Cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris

Notre recherche explore comment la microglie influence la réparation du cerveau après une lésion cérébrale prénatale. Et nous visons à déterminer si la modulation de l’activité des cellules microgliales peut améliorer les résultats neurologiques à long terme. Je crois que c’est la complexité des réponses des cellules microgliales et les défis de décrire ces réponses de la manière la plus précise possible pour représenter les réponses physiologiques, mais aussi pathologiques et les maladies.

Nous utilisons différentes modalités, telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire et les expériences de cytométrie en flux, pour caractériser les états microgliaux et le fonctionnement du cerveau en développement après une lésion prénatale. Un défi majeur est de préserver la viabilité cellulaire et l’identité microgliale pendant l’isolement, en particulier aux moments néonatals où le nombre de cellules cérébelleuses est limité. Elle soulève des questions sur la façon dont les atteintes cérébelleuses précoces entraînent une altération transcriptionnelle dans la sous-population microgliale et sur la façon dont les thérapies ciblées pourraient moduler ces changements.

Pour commencer, disséquez la région cérébrale spécifique des souris si nécessaire. À l’aide d’une pince, transférez le tissu dans une petite boîte de Pétri contenant un milieu de culture de cellules microgliales placé sur de la glace pour maintenir la viabilité cellulaire. À l’aide d’une pipette, retirez le milieu de culture de cellules microgliales de la boîte de Pétri.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez finement le tissu cérébral dans la même boîte de Pétri. Transférez le tissu cérébral homogénéisé dans des tubes de cinq millilitres pour la digestion enzymatique. Ajoutez deux millilitres de solution saline équilibrée Hanks' complétée par de la collagénase D et de la DNase 1 dans chaque tube, et fermez hermétiquement les bouchons avec du Parafilm.

Ensuite, incubez les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en les secouant toutes les cinq minutes. Pour arrêter la digestion, placez les tubes sur de la glace. Ensuite, passez l’homogénat à travers un filtre à mailles métalliques de 140 micromètres pour éliminer les gros débris.

À l’aide d’un pilon en verre, dissociez délicatement les cellules restantes sur le filtre. Lavez le filtre à mailles métalliques plusieurs fois avec trois millilitres de milieu de culture cellulaire microgliale pour chaque lavage. Maintenant, à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, prélevez le filtrat et transférez-le dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, centrifugez le tube à 500 g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retournez soigneusement le tube pour jeter le surnageant. À l’aide d’une grille, raclez doucement le tube pour remettre le granulé en suspension.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’une solution de milieu colloïdal à base de silice à 37 % aux cellules remises en suspension. Centrifugez la solution à 500 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec une force de rupture minimale. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, aspirez la couche de myéline par le haut de la solution.

Pour laver les cellules, ajoutez 10 millilitres de solution saline équilibrée de Hanks et centrifugez le tube à 500 g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant et remis la pastille en suspension, ajoutez 10 millilitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence dans le tube. Après la centrifugation, remettre en suspension la pastille finale dans le tampon restant pour les applications en aval.

Transférez toutes les cellules isolées dans une plaque de 96 puits à fond conique. Centrifugez la plaque à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retournez rapidement la plaque d’un seul mouvement pour jeter le surnageant.

Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans 25 microlitres de solution bloquante et incubez la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Pour préparer le mélange de coloration d’anticorps extracellulaires, centrifugez les tubes d’anticorps à 10 000 g pour éliminer les agrégats. Sans perturber le plomb, aspirez le volume requis du surnageant.

À l’aide d’un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence, ajustez le volume total à 25 microlitres. Maintenant, ajoutez 25 microlitres du mélange de coloration d’anticorps extracellulaires dans chaque puits et incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante. Sans mélanger, ajoutez 150 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence dans chaque puits.

Centrifugez la plaque à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retournez rapidement la plaque pour retirer le surnageant en un seul mouvement. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence et centrifugez-la comme démontré précédemment.

Remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon saponine-paraformaldéhyde pour fixer et perméabiliser les cellules. Ensuite, incubez la plaque pendant 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Sans mélanger, ajoutez 100 microlitres de tampon à saponine dans chaque puits.

Centrifugez la plaque à 500 g pendant six minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retournez la plaque pour éliminer le surnageant en un seul mouvement, et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon de saponine. Ensuite, préparez des contrôles de compensation en ajoutant 20 microlitres de billes dans 11 puits vides.

Pour préparer le mélange de coloration des anticorps intracellulaires, centrifugez des tubes d’anticorps à 10 000 g pour éliminer les agrégats potentiels. Sans perturber le plomb, aspirez le volume requis du surnageant. Ajustez le volume à 50 microlitres à l’aide d’un tampon à saponine.

Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans 50 microlitres de mélange d’anticorps intracellulaires. Ajoutez un microlitre de chaque anticorps dans les puits de billes respectifs et incubez la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. Sans mélanger, ajoutez 150 microlitres de tampon à saponine dans chaque puits contenant des échantillons de cellules.

Ajoutez 100 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence dans chaque puits de contrôle de compensation pour laver les billes. Une fois la plaque centrifugée, remettre en suspension la pastille cellulaire et les contrôles dans 200 microlitres de tampon de saponine et de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence, respectivement. Centrifugez la plaque à 500 g pendant six minutes à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant.

Remettez en suspension les échantillons de cellules et les commandes de compensation dans 200 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence. Transférez les suspensions dans des tubes de tri cellulaire activés par fluorescence marqués. Le séquençage de l’ARN sur cellule unique a permis d’identifier un amas microglial distinct des autres types de cellules cérébrales sur la base de profils transcriptionnels.

L’analyse de l’expression différentielle a révélé des gènes significativement régulés à la hausse dans la microglie, notamment Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 et P2ry12. Des cellules microgliales ont été isolées avec succès à partir d’échantillons de cerveau vivant sur la base de leur expression distincte des marqueurs CD45 et CD11b. Des sous-populations microgliales distinctes ont été identifiées d’après des combinaisons de marqueurs d’activation, notamment CD80, CD86, iNOS, CD206 et Arg1, CD86 et CD64, et CD163 avec CD206.

L’expression du gène marqueur de Ptprc et d’Itgam a été localisée spécifiquement dans le cluster microglial dans la projection umap, confirmant l’identité de ces cellules. L’analyse du graphique de violon a montré une expression plus faible des marqueurs anti-inflammatoires, tels que Fcgr1 et Cd86, dans la microglie traitée par rapport au témoin du véhicule.