Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

L'objectif général de ce protocole immuno-chimique est d'évaluer la distribution spatiale des formes modifiées de la cytosine dans divers contextes tissulaires et cellulaires, en se basant sur l'utilisation d'anticorps secondaires conjugués à une peroxydase et d'une amplification du signal par tyramide. Cette méthode permet de surmonter les limites d'autres techniques qui ne fournissent pas les informations spatiales nécessaires à la compréhension de la fonction biologique des formes modifiées de la cytosine. En outre, cette méthode autorise la co-détection des formes modifiées de la cytosine avec des marqueurs protéiques de lignage et peut être utilisée pour étudier leur localisation nucléaire.

Pour commencer cette procédure, fixer des coupes de tissus hydratés d'embryons de souris CD1 de type sauvage et de tissus cérébraux adultes en les plaçant soit dans du PFA 4 % glacé, soit dans du FA 4 % pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, éliminer l'excès de fixateur en lavant les coupes dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Puis, perméabiliser les coupes de tissu en les plaçant dans un bocal de Coplin rempli de PBX pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, éliminez l'excès de PBX en lavant brièvement les sections dans du PBT. Placez maintenant les sections perméabilisées dans du HCl 2 N pendant 60 minutes à température ambiante afin de provoquer la dépurination de l'ADN. Transférez ensuite les sections dans du Tris-HCl 10 millimolaire pendant 30 minutes à température ambiante pour neutraliser l'HCl.

Alternativement, laver les sections trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBS. Incuber les sections dans du PBT pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, retirer soigneusement le liquide de la zone entourant les sections de tissu.

Entre-temps, maintenez les sections tissulaires humides. Utilisez un stylo à barrière hydrophobe pour entourer les sections sans les toucher. Incubez ensuite les sections dans 100 microlitres de solution de blocage pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide.

Ensuite, incuber les sections tissulaires dans 100 microlitres d'une dilution 1:5000 d'un anticorps primaire monoclonal de souris anti-5hmC et d'une dilution 1:1000 d'un anticorps primaire polyclonal de lapin anti-5caC dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante. Alternativement, effectuer l'incubation toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminer l'excès d'anticorps en lavant les sections dans un bocal de Coplin rempli de PBT, trois fois pendant cinq minutes chacune, à température ambiante.

Ensuite, retirez l'excès de PBT et, si nécessaire, entourez à nouveau les sections avec un stylo à barrière hydrophobe, car le PBT contient un détergent qui peut affaiblir la barrière hydrophobe. Préparez ensuite une dilution 1:400 d'anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase (HRP) issu de chèvre et une dilution 1:400 d'anticorps secondaire anti-souris conjugué au fluorochrome 555 issu de l'âne dans la solution de blocage. Incubez alors les sections tissulaires dans 100 microlitres du mélange d'anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans une chambre humide.

Par la suite, laver les sections de tissu dans un bocal de Coplin rempli de PBT, trois fois pendant cinq minutes chacune, à température ambiante. Ensuite, transférer les sections de tissu dans 100 microlitres de tyramide à une dilution de 1:200 dans le tampon d'amplification du signal au tyramide pendant deux minutes à température ambiante. Le temps d'incubation dans la solution de tyramide doit être optimisé expérimentalement pour chaque lot individuel de kit d'amplification du signal au tyramide, en s'assurant qu'une relation linéaire entre l'intensité du signal et la durée de l'amplification du signal basée sur le tyramide est observée.

Immédiatement après, éliminer l'excès de solution de tyramide en lavant les lames trois fois pendant cinq minutes chacune dans du PBT. Retirer soigneusement l'excès de PBT et recouvrir aussitôt les sections d'une goutte de milieu de montage. Poser délicatement une lamelle sur les sections tissulaires et sceller la lamelle avec du vernis à ongles.

Ensuite, conserver les coupes de tissu à quatre degrés Celsius pendant plusieurs heures avant l'examen microscopique. Pour déterminer la répartition du 5hmC dans les coupes de tissu cérébral, une détection simultanée de cette modification épigénétique a été réalisée avec un marqueur des neurones post-mitotiques, NeuN. Une analyse immunohistochimique a révélé que, tandis que la coloration marquée de 5hmC colocalisait avec les cellules positives pour NeuN, les cellules gliales négatives pour NeuN présentaient des niveaux plus faibles de 5hmC génomique.

Pour déterminer la distribution du 5caC dans les cellules souches neurales en cours de différenciation, une double immunomarquage de ce marqueur a été réalisée avec un marqueur glial, la GFAP, sur des cultures fixes de cellules souches neurales trois jours après l'induction de la différenciation gliale. Contrairement aux cellules souches neurales ou aux astrocytes matures, un signal intense de 5caC a été observé dans une grande proportion de cellules exprimant la GFAP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ huit heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit de rassembler tous les réactifs et matériaux prêts avec vos échantillons. Après cette procédure, une imagerie confocale peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la distribution nucléaire des formes modifiées de la cytosine. Cela peut contribuer à élucider leur fonction biologique potentielle.

N'oubliez pas que le travail avec du HCl 2 N peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'utilisation d'une hotte de sécurité et d'équipements de protection doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.