Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

L’objectif global de cette expérience est de visualiser et de quantifier les événements de traduction compartimentés qui se produisent au cours des premières étapes de l’adhésion cellulaire. Cette méthode a une large application. Utilisez-le chaque fois qu’une réponse de traduction spécifique rapide peut être testée, par exemple lors de l’analyse de la migration cellulaire, de l’adhésion ou de la réponse précoce aux médicaments.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile, rapide et rentable. Il ne nécessite que de la puromycine, des anticorps dirigés contre la puromycine et le système d’imagerie confocal standard. Pour commencer, faites une suspension de cellules MRC-5.

Utilisez la trypsinisation, suivie d’une centrifugation, de l’élimination du surnageant, puis d’une remise en suspension dans du DMEM avec dix pour cent de FBS, à 40 mille cellules par millilitre. Incuber la suspension avec une rotation douce pendant 20 minutes pour dissocier complètement les complexes d’adhérence focale. C’est essentiel.

Ensuite, dans deux plats à fond de verre de 35 millimètres, ajoutez une suspension d’aliquotes de deux millilitres et incubez-les pour permettre l’adhésion cellulaire et la formation de SiC. Après 40 minutes, traitez une assiette avec du cycloheximide et remettez-la dans l’incubateur. Cette plaque fonctionnera comme le contrôle négatif.

Après 55 minutes, appliquez de la puromycine sur les deux plaques à la concentration prédéterminée et incubez les plaques pendant cinq minutes de plus. Après une heure d’ensemencement et cinq minutes de puromycine en coopération, lavez chaque assiette deux fois avec deux millilitres de PBS glacé. Fixez ensuite les cellules avec un millilitre de formaldéhyde à quatre pour cent dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante.

Après la fixation, lavez les cellules trois fois avec du PBS, puis perméabilisez les cellules à l’aide de 500 microlitres de triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les plaques trois fois avec du PBS, puis appliquez 500 microlitres d’un pour cent de BSA dans du PBS. Poursuivez l’incubation à température ambiante pendant 20 minutes de plus.

Pour éliminer l’excès de BSA, lavez les cellules trois fois avec 0,1 pour cent de Tween-20 dans du PBS. Maintenant, incubez les cellules avec 300 microlitres d’anticorps anti-puromycine. Retirez l’anticorps non lié en trois lavages avec 0,1 % de Tween-20.

Ensuite, appliquez trois cents microlitres d’un mélange de deux anticorps secondaires conjugués à des fluorophores pour visualiser les polypeptides puromycolés et de facteur. Incuber les cellules pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Au bout d’une heure, lavez les plaques trois fois pour éliminer les anticorps non liés, puis appliquez trois cents microlitres de solution Tween-20 à 0,1 %, complétée par du DAPI.

Laissez le DAPI rester dans les cellules pendant cinq minutes à température ambiante. Enfin, lavez les cellules quatre fois de plus, en terminant par un lavage au PBS pur. Ensuite, stockez les cellules dans deux millilitres de PBS pour l’imagerie.

À l’aide de n’importe quel système d’imagerie confocale disponible dans le commerce, déterminez d’abord les paramètres appropriés qui maximisent la plage dynamique pour la quantification. L’accent mis sur la quantification ne peut être obtenu que si la saturation de la taille maximale est évitée et que la concentration est correctement ajustée. Le réglage peut être atteint en ajustant soigneusement l’avantage de puissance laser et les décalages.

Tout d’abord, ajustez le facteur de zoom et le nombre de pixels pour optimiser la taille des pixels. Faites-le selon le théorème de Nyquist. Ensuite, diminuez la vitesse de balayage et utilisez la moyenne pour améliorer le rapport signal/bruit.

Ensuite, déterminez manuellement les plans focaux supérieur et inférieur appropriés le long de l’axe Z et définissez la taille de pas en calculant la résolution axiale et en divisant cette distance par 2,3. Le résultat typique est de 20 à 25 couches d’image. Une fois les paramètres ajustés, acquérez une image confocale d’une cellule entière à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile Plan Apo 60x avec une ouverture numérique de 1,42.

Pour quantifier et analyser les signaux flurophores, ouvrez d’abord une image correspondant à la couche du plan z d’intérêt dans l’image J.Puis, à l’aide de l’outil de dessin, tracez une ligne à travers la cellule où la quantification est souhaitée. Ensuite, modifiez le souffle de la ligne en double-cliquant sur droit. La moyenne des valeurs d’intensité sera calculée sur toute la largeur de la ligne, utilisez donc une ligne plus fine pour éviter le chevauchement des signaux provenant de différentes structures.

Ensuite, profilez la densité du signal le long de la ligne. Maintenant, répétez le processus de collecte de la densité du signal le long de la même ligne dans le canal qui correspond à un flurophore. Les valeurs seront toujours ordonnées en fonction de l’orientation de la ligne.

Maintenant, copiez les données du profil et collez-les dans une feuille de calcul pour analyse. Répétez ce processus de collecte de données à partir de chaque image du plan Z d’intérêt avant de procéder à l’analyse statistique. Alternativement, au lieu de collecter le signal le long d’un axe, le signal peut être collecté à partir d’une zone de l’image.

Utilisez d’abord la fonction de forme géométrique pour sélectionner une région d’intérêt. Ensuite, ajustez le niveau de seuil pour éviter tout arrière-plan. Dans l’histogramme des intensités de pixels, déplacez le curseur pour ajuster les pixels qui seront inclus dans la quantification.

Définissez le seuil pour éliminer tous les pixels rouges à l’extérieur de la cellule. Maintenant, définissez les paramètres de mesure nécessaires pour mesurer le signal d’intérêt et non le signal de fond. Basculez la limite vers les options de seuil et de densité intégrée.

Ensuite, utilisez la commande mesure. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre avec les valeurs de gris moyennes et le nombre de pixels dans la zone sélectionnée. Répétez maintenant le processus, en appliquant le même seuil pour déterminer l’intensité du signal dans toute la cellule.

Utilisez ensuite ces données pour calculer le rapport entre le signal dans la zone sélectionnée et celui de la cellule entière. Pour une mesure précise des événements de translation à l’aide de l’incorporation de purmycine, les conditions optimales pour une mesure axiale ont d’abord été évaluées. Un spectre de concentrations par rapport à un traitement de cinq ou dix minutes a été comparé.

La concentration acceptable de puromycine pour les cellules MRC-5 et HeLa était un peu plus élevée que celle nécessaire pour les cellules Huh-7. Les cellules traitées pendant dix minutes avec des concentrations élevées de puromycine ont généré principalement des polypeptides puromycolés plus petits. Les polypeptides plus petits se désamorcent plus rapidement et ne sont pas souhaitables.

Le temps d’incubation plus court a donc été jugé plus souhaitable. Le traitement au cycloheximide est un contrôle négatif efficace et important. Dans les cellules MRC-5, seul un signal faible de puromycine a été détecté après un traitement par cycloheximide.

En utilisant la quantification du signal axial, la localisation générale des polypeptides puromycolés correspondant à des protéines nouvellement synthétisées a pu être évaluée à différents niveaux au sein de la cellule. Une distribution quantitative du signal dans toute la cellule était également possible. Pour l’une ou l’autre technique, il était important de quantifier le signal pour chaque plan Z de la pile d’images afin d’évaluer avec précision les événements de translation dans une cellule entière.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer l’événement de traduction dans le compartiment subcellulaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée, si elle est correctement exécutée. Lorsque l’on pense à cette procédure, il est important de se rappeler que la concentration de puromycine et son temps d’incubation sont importants.

Pour limiter la diffusion, il est préférable de limiter le temps d’incubation. Il est également important de reconnaître que la qualité du type d’acquisition d’image est essentielle pour obtenir de bons résultats. N’oubliez pas que travailler avec du formaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans une cagoule chimique doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.