Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

L’objectif global de cette approche expérimentale est d’étudier la réponse immunitaire à l’infection des voies urinaires et d’empêcher la comparaison directe entre les animaux mâles et femelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de l’immunologie des muqueuses liées à la façon dont les hommes et les femmes réagissent aux infections des voies urinaires. Le principal avantage est que l’infection s’établit via la racine naturelle.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode après avoir noté combien de fois il est dit que l’installation de la vessie des souris mâles est impossible. Bien que cette méthode donne un aperçu de l’infection des voies urinaires, elle peut également être appliquée à d’autres études sur des maladies, telles que le cancer de la vessie. Pour commencer, préparez une canule d’accès intraveineuse pédiatrique pour chaque groupe de souris à infecter.

À l’aide du mécanisme à ressort intégré, désinvestissez chaque canule de son aiguille comme indiqué par le fabricant. Jetez les aiguilles, en ne conservant que la canule intraveineuse en plastique. Stérilisez les cathéters dans une hotte à flux laminaire pendant un cycle UV d’environ 25 à 30 minutes.

Après avoir été mis en culture d’e coli uropathogène pendant la nuit, ou UPEC, selon le protocole textuel, faites tourner la suspension bactérienne dans une microcentrifugeuse de table à 17 000 fois g pendant une minute, et remettez en suspension la pastille bactérienne résultante à deux fois 10 à la huitième UFC par millilitre dans du PBS. Diluez en série une aliquote de suspension et plaquez-la sur de la gélose LB avec des antibiotiques si nécessaire, afin de déterminer l’inoculum exact pour chaque infection. Aspirez l’inoculum bactérien dans une seringue d’un millilitre et fixez le cathéter à l’extrémité de la seringue.

Tapotez la seringue pour éliminer l’air et appuyez sur le piston pour remplir l’espace d’air mort dans le cathéter avant de commencer l’instillation. Après avoir anesthésié une souris femelle selon un protocole approuvé, placez l’animal en décubitus dorsal et appliquez une pression modérée sur le bas-ventre pour vider la vessie de l’urine. Les vessies pleines ressemblent à un pois sous la peau, entre les crêtes iliaques.

Lorsque la vessie est vide, à l’aide de la main non dominante, placez le pouce sur la queue et un doigt de la même main sur l’abdomen de la souris, et appliquez une légère pression dans des directions opposées pour maintenir la souris fermement en place. Ensuite, placez l’extrémité du cathéter perpendiculairement à la souris au niveau de l’orifice urétral, puis, avec une légère pression, faites glisser le cathéter dans l’urètre jusqu’à ce que le moyeu rencontre l’orifice urétral, tout en abaissant simultanément la seringue de manière à ce qu’elle soit parallèle à la surface de travail. Une fois le cathéter en place, utilisez un doigt de la main non dominante qui repose sur l’abdomen de la souris pour tirer très doucement la peau abdominale vers la tête de la souris.

Notez que l’orifice urétral ne bouge pas. Cependant, si les cathéters se trouvent dans le vagin, le tissu se déplacera vers le haut et s’éloignera du cathéter. Avec le moyeu du cathéter contre l’orifice urétral, distribuez lentement 15 microlitres d’inoculum bactérien.

Un taux d’installation lent minimise le reflux vésico-urétéral dans le rein. Retirez lentement le cathéter pour éviter les fuites. Placez ensuite l’animal dans sa cage en position couchée.

Pour inoculer les souris mâles, placez deux pinces à pouce crâniennes et caudales sur les organes génitaux externes de la souris. Rétractez le prépuce pour exposer complètement le pénis de la glande. Ensuite, une fois que le pénis est positionné à l’extérieur, relâchez la pince à pouce.

Repositionnez la pince pour stabiliser le pénis saillant perpendiculairement à l’animal, en tenant l’organe doucement mais tendu. Ensuite, à travers la petite ouverture située à l’extrémité du méat urétral, introduisez soigneusement le cathéter et guidez-le doucement dans le pénis à l’aide d’une pince pour maintenir doucement la tension. Une fois que le moyeu des cathéters rencontre l’extrémité du pénis, distribuez très lentement 50 microlitres de l’inoculum, tout en maintenant la position du pénis.

Notez la qualité de l’instillation en fonction d’un score de qualité d’instillation prédéterminé, tel que celui illustré ici. Rétractez le cathéter lentement pendant cinq secondes pour éviter la fuite de l’inoculum. Placez la souris dans sa cage en position couchée.

L’animal devrait commencer à récupérer 30 à 45 minutes après l’administration de l’anesthésique. Après avoir sacrifié les souris selon un protocole approuvé, utilisez 70 % d’Epinal pour humidifier soigneusement l’abdomen afin de minimiser la contamination par la fourrure. À l’aide de ciseaux, faites une incision de deux centimètres sur le tiers inférieur de l’abdomen de la souris et retirez aseptiquement la vessie et tout autre organe souhaité.

Transférez les organes dans des tubes à bouchon pression en polypropylène de cinq millilitres, contenant un millilitre de PBS stérile et conservez tous les échantillons sur de la glace. À l’aide d’un homogénéisateur manuel, homogénéisez les organes jusqu’à ce qu’il ne reste presque plus de tissu solide. Jetez tout tissu adipeux brillant, beige-blanc qui ne s’homogénéise pas bien.

Ensuite, utilisez de l’Epinal, suivi du PBS pour laver l’homogénéisateur entre chaque groupe expérimental ou d’organe. Après avoir préparé des dilutions en série de suspension d’organe homogénéisée, des dilutions sur plaque sur des plaques de gélose LB, avec des antibiotiques le cas échéant, et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour effectuer une cytométrie en flux sur le tissu de la vessie, après avoir isolé la vessie comme démontré précédemment dans cette vidéo, utilisez des ciseaux pour bien hacher le tissu.

Ajouter une vessie hachée par tube contenant un tampon de digestion. Ensuite, secouez le tube pour laver le tissu haché dans le tampon de digestion et conservez-le sur de la glace jusqu’à ce que toutes les vessies soient disséquées et hachées. Incuber les vessies hachées à 37 degrés Celsius, pendant 60 à 75 minutes, en secouant vigoureusement la main pendant cinq secondes, toutes les 15 minutes.

Lorsque le tissu a un aspect transparent vitreux ressemblant à du papier de soie humide, la digestion est complète. Inactivez les enzymes de digestion en ajoutant deux à trois millilitres de tampon de cytométrie en flux glacé et mélangez délicatement. Placez ensuite les tubes sur de la glace.

Pour assurer une suspension unicellulaire, et pour éliminer tout tissu conjonctif, passez le contenu du tube à travers un filtre de 100 micromètres placé dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, avec l’extrémité d’un piston de seringue, appuyez doucement sur tout tissu restant à travers le filtre. Lavez le filtre avec deux millilitres supplémentaires de tampon de cytométrie en flux et conservez les échantillons sur de la glace.

Lavez les échantillons par centrifugation à 200 fois g et quatre degrés Celsius, pendant sept minutes. Remettez les pastilles en suspension dans 100 microlitres de tampon de cytométrie en flux contenant un bloc Fc, dilué à cinq microgrammes par millilitre, et transférez-les sur une plaque à fond rond de 96 puits. Après 10 à 15 minutes, ajoutez 100 microlitres du cocktail d’anticorps souhaité à chaque échantillon.

Ensuite, incubez les échantillons sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 à 45 minutes. Laver les échantillons par centrifugation à 200 fois g et quatre degrés Celsius pendant sept minutes. Enfin, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux, et faire passer les échantillons à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres sur un tube en polystyrène de cinq millilitres, juste avant l’acquisition sur un cytomètre en flux.

Cette figure montre des données représentatives de souris infectées pendant 24 heures. La charge bactérienne était équivalente entre les souris mâles et femelles 24 heures après l’infection. Pour déterminer si la perte d’inoculum au moment de l’infection avait un impact sur l’établissement de l’infection, chaque instillation a été notée sur une échelle de un à cinq, un étant le plus optimal.

La colonisation bactérienne a été déterminée 24 heures après l’infection. Aucune différence statistiquement significative n’a été observée entre les UFC obtenues chez des animaux ayant des scores d’instillation différents, tels qu’évalués par un test de Kruskal-Wallis non paramétrique, comparant le rang moyen de chaque colonne avec le rang moyen de toutes les autres colonnes, et corrigeant les comparaisons multiples à l’aide d’un test de Dunn. On peut conclure que les instillations sous-optimales, entraînant une fuite substantielle d’inoculum bactérien pendant l’infection, n’ont pas d’impact significatif sur la colonisation bactérienne à 24 heures.

Il est important de noter que la fréquence de l’instillation sous-optimale diminuera avec la pratique. Enfin, alors que le nombre de cellules immunitaires CD45 positives, présentes chez les animaux naïfs, n’était pas différent entre les souris femelles et mâles, il y avait une augmentation statistiquement significative de l’infiltration dans les vessies des souris femelles infectées. Lors de la tentative de cathétérisme, il est important d’utiliser des mouvements lents et doux.

Avec son développement, cette technique nous a aidés à explorer les différences d’immunité basées sur le sexe dans la vessie des animaux mâles et femelles.