Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Nous décrivons ici une méthode immunochimique sensible pour cartographier la distribution spatiale des dérivés d’oxydation 5mC basée sur l’utilisation d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase et l’amplification du signal tyramide.

L’objectif global de ce protocole immunochimique est d’évaluer la distribution spatiale des formes modifiées de cytosine dans divers contextes tissulaires et cellulaires en se basant sur l’utilisation d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase et l’amplification du signal tyramide. Cette méthode surmonte les limites d’autres techniques qui ne fournissent pas les informations spatiales nécessaires à la compréhension de la fonction biologique des formes modifiées de cytosine. De plus, cette méthode permet la co-détection de formes modifiées de cytosine avec des marqueurs de lignée protéique et peut être utilisée pour étudier leur localisation nucléaire.

Pour commencer cette procédure, fixez des sections de tissus réhydratés d’embryons de souris CD1 de type sauvage et de tissus cérébraux adultes en les plaçant dans un froid glacé à 4 % de PFA ou à 4 % de FA pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez l’excès de fixateur en lavant les sections dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, perméabilisez les sections de tissus en les plaçant dans un bocal Coplin rempli de PBX pendant 30 minutes à température ambiante.

Par la suite, retirez l’excédent de PBX en lavant brièvement les sections au PBT. Maintenant, placez les sections perméabilisées dans du HCl 2 N pendant 60 minutes à température ambiante pour la dépurination de l’ADN. Ensuite, transférez les sections dans 10 millimolaires de Tris-Hcl pendant 30 minutes à température ambiante pour neutraliser le HCl.

Vous pouvez également laver les sections trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBS. Incuber les sections dans du PBT pendant cinq minutes à température ambiante. Après cela, retirez soigneusement le liquide de la zone entourant les sections de tissus.

Pendant ce temps, gardez les sections de tissu humides. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour encercler les sections sans les toucher. Par la suite, incubez les sections dans 100 microlitres de solution bloquante pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide.

Ensuite, incubez les sections de tissu dans 100 microlitres d’une dilution de 1:5000 d’un anticorps primaire monoclonal anti-5hmC de souris et d’une dilution de 1:1000 d’un anticorps primaire polyclonal de lapin anti-5caC dans une solution bloquante pendant une heure à température ambiante. Vous pouvez également effectuer l’incubation pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminez l’excès d’anticorps en lavant les sections dans un bocal Coplin rempli de PBT trois fois pendant cinq minutes chacune à température ambiante.

Ensuite, retirez l’excès de PBT et, si nécessaire, encerclez à nouveau les sections avec un stylo barrière hydrophobe car le PBT contient un détergent qui peut affaiblir la barrière hydrophobe. Ensuite, faites une dilution de 1:400 d’anticorps conjugué HRP anti-lapin de chèvre et une dilution de 1:400 d’anticorps conjugué anti-souris 555 d’âne dans une solution bloquante. Ensuite, incubez les sections de tissu dans 100 microlitres du mélange d’anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide.

Ensuite, lavez les sections de tissu dans un bocal Coplin rempli de PBT trois fois pendant cinq minutes chacune à température ambiante. Transférez ensuite les sections de tissu dans 100 microlitres de tyramide à une dilution de 1:200 dans le tampon d’amplification du signal de tyramide pendant deux minutes à température ambiante. Le temps d’incubation pendant lequel la solution de tyramide devrait être optimisée expérimentalement pour chaque lot individuel de kit d’amplification du signal de tyramide où une relation linéaire entre l’intensité du signal et la durée de l’amplification du signal à base de tyramide est observée.

Immédiatement après, éliminez l’excès de solution de tyramide en lavant les lames trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBT. Retirez soigneusement l’excès de PBT et couvrez immédiatement les sections avec une goutte de support de montage. Placez délicatement une lamelle sur les sections de tissu et scellez-la avec du vernis à ongles.

Maintenez ensuite les coupes de tissus à quatre degrés Celsius pendant plusieurs heures avant l’examen microscopique. Pour déterminer la distribution de 5hmC dans des coupes de tissu cérébral, la co-détection de cette modification épigénétique a été réalisée avec un marqueur pour les neurones post-mitotiques, NeuN. L’analyse immunohistochimique a révélé que tandis que la coloration proéminente au 5hmC colocalisait avec les cellules NeuN-positives, les cellules gliales NeuN-négatives possédaient des niveaux plus faibles de 5hmC génomique.

Pour déterminer la distribution de 5caC dans la différenciation des cellules souches neurales, la cocoloration de ce marqueur a été réalisée avec un marqueur glial, GFAP, sur des cultures fixes de cellules souches neurales trois jours après l’induction de la différenciation gliale. Contrairement aux cellules souches neurales ou aux astrocytes matures, un fort signal 5caC dans une grande proportion de cellules exprimant GFAP a été observé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures environ si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’avoir tous les réactifs et matériaux avec vos échantillons prêts. À la suite de cette procédure, une imagerie confocale peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires sur la distribution nucléaire des formes modifiées de cytosine. Cela peut contribuer à déchiffrer leur fonction biologique potentielle.

N’oubliez pas que travailler avec du 2 N Hcl peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles qu’une enceinte de sécurité et des vêtements de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.