Name: Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Découvrez une méthode immunohistochimique sensible pour cartographier la distribution spatiale des dérivés oxydés de la 5mC dans les tissus cérébraux de souris. Cette technique permet la codétection avec des marqueurs de lignée cellulaire neuronale.

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Nous remercions l’Unité de Microscopie Avancée (School of Life Sciences, University of Nottingham) et l’équipe d’Histologie de l’Unité des Sciences de la Reproduction Humaine du MRC (Edimbourg), l’Institut des Neurosciences de l’ULB et le FNRS pour leur aide et leur soutien. Ce travail a été soutenu par le MRC (MR/L001047/1 à A.D.J.).

Toutes les procédures d&#39;animaux impliqués ont été effectuées en conformité avec l&#39;éthique comité d&#39;examen de l&#39;Université de Nottingham. 1. Sélection de la préparation des tissus Convient pour immunocoloration <ol><li> Générer section de paraffine d&#39;embryons CD1 souris de type sauvage et les tissus du cerveau adulte , comme décrit précédemment 25. Utiliser des coupes de tissus cérébraux fixes soit avec 4% de formaldehyde (FA) , soit 4% de paraformaldehyde (PFA) pour le procédé 25 d&#39; immunocoloration. NOTE: L&#39;utilisation de sections de tissus de paraffine nécessite de-épilation avant l&#39;étiquetage des anticorps. Étant donné que le traitement avec 2-4 M d&#39;acide chlorhydrique (HCl) utilisé dans le protocole pour l&#39;ADN dénaturant est pas compatible avec la plupart des stratégies de recherche d&#39;antigène, nous recommandons l&#39;utilisation soit sections cryo ou microtome pour co-détection de dérivés d&#39;oxydation 5mC avec des protéines des feutres. </li></ol> 2. Dewaxing paraffiniques coupes de tissus incluses &lt;<html> / P&gt; <ol><li> Dans une enceinte de sécurité classe II en marche, laver la paraffine sections de tissu noyées dans une jarre de Coplin rempli de xylène, 2 fois pendant 10 minutes chacune à la température ambiante. NOTE: Il est important d&#39;utiliser le xylène frais comme une élimination incomplète de la paraffine peut conduire à des motifs de coloration incompatibles. </li><li> Après de-épilation à la cire, réhydrater rapidement les coupes de tissus par lavage consécutivement dans 95, 75, et 50% d&#39;éthanol pendant 10 minutes chacun à RT. </li></ol> 3. Fixation et perméabilisation de Cryo et Sections Microtome <ol><li> Fixer les coupes de tissus réhydratés en les plaçant dans les deux froid de la glace 4% PFA ou 4% FA pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Éliminer l&#39;excès de fixatif par lavage des coupes dans du PBS (solution saline de tampon phosphate) pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Perméabiliser les coupes de tissu en plaçant dans une jarre de Coplin remplie d&#39;autocommutateur privé (0,5% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 30 min à température ambiante. Enlever l&#39;excès PBX en lavant les sections peu en PBT (0,01% de Tween 20 dans du PBS). </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. immunocoloration pour Oxi-5mC Dérivés <ol><li> Placer les sections perméabilisées dans du HCl 2 N pendant 60 minutes à la température ambiante pendant une dépurination de l&#39;ADN. NOTE: Bien que des concentrations plus élevées de HCl (par exemple, 4 N) conduisent à une dénaturation de l&#39; ADN plus efficace, ils ne sont pas compatibles pour la co-détection de oxi-Mcs avec DAPI. </li><li> Placer les sections dans 10 mM de Tris-HCl (pH 8,5) pendant 30 min à température ambiante pour neutraliser le HCl. Sinon, laver les sections trois fois pendant 5 minutes chacun dans du PBS. Incuber les sections dans PBT pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirez délicatement le liquide de la zone entourant la section de tissu sans laisser la section de tissu pour sécher complètement à toute étape en agitant doucement la diapositive. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour encercler la section sans toucher la section. NOTE: Le stylo barrière hydrophobe réduit la quantité d&#39;anticorps nécessaire pour teindre le tissu et peut permettre à de multiples sections d&#39;être colorées avec différent anticorps sur la même diapositive. </li><li> Incuber sections dans 100 ul de solution de blocage (10% d &#39;albumine de sérum bovin dans du PBS) pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide. REMARQUE: sauter cette étape ne serait pas affecter l&#39;efficacité de la coloration des bases cytosine modifiés. </li><li> Incuber les coupes de tissus dans 100 pl d&#39;une dilution 1: 5000 d&#39;anticorps monoclonal de souris anti-5hmC et 1: 1000 dilution des anticorps primaires de lapin polyclonal anti-5caC dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide. Vous pouvez également effectuer l&#39;incubation d&#39;une nuit à 4 ° C si nécessaire. NOTE: Les sections traitées sans anticorps primaires peuvent servir de témoins négatifs appropriés pour la procédure de coloration. Les 12,5 jours après sections embryonnaires murines coïtum cérébrales enrichies en 5caC, 5FC et 5hmC 20 peut être utilisé comme témoin positif. </li><li> Retirer les anticorps en excès par lavage des sections dans un bocal rempli de Coplin PBT trois fois pendant 5 min chacun dans un Copjar lin à la température ambiante. NOTE: L&#39; augmentation du volume des solutions de lavage peut réduire la coloration de fond. </li><li> Enlever l&#39;excès de PBT et, si nécessaire, encercler les sections à nouveau avec le stylo barrière hydrophobe PBT contiennent un détergent qui peut affaiblir la barrière hydrophobe. </li><li> Faire une dilution 1: 400 d&#39;anticorps conjugué à HRP de chèvre anti-lapin et une dilution 1: 400 d&#39;âne anti-souris conjuguée à l&#39;anticorps 555 dans une solution de blocage. </li><li> Incuber les coupes de tissus dans 100 pl d&#39; un mélange d&#39;anticorps secondaire à l&#39; étape 4.9 pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide. </li><li> Laver les coupes de tissus dans un bocal de Coplin remplie de PBT trois fois pendant 5 minutes à chaque fois à température ambiante. </li><li> Placer les coupes de tissus dans 100 pl d&#39;une dilution 1: 200 de tyramide dans le tampon d&#39;amplification du signal tyramide pendant 2 minutes à la température ambiante. </li><li> Immédiatement, éliminer la solution de tyramide excès par lavage des lames trois fois pendant 5 minutes dans chacune des PBT. </li><li> carefully enlever l&#39; excès de PBT et couvrir immédiatement les sections avec une goutte d&#39;un milieu de montage (voir la liste des matériaux). </li><li> Placez délicatement une lamelle sur les coupes de tissus et sceller immédiatement la lamelle avec du vernis à ongles. </li><li> Stocker les coupes de tissus à 4 ° C pendant plusieurs heures avant l&#39;examen microscopique. Examinez au microscope à fluorescence à 405, 488 et / ou 555 nm (10 - 40X). </li></ol>

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Bien que la faible abondance rapporté des dérivés d&#39;oxydation 5mC, 5FC et 5caC dans certains tissus présenterait des limitations significatives pour un protocole d&#39;immunohistochimie standard, l&#39;incorporation des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase a permis la détection de ces modifications de la cytosine dans des tissus fixés et des cellules (figure 2) . Cependant, le temps d&#39;incubation optimal avec la solution de tyramide doit être optimisée expérimentalement pour chaque lot individuel de tyramide trousse d&#39;amplification de signal , où une relation linéaire entre l&#39; intensité du signal et la durée de tyramide l&#39; amplification du signal sur la base est observée, pour plus de détails se reporter à Almeida et al. , 2012 26 . En outre, le rapport signal / fond peut être considérablement améliorée en effectuant les lavages dans une jarre de Coplin pour permettre une élimination efficace des anticorps en excès. Après l&#39;incubation avec une solution de tyramide, il est important d&#39;arrêter immédiatement la réaction par un lavage dans une solution de PBT à dfond iminution coloration. Il est essentiel de ne pas laisser les sections sécher à tout moment au cours de la procédure. L&#39;efficacité de l&#39;ADN dépurination peut être améliorée en effectuant la réaction de dépurination à 37 ° C. Tout en utilisant N HCl 4 au lieu de 2 N améliore la coloration des formes modifiées de 5mC utilisant HCl 4 N pour l&#39;ADN dépurination ne permettrait pas co-coloration avec DAPI, car il interagit exclusivement avec de l&#39;ADN double brin. Bien que cette technique peut fournir une évaluation semi-quantitative solide des formes modifiées de bases cytosine où détectable, il ne peut pas être utilisé pour évaluer les niveaux absolus de 5mC ou ses dérivés d&#39;oxydation. Par conséquent, nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;autres complémentaires , mais quantitative approches 16, 19 -24. Depuis la découverte de produits dérivés d&#39;oxydation 5mC dans les génomes de mammifères, plusieurs approches ont été développées pour étudier leurs rôles biologiques 16, 19-24. Bien que ces approChes peuvent être utiles pour déterminer les niveaux absolus de dérivés d&#39;oxydation 5mC, ils ne fournissent pas d&#39; informations sur leur répartition spatiale 20, 26. Nous avons utilisé avec succès la méthode décrite ici pour cartographier la distribution spatiale et la localisation des dérivés d&#39;oxydation 5mC dans différents types de cellules du développement et cerveau adulte 20 En révélant leur distribution spatiale 20, cette technique peut être cruciale pour comprendre les implications biologiques et le sort des dérivés oxydés de 5mC dans divers contextes biologiques où ces dérivés modifiés de 5mC peuvent être détectés , y compris la différenciation cellulaire, le développement et la maladie. En outre, la méthode que nous décrivons ici peut donner des évaluations semi-quantitatives des dérivés oxydés de 5mC dans différents tissus en évaluant la cinétique de la réaction de la peroxydase (qui est proportionnelle à l&#39;intensité de la coloration) à différents temps d&#39;incubation avec tyramide 26.

Méthylation des bases cytosine dans l&#39; ADN (5mC) représente une marque épigénétique majeur trouvé dans les vertébrés génomes associés à la transcription taire 1. 5mC est introduite et maintenue par les ADN méthyltransférases 2-5, et il a été démontré que pour jouer des rôles importants dans un certain nombre de processus biologiques , y compris l&#39; empreinte génomique, inactivation du chromosome X, la différenciation cellulaire, et le développement 3, 6. Par conséquent, la perturbation de la 5mC motifs génomiques est associé à un certain nombre de maladies 7, 8-11. Malgré les progrès dans la compréhension de rôle 5mC dans le développement et la maladie, il est encore largement inconnue reste comment cette marque est enlevée dans le développement et les tissus adultes. Plusieurs mécanismes potentiels de déméthylation de l&#39; ADN ont été proposées récemment , y compris des mécanismes actifs et passifs déméthylation 12, 13, 14, 15. Découverte des produits de 5mC oxydation séquentielle médiées par dix à onze translocation enzymes (TET1 / 2/3) de telle sorte que le 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5 formylcytosine (5FC) et 5 carboxylcytosine (5caC) dans eucaryote ADN 16, 17, 18, ​​19 a incité les spéculations si elles peuvent servir d&#39;intermédiaires de processus de déméthylation d&#39;ADN ou des marques épigénétiques agissent comme stables dans leur propre droit 13. Pendant que la démonstration que le composant de la base de réparation de l&#39; excision, la thymine ADN-glycosylase (TMD) peut lier et supprimer à la fois 5FC et 5caC à partir d&#39; ADN 19, 20 suggère un rôle pour les dérivés 5mC modifiés dans une déméthylation d&#39;ADN actif. Des données récentes montrant que 5FC / 5caC peut moduler le taux de points de processivité ARN II à la participation potentielle de ces marques dans la régulation transcriptionnelle 29. En raison de cette importance biologique potentiel des formes oxydées de 5mC, une gamme de techniques biochimiques et d&#39; anticorps à base ont été employées pour étudier leur distribution génomique et le contenu global 16, 19-24. Étant donné que la plupart des til vertébré les organes sont constitués de différents types de cellules et que la distribution des bases cytosine modifiée est un tissu et le type de cellule spécifique 16-18, 20, 23, 25-27, pour déterminer la distribution spatiale des dérivés 5mC oxydées dans différents tissus devient importante expérimentale tâche nécessaire pour dévoiler leurs fonctions biologiques. La plupart des approches biochimiques et d&#39;anticorps à base ne fournissent aucune information spatiale en ce qui concerne la répartition des formes modifiées de 5mC dans différents tissus et types de cellules. En revanche, les techniques d&#39;immunochimie base peuvent fournir un outil rapide pour l&#39; évaluation de la distribution spatiale et la localisation nucléaire de 5mC 28 et ses dérivés oxydés 20. Cela est dit, la très faible abondance déclarée de 5FC (20 dans chaque 10 6 cytosine) et 5caC (3 dans chaque 10 6 cytosine) dans le génome de la souris 18 représente un défi important pour l&#39; immunochimie standard. Ici,Nous décrivons un procédé immunochimique très sensible qui fournit robuste et une détection rapide de la forme oxydée de la cytosine dans le tissu cérébral de mammifère. En incorporant des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase couplée à une étape d&#39;amplification de signal, ce procédé évite les difficultés de la détection des très faibles quantités de 5FC et 5caC. En outre, cette technique peut être utilisée pour détecter les co-formes modifiées de la cytosine avec des marqueurs spécifiques de la lignée, complétant efficacement d&#39;autres approches pour élucider les fonctions biologiques de ces marques épigénétiques.

<table><tbody><tr><td>Pot Coplin</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-48585-30</td><td>Verre fabriqué</td></tr><tr><td>Xylène</td><td></td><td></td><td>À utiliser uniquement dans une enceinte de sécurité de classe II</td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12821680</td><td>pH 7,5, filtré avant utilisation</td></tr><tr><td>4 % de paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Une fois fabriqué, peut être stocké à -20 &deg ; C dans aliquotes depuis plusieurs mois</td></tr><tr><td>4 % de formaldéhyde&nbsp ; (FA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Une fois fabriqué, il peut être stocké à -20 &deg ; C dans les aliquotes pendant plusieurs mois</td></tr><tr><td>Éthanol, anhydre dénaturé, qualité histologique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td>95, 75, 50 % dans PBS</td></tr><tr><td>0,01 % Tween 20 dans PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>PBT</td></tr><tr><td>0,5 % Triton X-100 dans PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>PBX</td></tr><tr><td>2 N HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71826</td><td>attention extrêmement toxique</td></tr><tr><td>100 mM Tris-HCl&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td>pH ajusté à 8,5</td></tr><tr><td>stylo barrière hydrophobe</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td>pour l’immunohistochimie</td></tr><tr><td>Chambre d’humidité de lame</td><td>Laboratoire de dispositif scientifique</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-5mC souris</td><td>Diagenode</td><td>C15200081</td><td>anticorps primaire monoclonal</td></tr><tr><td>Anticorps anti-5hmC Motif</td><td>actif</td><td>39791</td><td>lapin polyclonal anticorps primaire</td></tr><tr><td>Anticorps anti-5caC</td><td>Motif actif</td><td>61225</td><td>polyclonal de lapin Anticorps primaire polyclonal</td></tr><tr><td>anti-lapin conjugué à la peroxydase Anticorps secondaire</td><td>Dako</td><td>K1497</td><td></td></tr><tr><td>555 Anticorps anti-souris de chèvre 555</td><td>Sondes moléculaires</td><td>A-11005</td><td>&nbsp ; anticorps secondaire</td></tr><tr><td>10 % BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Solution bloquante</td></tr><tr><td>22 x 32 mm Couvercles en verre</td><td>BDH</td><td>406/0188/24</td><td></td></tr><tr><td>Système d’amplification du signal tyramide</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>D’autres anticorps secondaires conjugués au fluorochome peuvent être utilisés pour la co-détection de l’oxi-5mC&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ; Support de montage avec DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr>Vernis <td></td><td></td><td></td>à<td>ongles incolore</td></tr><tr><td>poulet polyclonal anti-GFAP Anticorps polyclonal</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-18598</td><td>dilution 1:400</td></tr><tr><td>anti-NeuN souris anticorps monoclonal</td><td>Merck milipore</td><td>MAB377B</td><td>dilution 1:400</td></tr></tbody></table>

détection des formes modifiées de cytosine utilisation sensible immunohistochimie

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

La méthylation des bases cytosine (5-méthylcytosine, 5mC) se produisant dans les génomes des vertébrés est généralement associée à un silençage transcriptionnel. La 5-hydroxylméthylcytosine (5hmC), la 5-formylcytosine (5fC) et la 5-carboxylcytosine (5caC) sont les bases cytosines modifiées récemment découvertes produites par oxydation enzymatique du 5mC, dont les fonctions biologiques restent relativement obscures. Un certain nombre d’approches allant des techniques biochimiques aux techniques basées sur les anticorps ont été employées pour étudier la distribution génomique et le contenu global de ces modifications dans divers systèmes biologiques. Bien que certaines de ces approches puissent être utiles pour l’évaluation quantitative de ces formes modifiées de 5mC, la plupart de ces méthodes ne fournissent aucune information spatiale concernant la distribution de ces modifications de l’ADN dans différents types de cellules, nécessaire à la compréhension correcte de leurs rôles fonctionnels. Nous présentons ici une méthode très sensible pour la détection immunochimique des formes modifiées de cytosine. Cette méthode permet la co-détection de ces marques épigénétiques avec des marqueurs de lignage protéique et peut être utilisée pour étudier leur localisation nucléaire, contribuant ainsi à déchiffrer leurs rôles biologiques potentiels dans différents contextes expérimentaux.

Pour déterminer la répartition des 5hmC dans des coupes de tissus du cerveau, nous avons effectué des co-détection de cette modification épigénétique avec un marqueur pour les neurones post-mitotiques, NeuN, employant des anticorps 5hmC anti- commerciale qui interagit spécifiquement avec cette marque, mais pas avec d&#39;autres formes de modification cytosine 20, 25. l&#39; analyse immunohistochimique de 5hmC et 5caC distributions dans le cerveau adulte a révélé que , si la coloration 5hmC importante de co-localise avec les cellules positives NeuN, les cellules gliales NeuN négatives possèdent des niveaux inférieurs de 5hmC génomique (figure 1) 20. Nous avons récemment montré que l&#39; oxydation 5mC Tet-dépendante est active pendant la spécification de la lignée de cellules souches neurales (NSC) 20. En dépit d&#39;être immunochimique indétectable dans NSCs, 5FC et 5caC présentent immunocoloration proéminente aux premiers stades de la différenciation neuronale NSCs vers un<html> nd lignées gliales. Ces deux marques accumulent transitoirement en même temps que l&#39; apparence des marqueurs de neuronal précoce et la différenciation gliale 20. Pour déterminer la répartition des 5caC dans la différenciation NSCs nous avons effectués co-coloration de cette marque avec un marqueur GFAP gliale sur les cultures fixes de NNC à 3 jours d&#39;induction de la différenciation gliale. Contrairement à NNC ​​ou astrocytes matures (données non présentées), nous avons observé signal 5caC forte proportion relativement importante des cellules exprimant GFAP dans ces cultures (Figure 2) 20. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig1.jpg" /> Figure 1. Co-immunocoloration de 5hmC (vert) avec NeuN (rouge) dans le tissu adulte cerveau DAPI (bleu). Les canaux individuels et la vue fusionnée sont présentés. Les barres d&#39;échelle sont de 25 um.blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig2.jpg" /> Figure 2. Co-immunocoloration de 5caC avec GFAP dans la culture de NSC au Jour 3 du gliales Différenciation. Les canaux individuels et la vue fusionnée sont présentés. Les barres d&#39;échelle sont de 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54416/54416fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous décrivons ici une méthode immunochimique sensible pour cartographier la distribution spatiale des dérivés d’oxydation 5mC basée sur l’utilisation d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase et l’amplification du signal tyramide.

Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

L'objectif général de ce protocole immuno-chimique est d'évaluer la distribution spatiale des formes modifiées de la cytosine dans divers contextes tissulaires et cellulaires, en se basant sur l'utilisation d'anticorps secondaires conjugués à une peroxydase et d'une amplification du signal par tyramide. Cette méthode permet de surmonter les limites d'autres techniques qui ne fournissent pas les informations spatiales nécessaires à la compréhension de la fonction biologique des formes modifiées de la cytosine. En outre, cette méthode autorise la co-détection des formes modifiées de la cytosine avec des marqueurs protéiques de lignage et peut être utilisée pour étudier leur localisation nucléaire.Pour commencer cette procédure, fixer des coupes de tissus hydratés d'embryons de souris CD1 de type sauvage et de tissus cérébraux adultes en les plaçant soit dans du PFA 4 % glacé, soit dans du FA 4 % pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, éliminer l'excès de fixateur en lavant les coupes dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Puis, perméabiliser les coupes de tissu en les plaçant dans un bocal de Coplin rempli de PBX pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, éliminez l'excès de PBX en lavant brièvement les sections dans du PBT. Placez maintenant les sections perméabilisées dans du HCl 2 N pendant 60 minutes à température ambiante afin de provoquer la dépurination de l'ADN. Transférez ensuite les sections dans du Tris-HCl 10 millimolaire pendant 30 minutes à température ambiante pour neutraliser l'HCl.Alternativement, laver les sections trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBS. Incuber les sections dans du PBT pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, retirer soigneusement le liquide de la zone entourant les sections de tissu.Entre-temps, maintenez les sections tissulaires humides. Utilisez un stylo à barrière hydrophobe pour entourer les sections sans les toucher. Incubez ensuite les sections dans 100 microlitres de solution de blocage pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide.Ensuite, incuber les sections tissulaires dans 100 microlitres d'une dilution 1:5000 d'un anticorps primaire monoclonal de souris anti-5hmC et d'une dilution 1:1000 d'un anticorps primaire polyclonal de lapin anti-5caC dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Alternativement, effectuer l'incubation toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminer l'excès d'anticorps en lavant les sections dans un bocal de Coplin rempli de PBT, trois fois pendant cinq minutes chacune, à température ambiante.Ensuite, retirez l'excès de PBT et, si nécessaire, entourez à nouveau les sections avec un stylo à barrière hydrophobe, car le PBT contient un détergent qui peut affaiblir la barrière hydrophobe. Préparez ensuite une dilution 1:400 d'anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase (HRP) issu de chèvre et une dilution 1:400 d'anticorps secondaire anti-souris conjugué au fluorochrome 555 issu de l'âne dans la solution de blocage. Incubez alors les sections tissulaires dans 100 microlitres du mélange d'anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide.Par la suite, laver les sections de tissu dans un bocal de Coplin rempli de PBT, trois fois pendant cinq minutes chacune, à température ambiante. Ensuite, transférer les sections de tissu dans 100 microlitres de tyramide à une dilution de 1:200 dans le tampon d'amplification du signal au tyramide pendant deux minutes à température ambiante. Le temps d'incubation dans la solution de tyramide doit être optimisé expérimentalement pour chaque lot individuel de kit d'amplification du signal au tyramide, en s'assurant qu'une relation linéaire entre l'intensité du signal et la durée de l'amplification du signal basée sur le tyramide est observée.Immédiatement après, éliminer l'excès de solution de tyramide en lavant les lames trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBT. Retirer soigneusement l'excès de PBT et recouvrir aussitôt les sections d'une goutte de milieu de montage. Poser délicatement une lamelle sur les sections tissulaires et sceller la lamelle avec du vernis à ongles.Ensuite, conserver les coupes de tissu à quatre degrés Celsius pendant plusieurs heures avant l'examen microscopique. Pour déterminer la répartition du 5hmC dans les coupes de tissu cérébral, une détection simultanée de cette modification épigénétique a été réalisée avec un marqueur des neurones post-mitotiques, NeuN. Une analyse immunohistochimique a révélé que, tandis que la coloration marquée de 5hmC colocalisait avec les cellules positives pour NeuN, les cellules gliales négatives pour NeuN présentaient des niveaux plus faibles de 5hmC génomique.Pour déterminer la distribution du 5caC dans les cellules souches neurales en cours de différenciation, une double immunomarquage de ce marqueur a été réalisée avec un marqueur glial, la GFAP, sur des cultures fixes de cellules souches neurales trois jours après l'induction de la différenciation gliale. Contrairement aux cellules souches neurales ou aux astrocytes matures, un signal intense de 5caC a été observé dans une grande proportion de cellules exprimant la GFAP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ huit heures si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit de rassembler tous les réactifs et matériaux prêts avec vos échantillons. Après cette procédure, une imagerie confocale peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la distribution nucléaire des formes modifiées de la cytosine. Cela peut contribuer à élucider leur fonction biologique potentielle.N'oubliez pas que le travail avec du HCl 2 N peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'utilisation d'une hotte de sécurité et d'équipements de protection doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Biology

Biologie

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