Name: Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Apprenez le cathétérisme transuréthral chez la souris pour étudier les infections urinaires et comparer les réponses immunitaires entre mâles et femelles. Cette méthode permet d'explorer les différences sexuées en immunologie.

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Nous remercions le Dr Matthieu Rousseau pour une lecture critique du manuscrit et le laboratoire d’immunobiologie dendritiques pour leurs points de vue utiles lors de l’élaboration du présent protocole et le projet. Ce travail a été soutenu en partie par le financement de l’Union européenne septième Programme Marie Curie Action-cadre (PCIG11-GA-2012-3221170 et l’Immuno-oncologie LabEx (ami).

Expériences de souris ont été réalisées conformément à l’approbation du protocole numéro 2012-0024 par le Comité de "éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (le Comité d’éthique pour l’expérimentation animale), en application de la Directive 2010/63 européen UNION EUROPÉENNE.
1. préparation des cathéters
<ol><li>Préparer une canule intraveineuse-accès pédiatrique pour chaque groupe de souris infectées. En utilisant le mécanisme à ressort intégré, dépouiller chaque canule de son aiguille, tel qu’indiqué par le fabricant. Jeter les aiguilles, conservant seulement la canule intraveineuse en plastique.</li>
	<li>Stériliser les cathéters dans une hotte à flux laminaire pour cycle un rayonnement ultraviolet (UV), généralement de 25 à 30 min. Remarque : Cathéters peuvent être utilisés pour plus d’une souris, mais un nouveau cathéter doit être utilisé entre les groupes expérimentaux, sexes ou les souches bactériennes.</li>
</ol>2. préparation des uropathogènes e. coli Infection
<ol><li>Au moins deux jours avant l’infection, en utilisant une boucle de l’inoculation stérile, strie UPEC provenant d’un stock de bactéries congelé sur une gélose de bouillon Luria (LB), contenant des antibiotiques si nécessaire. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. Plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant une semaine.</li>
	<li>Dans un erlenmeyer stérile de 100 ml, ensemencer 10 ml LB, contenant des antibiotiques si nécessaire, avec une seule colonie de la plaque LB et incuber debout à 37 ° C pendant la nuit (environ 16-18 h). Nota : Les cultures permanentes acceptent l’expression de type 1 pili, qui sont nécessaires pour infection23. Cultures cultivées secouant aura moins efficace expression pili et par conséquent, incompatibles taux d’infection.</li>
	<li>Mesurer la densité optique (do)600 , de la culture au jour le jour et calculer le nombre de bactéries / ml à l’aide d’une courbe de croissance prédéterminée. Comme exemple, pour la souche UPEC UTI89, OD600 = 0,35 équivaut à 2 x 108 UFC / ml, ainsi, une culture d’une nuit ou plus avec un OD600 = 2.4 équivaudrait à 13,7 x 108 UFC par ml. déterminer empiriquement la relation entre le OD600 et des bactéries viables avec chaque nouvelle souche utilisée pour l’infection.</li>
	<li>
Déterminer la quantité de bactéries nécessaires en tenant compte du nombre d’animaux infectés et que chaque souris devraient recevoir environ 107 unités formant colonie (UFC) dans 50 µl de PBS. Inclure dans le calcul le volume mort de ~ 130 µl de l’essentiel du cathéter et de la seringue et 100 µl nécessaires pour déterminer l’inoculum.
	<ol>
<li>Faites tourner la suspension bactérienne dans une micro-centrifugeuse table à 17 000 x g pendant 1 min et Resuspendre le culot bactérien qui en résulte à 2 x 108 UFC / ml dans du PBS. En série, diluer une aliquote de cette suspension et la plaque sur une gélose LB, le cas échéant, de déterminer l’inoculum exacte pour chaque infection par des antibiotiques.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dessiner l’inoculum bactérien dans une seringue de 1 ml et fixer le cathéter à l’extrémité de la seringue. Tapez sur la seringue pour enlever tout l’air et appuyer sur le poussoir pour remplir l’espace sans circulation d’air dans le cathéter avant de commencer l’instillation.</li>
</ol>3. préparation des souris
<ol><li>Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de xylazine kétamine et 5 mg/kg de 100 mg/kg. Chauffage d’appoint peut être fourni.</li>
	<li>Veiller à ce que chaque souris sont sous sédation entièrement en serrant le coussinet plantaire avec la pression du fluide. Souris sont entièrement sous sédation lorsqu’ils ne font pas réagir et nécessite 3-5 minutes pour arriver à cet État.</li>
	<li>Placez la souris en position couchée et appliquez une pression moyenne sur le bas-ventre de vider la vessie de l’urine. Vessie pleine envie d’un petit pois sous la peau entre les crêtes ileac. Remarque : Par inhalation isoflurane a été utilisé pour la section des souris femelles15,22, cependant, il n’a pas été testé si les souris mâles sont suffisamment anesthésiés par inhalation isoflurane pour cette procédure.</li>
</ol>4. transuréthrale Instillation de souris femelles
<ol><li>À l’aide de la main non dominante, placez le pouce sur la queue et un doigt de la main sur l’abdomen de la souris et appliquez une légère pression pour s’opposer au sens pour maintenir la souris fermement en place.</li>
	<li>
Placer l’embout du cathéter perpendiculaire à la souris à l’orifice urétral. Avec une pression modérée, glissez le cathéter dans l’urètre, jusqu'à ce que le hub répond à l’orifice urétral, tout en réduisant simultanément la seringue afin qu’elle soit parallèle à la surface de travail. Le cathéter ne nécessite aucun graissage. Ne pas pousser ou forcer le cathéter dans l’urètre. Le cathéter doit glisser en douceur et facilement dans l’urètre, avec peu ou pas de résistance.
	<ol>
<li>Avant d’instiller l’inoculum (étape 4.3), une fois le cathéter est en place, très doucement, tirez la peau abdominale, vers la tête de la souris avec le doigt de la non dominantes à la main qui est déjà sur le ventre de la souris (étape 4.1). Si le cathéter est dans l’urètre, les tissus composant l’orifice de l’urètre ne bougera pas, considérant que si le cathéter est mal placé dans le vagin, les tissus seront déplace vers le haut et loin le cathéter. Ce test rapid devrait être effectué sur chaque souris.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lorsque la plaque tournante du cathéter remplit l’orifice urétral, lentement administrer 50 µl de l’inoculum bactérien. Un taux d’instillation lente réduit les reflux vésico-urétéral dans le rein. Retirer lentement le cathéter pour éviter les fuites, sur un nombre de 5. Placez les souris dans leur cage en position couchée.</li>
</ol>5. transuréthrale Instillation de souris mâles
<ol><li>Placer deux pouce Pince parotidien et direction caudale aux organes génitaux externes de la souris. Rétracter le prépuce pour exposer entièrement le gland du pénis. Une fois que le pénis est placé à l’extérieur, relâcher la pince pouce.</li>
	<li>Repositionner la pince afin de stabiliser le pénis saillant perpendiculairement à l’animal, tenant l’organe doucement mais tendu. Visualiser le méat urétral et soigneusement introduire le cathéter dans la petite ouverture à l’extrémité de l’organe. Guidez le cathéter dans le pénis, vers le corps de la souris, en maintenant une tension douce avec la pince. Le cathéter ne nécessite aucun graissage. Ne forcez pas le cathéter dans le pénis ; le cathéter doit glisser en douceur dans l’urètre, indiquant l’emplacement exact.</li>
	<li>Une fois la plaque tournante du cathéter répond à l’extrémité du pénis, très lentement administrer 50 µl de l’inoculum, tout en conservant la position du pénis. La qualité de l’instillation peut être observée en ce moment selon un score de qualité de l’instillation prédéterminée, comme celui illustré à la Figure 2.</li>
	<li>Retirer le cathéter lentement, au nombre de 5, pour éviter les fuites de l’inoculum. Placez les souris dans leur cage en position couchée. Animaux devrait commencer à récupérer 30-45 min après l’administration de l’anesthésie.</li>
</ol>6. détermination de l’UFC dans les organes infectés
<ol><li>À des moments prédéterminés, sacrifice de souris à l’aide d’approuvé modes opératoires normalisés (par exemple, dislocation cervicale ou surdose de dioxyde de carbone). Humidifier l’abdomen soigneusement avec de l’éthanol 70 % pour minimiser la contamination de la fourrure.</li>
	<li>Faire une incision dans le tiers inférieur de l’abdomen de la souris d’au moins 2 cm à l’aide de ciseaux et aseptiquement enlever la vessie et toute autre organes voulues, y compris mais sans s’y limiter, reins, testicules, vésicules séminales ou glandes préputiales, dans 5 ml bouchon en polypropylène pression tubes contenant 1 ml de PBS stérile. Conserver tous les échantillons sur la glace.</li>
	<li>Homogénéiser les organes avec un homogénéisateur poche jusqu'à ce que presque aucun tissu plein ne reste, environ 15-60 sec selon l’organe. La graisse ne pas bien homogénéiser et est facilement reconnaissable comme le tissu beige-blanc brillant. Jeter la graisse avant ou après homogénéisation. Laver l’homogénéisateur en éthanol suivie de PBS entre chaque expérimentales ou d’un groupe de l’orgue. Remarque : Utilisent généralement les homogénéisateurs poche ou homogénéisateurs de moulin de perle. Alors que tous ces systèmes ont donné des résultats semblables, tel que déterminé par la comparaison directe des CFU bactérienne à 24 heures après l’infection, les conditions optimales d’homogénéiser les tissus de l’hôte tout en préservant la viabilité bactérienne doivent être déterminées de manière empirique avant effectuer régulièrement le présent protocole.</li>
	<li>Effectuer des dilutions successives de suspensions orgue homogénéisé. Plaque des dilutions sur plaques de gélose LB, contenant des antibiotiques lorsque cela est approprié et incuber pendant la nuit (~ 15 h) à 37 ° C. Les souches UPEC ont des temps de doublement très rapides et à ce titre, il faut ne pas Incuber les boîtes de gélose trop longtemps parce que cela va entraver la capacité de compter les colonies individuelles.</li>
</ol>7. cytométrie du tissu de la vessie
<ol><li>Préparer un tampon digestion contenant la collagénase à 34 unités/mL et DNase à 100 µg/mL dans du PBS. Rester sur la glace. Préparer un tube conique de 15 ml par animal à analyser et tampon digestion aliquote de 1 ml par tube.</li>
	<li>À des intervalles prédéterminés, sacrifice de souris à l’aide d’approuvé modes opératoires normalisés (par exemple, la dislocation cervicale ou surdose de dioxyde de carbone). Humidifier l’abdomen soigneusement avec de l’éthanol 70 % pour minimiser la contamination de la fourrure.</li>
	<li>
Faire une incision dans le tiers inférieur de l’abdomen de la souris d’au moins 2 cm à l’aide de ciseaux et enlever tout le boudin. Viande hachée bien avec des ciseaux, découper la vessie en 2-3 mm2 petits morceaux, en général environ 8 morceaux.
	<ol>
<li>Ajouter une vessie hachée par tube contenant un tampon de la digestion. Secouez pour laver les tissus de la vessie hachées dans le tampon de la digestion. Rester sur la glace jusqu'à ce que toutes les outres sont disséqués et hachées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber les vessies hachées pendant 60 à 75 min à 37 ° C, avec une agitation vigoureuse à la main pendant 5 s toutes les 15 min. Lorsque le tissu a un aspect vitreux transparent, qui ressemble à papier de soie humide, la digestion est terminée. Digestion prolongée va supprimer les protéines de surface des cellules nécessaires à l’identification et doit être évitée.</li>
	<li>Inactiver les enzymes de la digestion en ajoutant 2-3 mL de tampon de cytométrie en flux glacee (PBS contenant 2 % sérum fœtal (SVF) et 0,2 mM EDTA) et mélanger doucement. Placer les tubes sur la glace.</li>
	<li>Pour assurer une suspension monocellulaire et supprimer n’importe quel tissu conjonctif, passer le contenu du tube à travers un filtre 100µm placé dans un tube conique de 15 mL. Appuyez doucement sur n’importe quel tissu restant à travers le filtre avec la fin d’un piston de la seringue. Lavez le filtre avec un tampon de cytométrie de flux supplémentaires de 2 mL. Conserver les échantillons sur la glace.</li>
	<li>Laver les échantillons par centrifugation pendant 7 min à 200 x g, 4 ° C. Remettre en suspension les boulettes dans 100 µL écoulement cytometry tampon Fc bloc conteneur, diluée à 5 µg/mL et le transfert d’un 96 puits autour de la plaque inférieure. Après 10-15 min, ajouter 100 µL désiré anticorps cocktail à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant 30-45 min, sur la glace, abri de la lumière. Remarque : Le bloc Fc est un réactif utilisé pour empêcher la fixation de la portion Fc des anticorps dirigés contre les cellules exprimant les récepteurs Fc. Son but est de minimiser les anticorps non spécifiques. Détermination des anticorps à utiliser sera dépendante de l’hypothèse testée dans l’expérience et doit être sélectionnée avec l’apport de la littérature. Dans la Figure 3, pour mesurer l’infiltration de cellules immunitaires dans l’ensemble, un anticorps anti-CD45 était employé, qui est une protéine de pan-immunitaire cellulaire.</li>
	<li>Laver les échantillons par centrifugation pendant 7 min à 200 x g, 4 ° C. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 200 µL de tampon de cytométrie en flux et transmettre des échantillons à travers un tamis de cellule 40 µm sur un tube de 5 ml en polystyrène juste avant acquisition sur un cytomètre en flux.</li>
	<li>Recueillir la totalité de l’échantillon sur le cytomètre en flux. Une bonne digestion produira 200 000-400 000 cellules, avec 8 000-10 000 CD45+ des cellules immunitaires de vessies de souris naïves, tandis que les organes infectés contiendra plusieurs cellules16 (Figure 3). Remarque : Les échantillons préparés pour cytométrie ne peuvent servir à évaluer l’UFC. Il n’est pas recommandé de diviser la vessie en deux parties, car aucune preuve n’existe pour démontrer que la colonisation UPEC ou infiltration de cellules immunitaires est uniforme dans l’ensemble du tissu.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Instillation transuréthrale de souris mâles vous propose de nombreuses nouvelles possibilités de recherche sur l’influence du sexe sur la maladie muqueuse de la vessie, mais présente aussi plusieurs défis. Avant tout, une seule limitation est que l’instillation au départ pourrait pour être techniquement difficile, ce qui entraîne une inflammation excessive durant l’insertion du cathéter. Amélioration de la technique est possible par l’instillation de souris mortes avec une solution colorée, comme colorant bleu d’Evans. P...

Infections des voies urinaires (IVU) sont l’une des infections plus courantes dans les pays développés,1. Les taux d’infection sont similaires entre les femmes et les hommes chez les nouveau-nés et les personnes âgées2. Premenopausal femmes adultes, cependant, ont une incidence beaucoup plue d’UTI extra-hospitalière par rapport aux hommes2,3. Étant donné que cette maladie produit des effets principalement femmes, recherche fondamentale et clinique vise une écrasante majorité le UTI chez les femelles. Toutefois, l’infection urinaire chez les hommes est un défi de santé importants et sous-étudié4. En effet, infection urinaire chez les hommes sont associés à une morbidité plus élevée, ces infections sont habituellement définies sous la forme compliquée4,5.
À mesure que notre compréhension du rôle central des biais de sexe dans la physiologie et la pathologie évolue, nouvelles méthodes sont nécessaires pour explorer cet aspect précédemment négligé de la maladie. Différences entre les sexes jouent un rôle essentiel dans l’immunité et infection ; les femelles ont une incidence plus élevée d’une maladie auto-immune, tandis que les mâles sont plus sensibles à certaines infections, telles que la tuberculose, le paludisme et le VIH6,7. Cancer de la vessie, une autre pathologie urologique, est significativement plus fréquent chez les hommes que chez les femmes, et plusieurs études ont montré un rôle des androgènes dans le développement d’une tumeur maligne8,9,10,11 ,,12. Notamment, toutefois, l’enquête de thérapies intravésicale pour cancer de la vessie est effectuée exclusivement chez les femelles, en raison de l’incapacité de section à plusieurs reprises des souris mâles13.
L’étude de la pathogenèse de l’infection urinaire s’appuie fortement sur les modèles de rongeurs d’infection (par exemple, les souris et rats). Les modèles murins d’infection urinaire peuvent employer uropathogènes isolé à l’origine d’infections humaines, comme uropathogènes e. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcus, Proteusou14. En général, les bactéries sont introduits dans la vessie par cathétérisme de l’urètre. Suite à une infection, des vessies et des reins peut être enlevée pour évaluer les paramètres spécifiques de l’infection, tels que la colonisation bactérienne, des lésions tissulaires ou hôte réponse immunitaire15,16. Universellement, cependant, seulement les animaux femelles sont utilisés pour la recherche de l’UTI. En effet, plusieurs études ont noté que, pour des raisons anatomiques, cathétérisme des souris mâles n’est pas possible de13,17,18,19. Plus récemment, une approche chirurgicale à l’instillation mâle a été décrit, dans laquelle l’abdomen est ouvert, la vessie est déplacée à l’extérieur en appliquant une légère pression à l’ouverture dans l’abdomen et bactéries sont injectées dans la vessie de20. Cette approche permet l’infection masculine, au prix d’une intervention chirurgicale. Ainsi, un bémol majeur de cette approche comprend l’influence de l’inflammation, sur l’issue de l’infection, tels que le potentiel de provoquer une réponse anti-inflammatoire de cicatrisation de l' incision21. Comme nos intérêts incluent la compréhension des préjugés sexuels en réponse à la maladie, nous avons développé une méthode d’instillation intravésicale bactérienne chez les souris mâles qui correspond le mieux à l’approche transuréthrale non-chirurgicale longtemps utilisée chez des rongeurs femelles22 .
Notre modèle s’appuie sur une méthodologie éprouvée et offre la possibilité de comparer directement la réponse immunitaire de hôte à l’infection urinaire chez les animaux mâles et femelles. Cette méthode va permettre la dissection des différences fondées sur le sexe dans l’infection et potentiellement offrir des indices moléculaires et cellulaires pour les différences marquées dans la sensibilité et la réponse à l’infection entre les sexes. En outre, ce modèle a valeur au-delà des études de l’UTI, permettant la mise en place de modèles d’étude d’autres maladies associées à la vessie, comme le cancer de la vessie, prostatite, sous - ou over - active les syndrome de la vessie et la cystite interstitielle.

<table><tbody><tr><td>Cathéters IV blindés BD Insyte Autoguard 24 G, diamètre externe de 0,7 mm, longueur 14 mM</td> Le numéro <td>de catalogue de la 381811 ou 381411*</td>* <td>de BD Medical dépend du pays</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-One</td><td>731171</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller bouillon</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>LB Gélose Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>seringues</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pouce (Adson)</td><td>Outils de science fine</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 5 ml, polypropylène</td><td>Sondes</td> jetables Falcon <td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à capuchon rabattable de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>doivent être aliquottées et stockées à -20 &deg ; C pour éviter la congélation-décongélation répétée</td></tr><tr><td>100 &micro ; M MACS SmartStrainers&nbsp ;</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-463</td><td>compatible avec les tubes de 15 ml, préféré</td></tr><tr><td>100 & micro ; crépines à cellules M&nbsp ;</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>compatible avec les tubes de 50 ml, si les passoires intelligentes MACS ne sont pas disponibles</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>anti-CD16/CD32 anti-souris</td></tr><tr><td>Anticorps CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561487</td><td>de nombreuses options de conjugaison fluorescente différentes sont disponibles</td></tr><tr><td>Tubes de 5 ml en polystyrène avec capuchon filtrant</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>seringue à insuline</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>homogénéisateur à main</td><td>Qiagen</td><td>9001272</td><td>TissueCytomètre</td></tr> en <tr><td>flux</td><td>Ruptor BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Fortessa SORP&nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel de cytométrie en flux</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Diva</td></tr></tbody></table>

infection des voies urinaires chez un modèle animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Infections des voies urinaires (IVU) sont extrêmement répandues dans le monde entier, encourir une morbidité significative et des dépenses associées aux soins. Petits modèles animaux, qui reflètent la progression et l’établissement de la maladie, permettent la dissection des interactions hôte-pathogène et génération d’immunité aux infections. Chez la souris, l’instillation intravésicale des uropathogènes e. coli, l’agent causal dans plus de 85 % de la communauté acquis UTI, reprend bon nombre des étapes de l’infection chez les humains. Jusqu'à récemment, toutefois, UTI pourrait seulement être modélisé chez les femelles. Cette limitation a freiné l’étude des différences liées au sexe dans l’infection urinaire, mais aussi des autres pathologies de la vessie, comme le cancer. Nous décrivons ici une méthode pour inculquer des souris mâles qui permet une comparaison directe entre mâles et femelles animaux et fournir un protocole détaillé afin d’évaluer le tissu de la vessie par cytométrie en flux comme un moyen de mieux comprendre les réactions de l’hôte à l’infection. Ensemble, ces approches facilitera l’identification des facteurs de l’hôte qui contribuent à des biais de sexe observées dans l’infection urinaire et d’autres maladies associées à la vessie.

Dans l’élaboration du présent protocole, des cohortes de souris C57Bl/6 femelles et mâles âgés de 6 à 8 semaines ont été instillée et bactérienne charge évaluée dans les vessies aux points de temps allant de 1 h à 30 jours. Les résultats de ces études sont détaillées ailleurs (Zychlinsky Scharff et al., en attente). Ici, nous présentons des données représentatives d’infections 24hr. Notamment, la charge bactérienne était équivalente entre les souris mâles et femelles à 24 heures ...

Le modèle établi de cathétérisme transuréthrale de la souris permet l’étude des pathologies de la vessie, y compris les infections urinaires, mais ne peut être effectué chez les femelles. Un nouveau modèle de mâle instillation transurétrale, présenté ici, permettra des recherches dans une région marquée par fortes différences cliniques et épidémiologiques entre les sexes.

Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

L’objectif global de cette approche expérimentale est d’étudier la réponse immunitaire à l’infection des voies urinaires et d’empêcher la comparaison directe entre les animaux mâles et femelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de l’immunologie des muqueuses liées à la façon dont les hommes et les femmes réagissent aux infections des voies urinaires. Le principal avantage est que l’infection s’établit via la racine naturelle.Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode après avoir noté combien de fois il est dit que l’installation de la vessie des souris mâles est impossible. Bien que cette méthode donne un aperçu de l’infection des voies urinaires, elle peut également être appliquée à d’autres études sur des maladies, telles que le cancer de la vessie. Pour commencer, préparez une canule d’accès intraveineuse pédiatrique pour chaque groupe de souris à infecter.À l’aide du mécanisme à ressort intégré, désinvestissez chaque canule de son aiguille comme indiqué par le fabricant. Jetez les aiguilles, en ne conservant que la canule intraveineuse en plastique. Stérilisez les cathéters dans une hotte à flux laminaire pendant un cycle UV d’environ 25 à 30 minutes.Après avoir été mis en culture d’e coli uropathogène pendant la nuit, ou UPEC, selon le protocole textuel, faites tourner la suspension bactérienne dans une microcentrifugeuse de table à 17 000 fois g pendant une minute, et remettez en suspension la pastille bactérienne résultante à deux fois 10 à la huitième UFC par millilitre dans du PBS. Diluez en série une aliquote de suspension et plaquez-la sur de la gélose LB avec des antibiotiques si nécessaire, afin de déterminer l’inoculum exact pour chaque infection. Aspirez l’inoculum bactérien dans une seringue d’un millilitre et fixez le cathéter à l’extrémité de la seringue.Tapotez la seringue pour éliminer l’air et appuyez sur le piston pour remplir l’espace d’air mort dans le cathéter avant de commencer l’instillation. Après avoir anesthésié une souris femelle selon un protocole approuvé, placez l’animal en décubitus dorsal et appliquez une pression modérée sur le bas-ventre pour vider la vessie de l’urine. Les vessies pleines ressemblent à un pois sous la peau, entre les crêtes iliaques.Lorsque la vessie est vide, à l’aide de la main non dominante, placez le pouce sur la queue et un doigt de la même main sur l’abdomen de la souris, et appliquez une légère pression dans des directions opposées pour maintenir la souris fermement en place. Ensuite, placez l’extrémité du cathéter perpendiculairement à la souris au niveau de l’orifice urétral, puis, avec une légère pression, faites glisser le cathéter dans l’urètre jusqu’à ce que le moyeu rencontre l’orifice urétral, tout en abaissant simultanément la seringue de manière à ce qu’elle soit parallèle à la surface de travail. Une fois le cathéter en place, utilisez un doigt de la main non dominante qui repose sur l’abdomen de la souris pour tirer très doucement la peau abdominale vers la tête de la souris.Notez que l’orifice urétral ne bouge pas. Cependant, si les cathéters se trouvent dans le vagin, le tissu se déplacera vers le haut et s’éloignera du cathéter. Avec le moyeu du cathéter contre l’orifice urétral, distribuez lentement 15 microlitres d’inoculum bactérien.Un taux d’installation lent minimise le reflux vésico-urétéral dans le rein. Retirez lentement le cathéter pour éviter les fuites. Placez ensuite l’animal dans sa cage en position couchée.Pour inoculer les souris mâles, placez deux pinces à pouce crâniennes et caudales sur les organes génitaux externes de la souris. Rétractez le prépuce pour exposer complètement le pénis de la glande. Ensuite, une fois que le pénis est positionné à l’extérieur, relâchez la pince à pouce.Repositionnez la pince pour stabiliser le pénis saillant perpendiculairement à l’animal, en tenant l’organe doucement mais tendu. Ensuite, à travers la petite ouverture située à l’extrémité du méat urétral, introduisez soigneusement le cathéter et guidez-le doucement dans le pénis à l’aide d’une pince pour maintenir doucement la tension. Une fois que le moyeu des cathéters rencontre l’extrémité du pénis, distribuez très lentement 50 microlitres de l’inoculum, tout en maintenant la position du pénis.Notez la qualité de l’instillation en fonction d’un score de qualité d’instillation prédéterminé, tel que celui illustré ici. Rétractez le cathéter lentement pendant cinq secondes pour éviter la fuite de l’inoculum. Placez la souris dans sa cage en position couchée.L’animal devrait commencer à récupérer 30 à 45 minutes après l’administration de l’anesthésique. Après avoir sacrifié les souris selon un protocole approuvé, utilisez 70 % d’Epinal pour humidifier soigneusement l’abdomen afin de minimiser la contamination par la fourrure. À l’aide de ciseaux, faites une incision de deux centimètres sur le tiers inférieur de l’abdomen de la souris et retirez aseptiquement la vessie et tout autre organe souhaité.Transférez les organes dans des tubes à bouchon pression en polypropylène de cinq millilitres, contenant un millilitre de PBS stérile et conservez tous les échantillons sur de la glace. À l’aide d’un homogénéisateur manuel, homogénéisez les organes jusqu’à ce qu’il ne reste presque plus de tissu solide. Jetez tout tissu adipeux brillant, beige-blanc qui ne s’homogénéise pas bien.Ensuite, utilisez de l’Epinal, suivi du PBS pour laver l’homogénéisateur entre chaque groupe expérimental ou d’organe. Après avoir préparé des dilutions en série de suspension d’organe homogénéisée, des dilutions sur plaque sur des plaques de gélose LB, avec des antibiotiques le cas échéant, et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour effectuer une cytométrie en flux sur le tissu de la vessie, après avoir isolé la vessie comme démontré précédemment dans cette vidéo, utilisez des ciseaux pour bien hacher le tissu.Ajouter une vessie hachée par tube contenant un tampon de digestion. Ensuite, secouez le tube pour laver le tissu haché dans le tampon de digestion et conservez-le sur de la glace jusqu’à ce que toutes les vessies soient disséquées et hachées. Incuber les vessies hachées à 37 degrés Celsius, pendant 60 à 75 minutes, en secouant vigoureusement la main pendant cinq secondes, toutes les 15 minutes.Lorsque le tissu a un aspect transparent vitreux ressemblant à du papier de soie humide, la digestion est complète. Inactivez les enzymes de digestion en ajoutant deux à trois millilitres de tampon de cytométrie en flux glacé et mélangez délicatement. Placez ensuite les tubes sur de la glace.Pour assurer une suspension unicellulaire, et pour éliminer tout tissu conjonctif, passez le contenu du tube à travers un filtre de 100 micromètres placé dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, avec l’extrémité d’un piston de seringue, appuyez doucement sur tout tissu restant à travers le filtre. Lavez le filtre avec deux millilitres supplémentaires de tampon de cytométrie en flux et conservez les échantillons sur de la glace.Lavez les échantillons par centrifugation à 200 fois g et quatre degrés Celsius, pendant sept minutes. Remettez les pastilles en suspension dans 100 microlitres de tampon de cytométrie en flux contenant un bloc Fc, dilué à cinq microgrammes par millilitre, et transférez-les sur une plaque à fond rond de 96 puits. Après 10 à 15 minutes, ajoutez 100 microlitres du cocktail d’anticorps souhaité à chaque échantillon.Ensuite, incubez les échantillons sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 à 45 minutes. Laver les échantillons par centrifugation à 200 fois g et quatre degrés Celsius pendant sept minutes. Enfin, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux, et faire passer les échantillons à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres sur un tube en polystyrène de cinq millilitres, juste avant l’acquisition sur un cytomètre en flux.Cette figure montre des données représentatives de souris infectées pendant 24 heures. La charge bactérienne était équivalente entre les souris mâles et femelles 24 heures après l’infection. Pour déterminer si la perte d’inoculum au moment de l’infection avait un impact sur l’établissement de l’infection, chaque instillation a été notée sur une échelle de un à cinq, un étant le plus optimal.La colonisation bactérienne a été déterminée 24 heures après l’infection. Aucune différence statistiquement significative n’a été observée entre les UFC obtenues chez des animaux ayant des scores d’instillation différents, tels qu’évalués par un test de Kruskal-Wallis non paramétrique, comparant le rang moyen de chaque colonne avec le rang moyen de toutes les autres colonnes, et corrigeant les comparaisons multiples à l’aide d’un test de Dunn. On peut conclure que les instillations sous-optimales, entraînant une fuite substantielle d’inoculum bactérien pendant l’infection, n’ont pas d’impact significatif sur la colonisation bactérienne à 24 heures.Il est important de noter que la fréquence de l’instillation sous-optimale diminuera avec la pratique. Enfin, alors que le nombre de cellules immunitaires CD45 positives, présentes chez les animaux naïfs, n’était pas différent entre les souris femelles et mâles, il y avait une augmentation statistiquement significative de l’infiltration dans les vessies des souris femelles infectées. Lors de la tentative de cathétérisme, il est important d’utiliser des mouvements lents et doux.Avec son développement, cette technique nous a aidés à explorer les différences d’immunité basées sur le sexe dans la vessie des animaux mâles et femelles.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo va montrer des méthodes pour induire des infections de souris transurethrally des voies urinaires et de quantifier l'ampleur des infections résultant.

Induction transurétrale d&#39;infection des voies urinaires souris

Source : Luyts, N., et al. Suivi longitudinal des infections urinaires et leur traitement chez la souris par imagerie bioluminescente. J. Vis. Exp. (2021).Cette vidéo montre l’induction et le suivi de l’infection des voies urinaires dans un modèle murin utilisant l’E. coli bioluminescente injectée dans la vessie, où se produisent l’adhésion, l’invasion et la réplication intracellulaire bactérienne. La lumière émise par l’opéron bioluminescent sert de marqueur en temps réel de la charge...

Visualisation de l’infection des voies urinaires dans un modèle murin utilisant la bioluminescence

Source : Conover, M. S., et al., J. Établissement et caractérisation des infections urinaires et de la maladie des urines dans un modèle murin. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la procédure pour assembler et implanter un cathéter transurétral chez une souris femelle, suivie d’une inoculation bactérienne pour établir une infection urinaire associée au cathéter et étudier les interactions hôte-pathogène médiées par biofilm.

Infection urinaire associée au cathéter dans un modèle murin

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique d’administration intravésicale de bactéries uropathogènes pour générer un modèle d’infection urinaire chez la souris. Ce modèle peut être utilisé pour comprendre la propagation de l’infection bactérienne uropathogène dans le système urinaire et les mécanismes qui déterminent la susceptibilité aux infections urinaires.

Génération d’un modèle d’infection des voies urinaires : une technique pour administrer des bactéries uropathogènes chez la souris afin de développer un modèle d’infection des voies urinaires

Cette vidéo démontre l’établissement d’une infection uropathogène à Escherichia coli dans une vessie de souris femelle par instillation d’un cathéter transurétral. Les bactéries injectées réussissent à établir une infection des voies urinaires dans la vessie, fournissant une plate-forme précieuse pour l’étude des maladies associées aux soins de santé liées aux voies urinaires.

Cathétérisme transurétral et inoculation bactérienne pour générer un modèle d’infection des voies urinaires chez des souris mâles

Etablissement d’un modèle d’infection urinaire chez des souris femelles

Cette vidéo présente une technique permettant d’évaluer l’activité antitumorale de la protéine activatrice des neutrophiles d’Helicobacter pylori, ou HP-NAP, dans un modèle de cancer de la vessie chez la souris. HP-NAP interagit avec les neutrophiles des cellules tumorales pour produire des cytokines pro-inflammatoires, induisant la différenciation des lymphocytes T naïfs en phénotypes de lymphocytes T auxiliaires de type 1 (Th1) et cytotoxiques de type 1 (Tc1). Les cellules Th1 et Tc1...

Évaluation de l’efficacité antitumorale d’une protéine immunomodulatrice bactérienne dans un modèle murin

La capacité à modéliser les infections des voies urinaires (IVU) est cruciale pour pouvoir comprendre la pathogenèse bactérienne et favoriser le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce travail est de démontrer des modèles murins d’infections urinaires expérimentales et d’infections urinaires associées à un cathéter qui récapitulent et prédisent les résultats observés chez l’homme.

Création et caractérisation de l&#39;UTI et Cauti dans un modèle de souris

Instillation transuréthrale est une procédure difficile et n’a pas été bien décrite dans la littérature. Le but de ce manuscrit est de décrire une technique pour l’insertion d’un cathéter intravésical livraison de liquides par des substances actives dans la vessie ou la prostate chez les souris mâles adultes transurétrale.

Transuréthrale médicamenteuse chez les souris mâles adultes

Un modèle murin d’inoculation transurétrale d’E. coli uropathogène (UPEC) pour établir des réservoirs de vessie intracellulaire latents et une exposition ultérieure de la vessie à G. vaginalis pour induire une infection urinaire UPEC récurrente est démontré. Le dénombrement des bactéries, la cytologie de l’urine et la fixation et le traitement in situ de la vessie pour la microscopie électronique à balayage sont également démontrés.

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

Ce manuscrit décrit l’administration intravésicale de bactéries uropathogènes avec un opéron lux pour induire une infection des voies urinaires chez la souris et l’analyse longitudinale in vivo ultérieure de la charge bactérienne à l’aide de l’imagerie par bioluminescence.

Suivi longitudinal des infections des voies urinaires et leur traitement chez la souris à l’aide de l’imagerie par bioluminescence

Apprenez le cathétérisme transuréthral chez la souris pour étudier les infections urinaires et comparer les réponses immunitaires entre mâles et femelles. Cette méthode permet d'explorer les différences sexuées en immunologie.

Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

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