitidis, sont fortement soumis à l&#39;impact de la gravité au cours des essais d&#39;infection. Pour une interaction optimale des agents pathogènes avec les cellules HIBCPP au cours des essais, les bactéries sont tout d&#39;abord ajoutés dans le compartiment supérieur du système d&#39;insertion de filtre de culture cellulaire. Pour permettre l&#39; infection de la apical ou du côté de la cellule basolatérale, respectivement, deux variantes du système in vitro ont été established: Dans le système standard de cellules HIBCPP sont ensemencés dans le compartiment supérieur de l&#39;insert filtrant, mimant la situation dans laquelle les micro - organismes sont situés sur le CSF-côté et entrer en contact avec le côté apical des cellules (Figure 1A, C). En revanche, en utilisant les cellules HIBCPP dans un système d&#39;insertion de filtre de culture cellulaire inversée reflète les conditions lorsque les bactéries ont pénétré dans le flux sanguin. Microorganismes diffusent dans le sang et la rencontre CP cellules épithéliales du côté basolatéral (Figure 1B, D). Il convient de noter qu&#39;il a été démontré que , dans ce système de modèle que les bactéries envahissent les cellules d&#39;une manière HIBCPP polaire spécifiquement du côté basolatéral de 5,7 cellulaire. Par la suite à l&#39;infection du CP, les agents pathogènes envahis peuvent être reconnus par le système immunitaire innée par ligature à des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). membres bien décrits des PRR appartiennent à la famille des récepteurs Toll-like (TLR). TLR peut bind à des structures caractéristiques des micro-organismes infectieux, qui sont des modèles de Appelés associés à des pathogènes moléculaires (PAMP). Ligation des récepteurs conduit à l&#39; activation de la cellule hôte en cascade de signalisation qui déclenchent l&#39; expression de cytokines et de chimiokines 12, qui à leur tour stimulent la transmigration des cellules du système immunitaire à travers la BCSFB 13,14. Il a été démontré que les cellules expriment HIBCPP plusieurs TLR au niveau de l&#39; ARNm et que l&#39; infection par N. meningitidis entraîne la sécrétion de plusieurs cytokines et de chimiokines, y compris CXCL1-3, IL6, IL8 et TNFa 15,16. Ici, nous décrivons la culture et l&#39;infection de la lignée cellulaire humaine HIBCPP dans un système d&#39;insert de culture cellulaire inversée qui imite la BCSFB. Ce système modèle permet d&#39;étudier les interactions des agents pathogènes avec la partie pertinente in vivo basolatérale des cellules ainsi que la réponse cellulaire ultérieure.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&aiguë ;,6 diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 12 puits</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 24 puits</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Neisseria meningitidis &alpha ;-OMP</td><td></td><td></td><td>Cet anticorps était un don des Drs H. Claus et U. Vogel (Université de W&uuml ; rzburg, Allemagne)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (poulet anti lapin)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (poulet anti lapin)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de gélose au chocolat</td><td>Biomérieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasine D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES sans Phenolred</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomérieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Milieu sans sérum</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>Thincert inserts de culture cellulaire pour plaques à 24 puits, taille de pores 3 & micro ; m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture tissulaire 75 cm&sup2 ; capuchon rouge stérile</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 avec électrode MERSSTX01</td><td>Millipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

un plexus choroïde épithéliale modèle base de cellules de la barrière fluid human blood-céphalo-rachidien pour étudier l&#39;infection bactérienne du côté basolatéral

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

Les cellules épithéliales du plexus choroïde (CP), situées dans le système ventriculaire du cerveau, forment la barrière hémato-céphalo-rachidien (BCSFB). Le BCSFB a pour fonction de séparer le liquide céphalo-rachidien (LCR) du sang et de restreindre au minimum les échanges moléculaires. Un modèle in vitro du BCSFB est basé sur des cellules dérivées d’un papillome du plexus choroïde humain (HIBCPP). Les cellules HIBCPP présentent des fonctions de barrière typiques, notamment la formation de jonctions serrées (TJ), le développement d’une résistance électrique transépithéliale (TEER), ainsi que des perméabilités mineures pour les macromolécules. Plusieurs agents pathogènes peuvent pénétrer dans le système nerveux central (SNC) via le BCSFB et provoquer par la suite une maladie grave comme la méningite. L’un de ces agents pathogènes est Neisseria meningitidis (N. meningitidis), une bactérie spécifique à l’homme. L’utilisation des cellules HIBCPP dans un système d’insertion filtrante de culture cellulaire inversée permet d’étudier les interactions des agents pathogènes avec les cellules de la BCSFB du côté des cellules basolatérales, ce qui est pertinent in vivo. Dans cet article, nous décrivons l’ensemencement et la culture de cellules HIBCPP sur des inserts de culture cellulaire. De plus, l’infection des cellules par N. meningitidis ainsi que l’analyse des bactéries envahies et adhérentes par double immunofluorescence sont démontrées. Comme les cellules de la PC sont également impliquées dans d’autres maladies, notamment les troubles neurodégénératifs comme la maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaques, ainsi que lors des métastases cérébrales des cellules tumorales, le système modèle peut également être appliqué dans d’autres domaines de recherche. Il offre le potentiel de déchiffrer les mécanismes moléculaires et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Nous décrivons ici la culture et l&#39;infection des cellules HIBCPP dans un système d&#39;insert de culture cellulaire inversée. Ce modèle nous permet d&#39;étudier les mécanismes d&#39;invasion et les voies de signalisation moléculaire sous - jacents du côté de la cellule basolatérale, reproduisant une situation physiologique des bactéries diffusant et entrant dans les cellules épithéliales via le flux sanguin (Figure 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

<classe p='jove_content'>Les cellules épithéliales du plexus choroïde (CP) forment la barrière hémato-céphalo-rachidien (BCSFB). Un modèle in vitro du BCSFB utilise des cellules de papillome du plexus choroïde humain (HIBCPP). Cet article décrit la culture et l’infection basolatérale des cellules HIBCPP à l’aide d’un système d’insertion filtrante de culture cellulaire.

Un plexus choroïde épithéliale Modèle base de cellules de la barrière Fluid Human Blood-céphalo-rachidien pour étudier l&#39;infection bactérienne du côté basolatéral

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

L'objectif général de cette méthode est de générer un modèle basé sur des cellules épithéliales du plexus choroïde de la barrière hémato-encéphalique humaine. Cela permet d'étudier les infections bactériennes à partir du côté basal-latéral. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les maladies infectieuses du système nerveux central, telles que les processus impliqués lors des interactions bactériennes avec l'épithélium du plexus choroïde.Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'analyse des interactions entre les agents pathogènes et la face basolatérale noire des cellules épithéliales. Cette méthode peut également être appliquée à d'autres études, telles que l'investigation de la transmigration des cellules immunitaires et des cellules tumorales à travers l'épithélium du plexus choroïde. J'ai eu pour la première fois l'idée d'utiliser les cellules de papillome du plexus choroïde humain, ou cellules HIBCCP, pour cette méthode en lisant le manuscrit de 2005 de Shibata et al.décrivant la lignée cellulaire. Commencez par utiliser des pinces stériles pour placer des inserts de culture cellulaire avec une surface de croissance de 0,33 centimètre carré et des pores de trois micromètres de taille, retournés, dans des puits individuels d'une plaque de douze puits. Ensuite, à l'aide d'une pipette serologique, inondez le puits avec environ trois millilitres de milieu préchauffé, en aspirant tout excès de solution, jusqu'à ce que le compartiment inférieur soit juste rempli.Ensuite, ajoutez 100 micromètres de milieu de subculture à 37 degrés complété avec 10 % de SFC par-dessus le filtre. Lors de l'ajout du milieu, il est très important d'éviter la formation de bulles d'air, car les bulles empêcheraient les cellules d'être suffisamment nourries. Une fois le milieu ajouté à toutes les inserts, couvrez la plaque et transférez les inserts dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.À présent, lavez un flacon de cellules HIBCPP avec dix millilitres de PVS, deux fois en agitant doucement. Après le deuxième lavage, ajoutez trois millilitres de tripsine-EDTA à 0,25 pour cent aux cellules et agitez le flacon. Incubez ensuite les cellules pendant environ vingt minutes.À la fin de l'incubation, vérifiez que les cellules se sont détachées du fond du flacon et présentent une forme arrondie. Les cellules ne se détachent pas complètement les unes des autres et sont souvent retrouvées en agglomérats. Résuspendez la culture avec 17 millilitres de milieu pour arrêter la réaction et transférez la suspension dans un tube de 50 millilitres.Ensuite, centrifuger les cellules et re-suspendre le culot dans un volume approprié de milieu pour le comptage. Puis, diluer les cellules à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre, et retourner le tube pour répartir uniformément les cellules. Ajouter ensuite 80 microlitres de cellules au-dessus de chaque insert filtrant.Lorsque tous les inserts ont été ensemencés, couvrez la plaque et replacez-la dans l'incubateur pour une culture nocturne. Le jour suivant, ajoutez un millilitre de milieu dans chaque puits d'une plaque 24 puits. Ensuite, à l'aide de pinces, soulevez chaque insert, jetez le milieu à l'intérieur, puis placez les inserts à l'endroit dans des puits individuels de la plaque 24 puits.Lorsque vous retournez les inserts filtrants de la plaque 12 puits vers la plaque 24 puits, faites attention de ne pas toucher la membrane du filtre sur laquelle les cellules sont en cours de croissance. Remplissez les inserts avec 0,5 millilitre de milieu frais, puis remettez la plaque dans l'incubateur. Transférez les inserts dans une nouvelle plaque 24 puits contenant du milieu frais tous les deux jours, renouvelant ainsi le milieu dans le compartiment supérieur.Pour mesurer la résistance électrique transépithéliale, ou TEER, des cellules, immergez d'abord les pointes de l'électrode d'un volt-ohmmètre pour tissu épithélial dans de l'éthanol à 80 pour cent. Après 15 minutes, retirez l'électrode de l'éthanol afin de laisser sécher l'électrode. Ensuite, placez les pointes dans un aliquot de milieu de subculture pendant 15 minutes supplémentaires.Lorsque l'électrode est équilibrée, positionner le bras le plus long de manière à ce qu'il touche le fond du compartiment inférieur d'un puits de la plaque de culture cellulaire, et le bras le plus court de sorte qu'il pénètre dans le compartiment de l'insert filtrant. Mesurer les valeurs de résistance des inserts filtrants pour culture cellulaire dans le milieu dépourvu de cellules afin d'obtenir les valeurs témoins. Ensuite, mesurer la résistance électrique transepithéliale (TEER) de chacun des inserts ensemencés.Après la mesure, replacer l'électrode dans de l'éthanol à 80 pour cent pendant 15 minutes, puis la conserver dans un tube sec. Lorsque les valeurs de résistance transépithéliale (TEER) des inserts ensemencés avec des HIBCPP dépassent 70 ohms par centimètre carré, renouveler le milieu à l'aide d'un milieu de culture frais supplémenté avec cinq microgrammes par millilitre d'insuline et un pour cent de FCS, puis replacer la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Pour déterminer la perméabilité paracellulaire des cultures d'inserts, ajouter 50 microgrammes par millilitre d'inuline marquée à la FITC fraîchement préparée dans un milieu de culture frais à faible teneur en sérum dans le compartiment supérieur du filtre de chaque insert, puis replacer les cellules dans l'incubateur.Lorsque les cultures ont atteint une résistance transépithéliale (TEER) d'environ 500 ohms par centimètre carré, infecter les cellules avec une suspension bactérienne d'intérêt à une multiplicité d'infection de dix, puis replacer les cellules dans l'incubateur pendant la période de culture appropriée. Ensuite, laver les cellules trois fois en transférant le filtre dans un nouveau puits contenant un millilitre de milieu sans sérum. À chaque fois, ajouter le milieu dans le compartiment du filtre avec 500 microlitres du même milieu. Enfin, déterminer la concentration d'inuline ayant traversé le compartiment du filtre à travers la couche cellulaire après l'infection bactérienne en prélevant des échantillons de milieu depuis le puits inférieur de chaque insert de culture cellulaire filtrant, puis mesurer tous les échantillons à l'aide d'un lecteur de microplaques en les comparant à dix dilutions standards de FITC-inuline un et deux.Les cellules HIBCCP présentent des fonctions barrières spécifiques qui leur permettent de limiter modérément leurs échanges moléculaires. Par exemple, les analyses par immunofluorescence des jonctions de type associées aux protéines ZO-1, Occludine et Claudine-1 révèlent un signal ininterrompu au niveau des contacts entre cellules, illustrant l'interconnexion des cellules par des cordons continus de jonctions serrées.Lorsqu'elles sont cultivées dans des conditions appropriées, les cellules HIBCPP présentent un potentiel membranaire élevé, atteignant jusqu'à environ 500 ohms par centimètre carré sans traitement, tout en conservant les fonctions barrières typiques de la barrière hémato-encéphalique, telles que la formation d'un potentiel membranaire ainsi qu'une faible perméabilité aux macromolécules. Cependant, lorsque des concentrations croissantes de DMSO sont appliquées, les valeurs de résistance transépithéliale (TEER) diminuent de manière dépendante de la dose, avec une chute significative similaire observée après un traitement par la cytochalasine D. De plus, l'ajout de deux pourcents en volume de DMSO, ou de cytochalasine D, entraîne une augmentation significative correspondante de la perméabilité au flux d'inuline marquée par la FITC.En outre, l'infection bactérienne des cellules HIBCCP entraîne une invasion importante de la couche cellulaire par deux souches bactériennes pathogènes : MC58 et son mutant déficient en capsule. En revanche, une invasion mineure seulement est observée pour la souche apathogène alpha 14.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne pas toucher la membrane filtrante après l'ensemencement des cellules, car le contact perturberait la couche intacte de HIBCCP. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme les tests de transmigration in vitro, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur les mécanismes de migration des cellules immunitaires et tumorales à travers les cellules épithéliales du plexus choroïde. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en pharmacologie pour explorer le transfert de substrats à travers l'épithélium du plexus choroïde in vitro.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer un modèle cellulaire HIBCCP de la barrière hémato-encéphalique pour une infection basolatérale par des agents pathogènes. N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que de travailler sous une hotte de sécurité appropriée, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Cette vidéo présente un modèle in vitro pour étudier les agents pathogènes traversant la barrière hémato-encéphalique (BHE). Les cellules endothéliales microvasculaires, qui expriment des jonctions serrées, forment une couche endothéliale dans la chambre supérieure, tandis que les neurones, les astrocytes et la microglie représentent le parenchyme cérébral dans la chambre inférieure, séparé par une membrane poreuse. L’infection virale dans le modèle de la BHE imite le passage de l’agent...

Un modèle in vitro pour l’étude du passage d’agents pathogènes de la barrière hémato-encéphalique et de l’infection des cellules cérébrales

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Un plexus choroïde épithéliale Modèle base de cellules de la barrière Fluid Human Blood-céphalo-rachidien pour étudier linfection bactérienne du côté basolatéral (Vidéo) | JoVE Journal

Un plexus choroïde épithéliale Modèle base de cellules de la barrière Fluid Human Blood-céphalo-rachidien pour étudier l'infection bactérienne du côté basolatéral

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