Name: Cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Découvrez la cytométrie en flux et le séquençage ARN unicellulaire pour caractériser l'hétérogénéité de la microglie dans le cerveau postnatal précoce de souris. Cette méthode révèle les états cellulaires et leurs rôles dans le développement cérébelleux.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>140 et micro ; Filtre à mailles métalliques M&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits à fond conique&nbsp ;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>Arginase 1 - Conjugué Pecy7 - Clone : A1exF5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs fluorescents stables sur paillasse</td><td>Invitrogen</td><td>N° A49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Fitc conjugué - Clone : M1/70</td><td>BD Pharmingen</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - Conjugué SB600 - Clone : TNKUPJ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - APC conjugué - Clone : C068C2</td><td>BioLégende</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - Conjugué A700 - Clone : 30-F11</td><td>BD Pharmingen</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - Conjugué&nbsp ; PerCP-eF710 - Clone : X54-5/7.1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - Conjugué SB436 - Clone : 16-10A1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - Pe conjugué - Clone : GL-1</td><td>BioLégende</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich&nbsp ;</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (solution saline équilibrée de Hank) 10x</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp ;</td><td>Référence 311506CL</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>VWR International</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp ;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - Conjugué PE- eF610 - Clone : CXNFT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Amcyan vivant/mort</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N° L34957</td><td></td></tr><tr><td>Milieux de culture de cellules microgliales</td><td>Technologies de la vie</td><td>Référence A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich&nbsp ;</td><td>Réf. P6148</td><td></td></tr><tr><td>Anti souris rat CD16/CD32</td><td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma&ndash ; Aldrich&nbsp ;</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Banques scRNAseq</td><td>Génomique 10X</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Milieu colloïdal à base de silice</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

Ce protocole utilise efficacement la cytométrie en flux pour caractériser les populations de cellules microgliales dans des échantillons de cerveau de souris, en fonction de l’expression de marqueurs de surface et intracellulaires sélectionnés. Les sections suivantes détaillent les résultats obtenus à partir des étapes clés du flux de travail, en mettant en évidence la distribution et l’hétérogénéité des sous-ensembles de microglies en réponse aux conditions expérimentales.
Validation de la rémunération et de la stratégie de contrôle Des billes de compensation ont été utilisées pour calibrer les signaux de fluorescence et corriger le chevauchement spectral entre les fluorochromes. Les populations positives et négatives de chaque fluorochrome ont été clairement séparées, ce qui a permis une génération précise de matrice de compensation. Les seuils de déclenchement ont d’abord été validés à l’aide du contrôle FMO (Fluorescence Minus One) lors de l’optimisation du panneau afin de distinguer le signal réel du bruit de fond, en particulier pour les marqueurs médiocres ou chevauchants. Ces seuils ont ensuite été réutilisés dans toutes les expériences en utilisant les mêmes paramètres de panneau de coloration et de cytomètre pour assurer la cohérence. Des contrôles d’isotypes ont été inclus pour surveiller la liaison non spécifique potentielle, en particulier pour les marqueurs intracellulaires, mais n’ont pas été utilisés pour les décisions de contrôle.
Identification des cellules microgliales La stratégie de contrôle des cellules vivantes/mortes (Amcyan) a permis d’exclure avec succès les cellules mortes. La stratégie de déclenchement a permis d’isoler efficacement les populations de cellules microgliales en fonction de l’expression de CD45 (AF700) et CD11b (FITC). Les paramètres de diffusion directe (FSC) et de diffusion latérale (SSC) ont été optimisés (FSC = 300, SSC = 200) pour centrer la population de microglies à l’intérieur du graphique à points (Figure 5).
Phénotypage des cellules microgliales L’analyse par diagrammes à points a permis d’identifier des sous-populations de microglies sur la base de l’expression différentielle de marqueurs de surface et intracellulaires. À l’aide de stratégies de contrôle spécifiques dans le logiciel FlowJo, un sous-ensemble de cellules microgliales exprimant CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) et iNOS (PE-eFluor 610) a été identifié (Figure 6A). Le double gate a également été utilisé pour définir des sous-ensembles exprimant CD206 (APC) et Arg1 (PE-Cy7) (voir Figure 6B). D’autres populations ont été caractérisées par la co-expression de CD86 (PE) et CD64 (PerCP-eFluor 710), ainsi que de CD163 (Super Bright 600) et CD206 (APC) (Figure 6C,D). Ces profils phénotypiques reflètent l’hétérogénéité définie par les marqueurs au sein de la population microgliale et démontrent la capacité de ce protocole à distinguer plusieurs sous-ensembles distincts sur le plan transcriptionnel et immunologique sans déduire d’états fonctionnels fixes.
Analyse de la microglie unicellulaire L’UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) a été utilisé pour visualiser l’hétérogénéité cellulaire et identifier les amas de cellules microgliales parmi d’autres types de cellules cérébrales. Chaque point représente une seule cellule, et le cluster est codé par couleur en fonction de la similarité transcriptionnelle (Figure 2).
Une analyse d’expression différentielle a été réalisée au sein du groupe de microglies afin d’identifier les gènes modulés dans des conditions expérimentales. Les gènes avec une valeur P ajustée ≤ 0,05 ont été considérés comme exprimés de manière différentielle.
Un graphique volcanique a été généré pour visualiser ces gènes exprimés de manière différentielle des cellules microgliales, en mettant en évidence ceux qui présentent à la fois un changement de pli élevé et une signification statistique élevée (Figure 4).
Pour comparer ces résultats de cellules uniques avec des données de cytométrie en flux, l’expression des marqueurs microgliaux CD45 et CD11b (Ptprc et Itgam) a été examinée. Un UMAP montre leur expression au sein de différentes populations cellulaires (Figure 7).
Enfin, l’expression de marqueurs immunitaires sélectionnés a été évaluée pour caractériser l’hétérogénéité transcriptionnelle entre les cellules microgliales. Un graphique de Violin montre l’expression de gènes tels que CD80 et NOS-, ainsi que Mrc1, Arg1, Fcgr1 et CD163 au niveau de la cellule unique (Figure 8). Ces modèles d’expression de marqueurs permettent de comparer avec le profilage basé sur la cytométrie en flux et mettent en évidence la diversité moléculaire des sous-ensembles microgliaux dans des conditions expérimentales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
Figure 1 : Contrôle de la qualité des données transcriptomiques unicellulaires. (A) Distribution du contenu de l’ARN mitochondrial dans les cellules. Les cellules contenant &gt;30 % d’ARN mitochondrial ont été exclues pour éliminer les cellules potentiellement stressées ou mourantes. (B) Les cellules avec un log10GenesPerUMI &gt; 0,75 ont été filtrées pour assurer un rapport gène/UMI cohérent et réduire le bruit des banques de faible complexité. (C) Les cellules avec moins de 500 transcrits détectés (nUMI) ou plus de 300 gènes détectés (nGENE) ont également été exclues pour éliminer les cellules de mauvaise qualité ou multiples. (D) Graphique de corrélation entre NUMI et nGene illustrant l’impact des seuils de filtrage. Les doublets détectés ont été retirés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
Figure 2 : Visualisation UMAP de transcriptomes unicellulaires. Graphique UMAP montrant la distribution des cellules uniques sur la base de profils transcriptomiques obtenus à partir de deux animaux individuels. Chaque point représente une cellule, codée par couleur par identité de cluster. L’amas de cellules microgliales est identifié parmi d’autres populations cellulaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
Figure 3 : Courbe ROC du classificateur Random Forest évaluée par validation croisée. Courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) illustrant les performances du modèle Random Forest utilisé pour distinguer la microglie des autres types de cellules cérébrales en fonction des profils d’expression génique. Le modèle a été entraîné sur un ensemble de ~1000 cellules avec des étiquettes connues et évalué à l’aide d’une validation croisée 10 fois. Parmi les cinq modèles statistiques testés (Random Forest, régression logistique, naïf Bayes, machine à vecteurs de support et arbre de décision), le modèle Random Forest a obtenu les performances de classification les plus élevées. L’aire sous la courbe (AUC) reflète la précision du modèle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
Figure 4 : Analyse différentielle de l’expression génique dans les cellules microgliales. Graphique du volcan représentant la variation de log2 par rapport à la valeur P ajustée pour les gènes exprimés de manière différentielle dans la microglie entre les deux groupes expérimentaux (contrôle vs lésion cérébrale cérébelleuse). Le gène régulé à la hausse est plus fortement exprimé dans le groupe d’intérêt (ident.1), et les gènes régulés à la baisse montrent une expression réduite par rapport au groupe de référence (ident.2). Les gènes clés exprimés de manière différentielle significative sont marqués. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
Figure 5 : Stratégie de déclenchement pour l’identification de la microglie par cytométrie en flux. (A) Stratégie de déclenchement appliquée aux cellules cérébelleuses d’une souris témoin du jour 3 postnatal (P3). (B) Les maillots ont été choisis pour exclure les doublets. (C) Les cellules viables ont été identifiées à l’aide d’un colorant de viabilité ; les événements avec un faible FSC-A ont été exclus afin d’éliminer les débris et d’assurer l’analyse des cellules intactes. (D) Les microglies ont été identifiées comme CD45+ et CD11b+ avec deux populations distinctes : CD45 faible-CD11bint pour la microglie quiescente et CD45 int-CD11b élevé pour la microglie activée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
Graphique 6. Caractérisation des profils d’expression des marqueurs microgliaux par cytométrie en flux. (A) Déclenchement séquentiel des cellules CD45+ CD11b+ basé sur l’expression de CD80, CD86 et iNOS. (B) Identification d’un sous-ensemble exprimant CD206, suivie d’un gate basé sur l’expression de Arg1. (C) Identification d’un sous-ensemble exprimant CD86, suivie d’un gate basé sur l’expression de CD64. (D) Identification d’un sous-ensemble exprimant CD163, suivie d’un gate basé sur l’expression de CD206. Ces stratégies de déclenchement illustrent l’hétérogénéité phénotypique des populations de microglies en fonction de l’expression de marqueurs de surface et intracellulaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
Figure 7 : Confirmation de l’identité microgliale à l’aide de l’expression d’Itgam et de Ptprc dans des données de séquençage d’ARN unicellulaire. UMAP affiche le paysage transcriptionnel des cellules cérébelleuses à P15, avec l’expression génique d’Itgam et de Ptprc superposée sur les grappes. La co-expression de ces marqueurs myéloïdes canoniques soutient l’identification des populations de microglies et s’aligne sur les marqueurs utilisés en cytométrie en flux, fournissant une validation croisée entre les analyses transcriptomiques et au niveau des protéines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
Figure 8 : Profils d’expression de gènes immunitaires sélectionnés dans des cellules microgliales identifiées par séquençage d’ARN unicellulaire. Les graphiques Violin montrent la distribution de l’expression génique de CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 et CD163 dans les cellules microgliales individuelles. Ces marqueurs sont couramment associés à des processus immunitaires et illustrent l’hétérogénéité transcriptionnelle observée au sein de la population microgliale. Les données sont présentées pour les affections de contrôle et de lésion cérébrale cérébelleuse (CBI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Composition des solutions utilisées pour l’isolement et la coloration des cellules neurales. Ce tableau fournit une composition détaillée des solutions nécessaires à l’isolement et à la coloration des cellules, y compris leurs concentrations et composants respectifs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Concentrations du mélange d’anticorps pour la coloration extracellulaire. Ce tableau détaille les concentrations d’anticorps et de solutions vivantes/mortes utilisées pour la coloration extracellulaire, en spécifiant les volumes et les dilutions requis pour chaque anticorps dans le mélange de coloration pour un échantillon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Concentrations du mélange d’anticorps pour la coloration intracellulaire. Ce tableau détaille les concentrations d’anticorps utilisés pour la coloration intracellulaire, en précisant les volumes et les dilutions requis pour chaque anticorps dans le mélange de coloration pour un échantillon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Cytométrie en flux et analyse de cellules uniques pour caractériser l’activation de la microglie dans le développement postnatal précoce du cerveau de souris

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

Notre recherche explore comment la microglie influence la réparation du cerveau après une lésion cérébrale prénatale. Et nous visons à déterminer si la modulation de l’activité des cellules microgliales peut améliorer les résultats neurologiques à long terme. Je crois que c’est la complexité des réponses des cellules microgliales et les défis de décrire ces réponses de la manière la plus précise possible pour représenter les réponses physiologiques, mais aussi pathologiques et les maladies.Nous utilisons différentes modalités, telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire et les expériences de cytométrie en flux, pour caractériser les états microgliaux et le fonctionnement du cerveau en développement après une lésion prénatale. Un défi majeur est de préserver la viabilité cellulaire et l’identité microgliale pendant l’isolement, en particulier aux moments néonatals où le nombre de cellules cérébelleuses est limité. Elle soulève des questions sur la façon dont les atteintes cérébelleuses précoces entraînent une altération transcriptionnelle dans la sous-population microgliale et sur la façon dont les thérapies ciblées pourraient moduler ces changements.Pour commencer, disséquez la région cérébrale spécifique des souris si nécessaire. À l’aide d’une pince, transférez le tissu dans une petite boîte de Pétri contenant un milieu de culture de cellules microgliales placé sur de la glace pour maintenir la viabilité cellulaire. À l’aide d’une pipette, retirez le milieu de culture de cellules microgliales de la boîte de Pétri.Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez finement le tissu cérébral dans la même boîte de Pétri. Transférez le tissu cérébral homogénéisé dans des tubes de cinq millilitres pour la digestion enzymatique. Ajoutez deux millilitres de solution saline équilibrée Hanks' complétée par de la collagénase D et de la DNase 1 dans chaque tube, et fermez hermétiquement les bouchons avec du Parafilm.Ensuite, incubez les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en les secouant toutes les cinq minutes. Pour arrêter la digestion, placez les tubes sur de la glace. Ensuite, passez l’homogénat à travers un filtre à mailles métalliques de 140 micromètres pour éliminer les gros débris.À l’aide d’un pilon en verre, dissociez délicatement les cellules restantes sur le filtre. Lavez le filtre à mailles métalliques plusieurs fois avec trois millilitres de milieu de culture cellulaire microgliale pour chaque lavage. Maintenant, à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, prélevez le filtrat et transférez-le dans un tube de 15 millilitres.Ensuite, centrifugez le tube à 500 g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retournez soigneusement le tube pour jeter le surnageant. À l’aide d’une grille, raclez doucement le tube pour remettre le granulé en suspension.Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’une solution de milieu colloïdal à base de silice à 37 % aux cellules remises en suspension. Centrifugez la solution à 500 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec une force de rupture minimale. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, aspirez la couche de myéline par le haut de la solution.Pour laver les cellules, ajoutez 10 millilitres de solution saline équilibrée de Hanks et centrifugez le tube à 500 g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant et remis la pastille en suspension, ajoutez 10 millilitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence dans le tube. Après la centrifugation, remettre en suspension la pastille finale dans le tampon restant pour les applications en aval.Transférez toutes les cellules isolées dans une plaque de 96 puits à fond conique. Centrifugez la plaque à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retournez rapidement la plaque d’un seul mouvement pour jeter le surnageant.Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans 25 microlitres de solution bloquante et incubez la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Pour préparer le mélange de coloration d’anticorps extracellulaires, centrifugez les tubes d’anticorps à 10 000 g pour éliminer les agrégats. Sans perturber le plomb, aspirez le volume requis du surnageant.À l’aide d’un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence, ajustez le volume total à 25 microlitres. Maintenant, ajoutez 25 microlitres du mélange de coloration d’anticorps extracellulaires dans chaque puits et incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante. Sans mélanger, ajoutez 150 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence dans chaque puits.Centrifugez la plaque à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retournez rapidement la plaque pour retirer le surnageant en un seul mouvement. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence et centrifugez-la comme démontré précédemment.Remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon saponine-paraformaldéhyde pour fixer et perméabiliser les cellules. Ensuite, incubez la plaque pendant 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Sans mélanger, ajoutez 100 microlitres de tampon à saponine dans chaque puits.Centrifugez la plaque à 500 g pendant six minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retournez la plaque pour éliminer le surnageant en un seul mouvement, et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de tampon de saponine. Ensuite, préparez des contrôles de compensation en ajoutant 20 microlitres de billes dans 11 puits vides.Pour préparer le mélange de coloration des anticorps intracellulaires, centrifugez des tubes d’anticorps à 10 000 g pour éliminer les agrégats potentiels. Sans perturber le plomb, aspirez le volume requis du surnageant. Ajustez le volume à 50 microlitres à l’aide d’un tampon à saponine.Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans 50 microlitres de mélange d’anticorps intracellulaires. Ajoutez un microlitre de chaque anticorps dans les puits de billes respectifs et incubez la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. Sans mélanger, ajoutez 150 microlitres de tampon à saponine dans chaque puits contenant des échantillons de cellules.Ajoutez 100 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence dans chaque puits de contrôle de compensation pour laver les billes. Une fois la plaque centrifugée, remettre en suspension la pastille cellulaire et les contrôles dans 200 microlitres de tampon de saponine et de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence, respectivement. Centrifugez la plaque à 500 g pendant six minutes à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant.Remettez en suspension les échantillons de cellules et les commandes de compensation dans 200 microlitres de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence. Transférez les suspensions dans des tubes de tri cellulaire activés par fluorescence marqués. Le séquençage de l’ARN sur cellule unique a permis d’identifier un amas microglial distinct des autres types de cellules cérébrales sur la base de profils transcriptionnels.L’analyse de l’expression différentielle a révélé des gènes significativement régulés à la hausse dans la microglie, notamment Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 et P2ry12. Des cellules microgliales ont été isolées avec succès à partir d’échantillons de cerveau vivant sur la base de leur expression distincte des marqueurs CD45 et CD11b. Des sous-populations microgliales distinctes ont été identifiées d’après des combinaisons de marqueurs d’activation, notamment CD80, CD86, iNOS, CD206 et Arg1, CD86 et CD64, et CD163 avec CD206.L’expression du gène marqueur de Ptprc et d’Itgam a été localisée spécifiquement dans le cluster microglial dans la projection umap, confirmant l’identité de ces cellules. L’analyse du graphique de violon a montré une expression plus faible des marqueurs anti-inflammatoires, tels que Fcgr1 et Cd86, dans la microglie traitée par rapport au témoin du véhicule.

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