Une méthode d'isolement cellulaire ciblée via verre fonctionnalisation de surface

L’objectif global de ce processus de fonctionnalisation de la surface du verre est de permettre la capture et la libération en douceur des cellules d’intérêt. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’angiogenèse tumorale, en permettant le criblage de biomarqueurs cellulaires indiquant une résistance aux médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est entièrement personnalisable, pour pratiquement tous les types de cellules d’intérêt.

Tant qu’il existe un anticorps spécifique au type de cellule, la surface peut être adaptée pour sa capture. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’angiogenèse du cancer, elle peut également être appliquée à d’autres maladies, car des échantillons purifiés sont nécessaires au développement de schémas thérapeutiques plus personnalisés. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous essayions de développer un mécanisme de libération réversible pour capturer les cellules, en utilisant l’interaction entre la desthiobiotine et la famille des adivines.

Après avoir nettoyé une surface en verre dans une machine à plasma d’oxygène pendant cinq minutes selon le protocole de texte, préparez 2,5 millilitres de 3-aminopropyltriéthoxysilane reconstitué, ou solution APTES, en combinant 50 microlitres d’APTES et 2,45 millilitres d’éthanol dans un tube conique. Pipetez la solution APTES sur les surfaces en verre, puis couvrez les surfaces et placez-les sur une plate-forme agitée à température ambiante pendant 50 minutes pour répartir uniformément la couche d’APTES. Pendant ce temps, préchauffez le four à 55 degrés Celsius pour les assiettes à huit et 24 puits, ou à 90 degrés Celsius pour les plats en verre.

Après avoir retiré les plaques du shaker, utilisez de l’éthanol pour rincer les surfaces en verre conformément au protocole textuel. Avec 100 % d’azote gazeux, séchez les surfaces. Placez ensuite les plaques à huit et 24 puits dans le four pendant deux heures, ou les plats en verre dans le four pendant une heure.

Ensuite, préparez 2,5 millilitres de d-Desthiobiotine, ou solution de DSB, en mélangeant 1,5 milligramme par millilitre de DSB dans 37,5 microlitres de DMSO, et en ajoutant cinq milligrammes par millilitre d’EDC à 2 462,5 microlitres de tampon MES 0,1 molaire, pH 6. Combinez ensuite les deux solutions. Après 15 minutes, ajoutez un microlitre de BME pour éteindre la réaction entre le DSB et l’EDC.

Sortez les surfaces en verre fonctionnalisées APTES chaudes du four et laissez-les refroidir pendant cinq à 10 minutes. Ajoutez un tampon MES sur les surfaces en verre pour les rincer en tenant la pipette à un angle de 70 degrés afin que la pointe ne soit pas directement pointée vers la surface. Ensuite, déchargez et tirez le tampon à partir d’un point fixe, tel que le coin du puits.

Ensuite, utilisez le tampon MES pour rincer deux fois de plus. Appliquez la solution DSB sur les surfaces vitrées. Transférez-les sur une serviette en papier humide à l’intérieur d’une boîte de Pétri, couvrez le plat et incubez au réfrigérateur pendant 18 à 24 heures.

Après l’incubation à quatre degrés Celsius, utilisez du PBS pour rincer chaque surface en verre trois fois, comme démontré précédemment dans cette vidéo. Ensuite, diluez la streptavidine, ou solution mère SAV, à 0,4 milligramme par millilitre, et appliquez-la uniformément sur les surfaces en verre afin qu’une fine couche se forme. Après avoir incubé le verre pendant 18 à 24 heures, utilisez 150 microlitres de PBS pour rincer chaque surface trois fois.

Ensuite, mouillez une serviette en papier avec de l’eau déminéralisée et placez-la à plat dans une boîte de Pétri de 14 centimètres entourant les plaques pour retenir l’humidité dans les puits. Couvrez la boîte de Pétri avec les surfaces en verre et placez-la dans un réfrigérateur de niveau de biosécurité 1 à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour effectuer la capture de cellules, aspirez le milieu des flacons T175 de cellules.

Utilisez ensuite du PBS pour rincer les cellules et aspirer le tampon. Ajouter 10 millilitres d’agent liftant non enzymatique, tel que la solution de dissociation cellulaire, dans le flacon. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius pendant six minutes.

Après six minutes, ajoutez 10 millilitres de HBSS froid pour diluer l’agent liftant. Ensuite, pipetez 20 microlitres de cellules et utilisez un hémocytomètre pour les compter. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g, à quatre degrés Celsius, pendant cinq minutes.

Et utilisez HBSS pour remettre les cellules en suspension à une fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Pipette de haut en bas pour remettre les cellules en suspension dans la solution et réduire l’agglutination cellulaire qui peut réduire la liaison des anticorps. Ensuite, divisez la suspension cellulaire en solutions de contrôle et expérimentales distinctes.

Ajoutez les anticorps biotinylés aux solutions cellulaires respectives et incubez sur un mélangeur bout à bout à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Utilisez 150 microlitres de HBSS pour laver trois fois le verre fonctionnalisé en plaques à huit puits, comme démontré plus tôt dans la vidéo. Ajoutez la solution cellulaire dans les puits et incubez sur de la glace sur le shaker pendant 45 minutes.

Pendant ce temps, préparez une solution de 20 millimolaires de biotine dans un HBSS stérile. Ensuite, après l’incubation, utilisez doucement 150 microlitres de HBSS pour rincer la solution cellulaire du verre. Après avoir répété le rinçage deux fois de plus, ajoutez 150 microlitres de la solution de biotine à chaque puits de libération respectif et incubez pendant 20 minutes pour permettre à la réaction de se poursuivre.

Récupérez les cellules non spécifiquement liées en utilisant HBSS pour laver les cellules. Ensuite, procédez à l’imagerie et à l’analyse de fluorescence selon le protocole texte. Inclure des images de cellules vivantes dans un flacon comme témoin.

Dans cette expérience, MCF7GFP cellules ont été exposées à la surface fonctionnalisée. 60 % des cellules ont été capturées à l’aide de l’anticorps HLA-ABC. Lors de l’exposition à 20 millimolaires de biotine, 80 % des cellules capturées ont été libérées.

Comme le montre ici, lorsque les cellules MCF7GFP ont été mélangées avec des cellules RAW 264,7, 50 % des macrophages RAW ont été capturés, et l’ajout de 20 biotines micromolaires a ensuite libéré 80 % des cellules RAW capturées. Cette figure illustre que les macrophages RAW de contrôle positif ne présentent aucune activité de fluorescence. Cependant, les cellules MCF7GFP contrôle négatives sont positives pour la fluorescence de la GFP.

Étant donné qu’un excès d’anticorps peut diminuer la capture cellulaire, la concentration d’anticorps a été optimisée en titrant de zéro à 10 000 nanogrammes par millilitre d’anticorps HLA. Les résultats ont montré que la concentration idéale d’anticorps se situait entre 100 et 1 000 nanogrammes par millilitre. De plus, des expériences d’optimisation cellulaire ont déterminé que la concentration idéale de cellules pouvant être capturées est comprise entre un fois 10 à la cinquième et une fois 10 à la sixième cellule, puisque les quantités inférieures à ce nombre sont inférieures à l’arrière-plan.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours, avec moins de six heures de temps expérimental, sans compter les incubations nocturnes. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de collecter les lavages de cellules pendant les expériences, car ils peuvent donner des informations vitales sur l’efficacité de la surface. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la cytométrie en flux peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les niveaux d’expression des récepteurs que les cellules d’intérêt peuvent avoir.

Après son développement, la fonctionnalisation de surface a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des biomatériaux pour explorer l’intégration biosûre de matériaux, tels que les implants chez les patients pour une variété de maladies et de blessures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fonctionnaliser les surfaces en verre pour capturer et libérer les cellules d’intérêt, ce qui permet une analyse en aval. N’oubliez pas que travailler avec des cellules vivantes dans de l’azoture de sodium peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles qu’une formation appropriée, un EPI et une élimination, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.