Name: Une méthode disolement cellulaire ciblée via verre fonctionnalisation de surface (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez une méthode d'isolement cellulaire par fonctionnalisation de surface au verre utilisant desthiobiotine et streptavidine. Cette technique personnalisable permet la capture et libération réversibles de cellules pour étudier l'angiogenèse tumorale et la résistance aux médicaments.

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Nous tenons à remercier l’American Cancer Society, Illinois Division (282802) et la National Science Foundation CBET (1512598) pour leur soutien financier. Nous tenons également à remercier le Dr Dianwen Zhang de l’Institut Beckman de l’Université de l’Illinois pour sa formation en microscopie. Enfin, nous tenons à remercier Jared Weddell, Stacie Chen et Spencer Mamer pour leurs discussions instructives.

<ol><li>Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+cells%3A+a+novel+marker+of+endothelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage.</a> Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).</li>
<li>De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+expression+analysis+in+kidney+glomeruli+using+microdissection+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques.</a> Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).</li>
<li>Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+VEGFRs%2C+NRP1%2C+and+PDGFRs+on+Endothelial+Cells+and+Fibroblasts+Reveals+Serum%2C+Intra-Family+Ligand%2C+and+Cross-Family+Ligand+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).</li>
<li>Cheung, L. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+captured+cancer+cells+under+flow+acceleration+in+a+bio-functionalized+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel.</a> Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).</li>
<li>Privorotskaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+thermal+lysis+of+cells+using+silicon-diamond+microcantilever+heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters.</a> Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).</li>
<li>Park, K., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capture+and+lysis+of+vaccinia+virus+particles+using+silicon+nano-scale+probe+array%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array.</a> Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).</li>
<li>Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+breast+cancer+and+gastric+cancer+circulating+tumor+cells+by+use+of+an+anti+HER2-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device.</a> Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).</li>
<li>Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip+for+combinatorial+mixing+and+screening+of+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays.</a> Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).</li>
<li>Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+detection+of+cancer+cells+by+utilizing+integrated+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems.</a> Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a.</a> PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+pancreatic+circulating+tumour+cells+implicates+WNT+signalling+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis.</a> Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).</li>
<li>Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%3ECapture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">>Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).</li>
<li>Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-performance+microsystem+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells.</a> Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+cell-to-cell+variation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors.</a> Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+VEGF+receptors+on+endothelial+cells+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (9), e44791(2012).</li>
<li>Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+a+%26%2334%3Bcritical+shear+stress+level%26%2334%3B+applied+to+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb.+Technol%22%5BJournal%5D)">Determination of a &#34;critical shear stress level&#34; applied to adherent mammalian cells.</a> Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).</li>
<li>Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+anchor+targeted+cell+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Secondary anchor targeted cell release.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).</li>
<li>Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-by-cell+profiling+reveals+temporal+dynamics+of+VEGFR1+and+VEGFR2+membrane-localization+following+murine+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Hear.+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia.</a> Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).</li>
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<li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Avidin-Biotin+Technology%3A+Literature+Survey%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey.</a> Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+labeling+of+cancer+marker+Her2+and+other+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots.</a> Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).</li>
<li>Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+quantum+dot+calibration+standards+for+quantitative+fluorescent+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling.</a> J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).</li>
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<li>Naranbhai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+blood+processing+variations+on+natural+killer+cell+frequency%2C+activation%2C+chemokine+receptor+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function.</a> J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).</li>
<li>Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+solution-phase+and+vapor-phase+deposition+of+aminosilanes+on+silicon+dioxide+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces.</a> Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39; amélioration des techniques d&#39;isolement cellulaire favorise d&#39; études scientifiques dans les relations structure-fonction en neurosciences 18, la tige de programmation de cellules en biologie régénérative, et la signalisation angiogénique en biologie vasculaire 19. En effet, la culture de cellules primaires 20 (par exemple, les HUVEC) dans la biologie vasculaire se fait principalement par l&#39;utilisation de techniques d&#39;isolement des cellules. L&#39; isoleme...

Paillasse Les approches actuelles de séparation cellulaire (par exemple, cellules activées par fluorescence de tri 1, capture laser micro-dissection 2, immuno-bille magnétique séparation 1) peut prendre plusieurs heures de préparation et de tri. Ces grandes échelles de temps peuvent influer sur les niveaux d&#39;intervention et d&#39; expression physiologiques, résultant dans les analyses qui ne sont pas représentatifs de la réponse physiologique 3. Les systèmes sont nécessaires qui peuvent rapidement et efficacement isoler des types cellulaires spécifiques sans perturber le récepteur des niveaux de surface cellulaire afin d&#39;améliorer l&#39;isolement cellulaire et d&#39;enrichissement pour des applications biomédicales. Par conséquent, la justification de notre approche est de développer une approche douce pour l&#39;isolement cellulaire. Le &quot;laboratoire sur puce&quot; concept offre la promesse d&#39;ordres de grandeur plus rapide (heures à minutes) l&#39;isolement cellulaire, et implique le plus souvent la capture des cellules sur une surface et de libérer des cellules ou intracellulaire contents par le biais physique 4,5 ou des méthodes chimiques 6. Bien que ces approches offrent quelques avantages tels que l&#39; identification expression de protéines de 7,8, en identifiant l&#39; expression de l&#39; ARN 9-11, ou même fournir des cellules de culture in vitro 12,13, bon nombre de ces techniques ne peuvent pas être traduits à des diagnostics tels que le profilage de récepteur des cellules due à leurs environnements non-physiologiques. Agents de levage Enzymatic tels que les collagénases peuvent également affecter ces quantités de récepteurs 14,15, ce qui signifie des techniques de quantification du récepteur des cellules qui utilisent ces agents de levage ne ​​génère pas des données physiologiques précises. La lyse cellulaire prévient la différenciation entre les récepteurs de la surface d&#39; origine, et celles qui ont déjà été internalisée 16. Ce protocole décrit une approche rapide et douce pour l&#39;isolement cellulaire.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triéthoxysilane (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>Utilisé pour fabriquer une solution APTES à 2 %</td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma Pico</td><td>Diener</td><td>Modèle 1</td><td>Nettoie les surfaces et permet de lier le PDMS au verre</td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>Utilisé comme mécanisme de libération dans la surface de capture cellulaire.&nbsp ;</td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>British Drug Houses (BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>Dissout le DSB dans une solution</td></tr><tr><td>de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>5g : 22980 25g : 22981</td><td>Active les acides carboxyliques et permet la liaison des protéines à la surface du verre.</td></tr><tr><td>lame de culture non traitée à 8 puits</td><td>BD Falcon</td><td>Cas de 24 : 354118 Cas de 96 : 354108</td><td>Utilisé dans des expériences cellulaires impliquant un microscope à fluorescence Zeiss, telles que des expériences de capture initiale et de quantification</td></tr><tr><td>de libération Plaques à fond de verre à 24 puits</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>Utilisé dans des expériences cellulaires impliquant le lecteur de plaques, telles que les expériences d’anticorps et de titrage cellulaire</td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>Utilisé pour éteindre la réaction entre l’EDC et le DSB</td></tr><tr><td>Acide 4-morpholinoéthanesulfonique hydraté (MES hydraté à 99 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>Utilisé pour fabriquer un tampon MES de 0,1 M à utiliser dans la réaction EDC</td></tr><tr><td>Four de précision</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-475-153</td><td>Utilisé dans le durcissement de la couche PDMS et APTES.</td></tr><tr><td>Titramax 1000 Shaker</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>Utilisé pour assurer une répartition uniforme de l’APTES sur les surfaces.</td></tr><tr><td>1x Streptavidine 5 mg [e7105-5mg]</td><td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>Protéine de liaison à la biotine. Peut provoquer une irritation.</td></tr><tr><td>Plat en verre de 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>Utilisé dans les études HUVEC ainsi que dans les futures études de profilage.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 14 cm avec couvercle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>Utilisée pour contenir les échantillons en cours de fonctionnalisation et les transporter.</td></tr><tr><td>Cellules MCF7-GFP</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>Stocké dans de l’azote liquide</td></tr><tr><td>Macrophages de souris RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>Nous a été offert par le laboratoire Smith de l’Université de l’Illinois. Stocké dans de l’azote liquide.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>Conservé dans 100 ml à température ambiante</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modified Eagle</td><td>medium Cell Media Facility à l’École des sciences chimiques de l’UIUC</td><td>50003PC</td><td>Fournisseur : Corning</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Cell Media Facility de l’École des sciences chimiques de l’UIUC</td><td>25-025-CI</td><td>Déjà ajouté au DMEM par l’installation. Fournisseur : Corning.</td></tr><tr><td>Grattoir cellulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>Petit 23 cm 50 paquet</td></tr> Solution de <tr><td>dissociation cellulaire</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>Utilisé pour soulever des cellules de manière non enzymatique pour l’utilisation dans des expériences cellulaires</td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>Utilisé pour compter les cellules pour la quantification des solutions cellulaires et capturer et libérer l’efficacité.</td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>Utilisé pour libérer les cellules de la surface.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Créé à partir de la recette</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour maintenir les cellules en vie en suspension ainsi que pour laver les surfaces de liaison non spécifiques. Adapté de Cold Spring Harbor Protocols : In 500&nbsp ; ml, utilisez 4&nbsp ; g NaCl, 0,2&nbsp ; g KCl, 0,0402&nbsp ; g Na2PO4&#8226 ; 7H2O, 0,03 g KH2PO4 et 0,5 g de glucose. Ajouter de l’eau DI pour arriver&nbsp ; 500 ml, filtrer, puis réfrigérer.</td></tr><tr><td>Anticorps HLA-ABC</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>Anticorps utilisé pour capturer les cellules MCF7gfp</td></tr><tr><td>Anticorps hIgG</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>Anticorps utilisé pour capturer les cellules MCF7gfp</td></tr><tr><td>Cellules GFP MCF7 Cell</td><td>Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>Lignée de cancer du sein luminal qui a été transfectée avec une protéine fluorescente verte.</td></tr><tr><td>Coniques</td><td>Thermo-Scientific</td><td>15mL : 12-565-268</td><td>50/15 ml Coniques en plastique pour le stockage des solutions et des aliquotes.</td></tr><tr><td>Rotateurs mini-tubes (mélangeur d’bout en bout)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Utilisé pour incuber des anticorps et mélanger d’autres solutions cellulaires afin de mélanger</td></tr><tr><td>Axiovert 200M (microscope à fluorescence)</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Microscope à fluorescence inversée Zeiss Axiovert 200 M.</td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage Zeba</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>Utilisé pour purifier les anticorps nouvellement biotinylés après l’utilisation du kit de biotinylation. Instructions fournies à l’adresse suivante : http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation</td><td>Kit Thermo-Scientific</td><td></td><td>Utilisé pour biotinyler les anticorps afin de leur permettre de s’intégrer à la surface de capture</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX Lecteur multimode</td><td>Utilisé pour mesurer quantitativement l’intensité fluorescente dans les expériences de titrage.</td></tr></tbody></table>

une méthode d&#39;isolement cellulaire ciblée via verre fonctionnalisation de surface

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

L’un des facteurs limitant l’adoption et l’avancement de la médecine personnalisée est l’incapacité à développer des outils de diagnostic permettant de sonder les nuances individuelles dans l’expression d’un patient à l’autre. Les méthodologies actuelles qui tentent de séparer les cellules pour remplir ce créneau entraînent une perturbation de l’expression physiologique, ce qui rend la technique de séparation inutile en tant qu’outil de diagnostic. Dans ce protocole, nous décrivons la fonctionnalisation et l’optimisation d’une surface pour la capture et la libération cellulaires. Cette surface fonctionnalisée intègre des anticorps biotinylés avec une surface vitrée fonctionnalisée avec un aminosilane (APTES), de la desthiobiotine et de la streptavidine. La libération cellulaire est facilitée par l’introduction de biotine, permettant la collecte et la purification des cellules capturées par la surface. Cette libération se fait par le ciblage de la fraction secondaire desthiobiotine, ce qui se traduit par un paradigme de libération beaucoup plus doux. Cette réduction des réactifs agressifs et des forces de cisaillement réduit les modifications de l’expression cellulaire. La surface fonctionnalisée capture jusqu’à 80 % des cellules dans un mélange à cellules uniques et a démontré une capture de 50 % dans un mélange à deux cellules. Les applications de cette technologie aux xénogreffes et aux études de séparation du cancer sont étudiées. Les techniques de quantification pour la vérification de surface, telles que les analyses de lecteur de plaques et d’ImageJ, sont également décrites.

En utilisant ce protocole , nous montrons la capture cellulaire (Figure 3A) et la libération de cellules (figure 3C) de cellules MCF7GFP ainsi que des contrôles de cellules vivantes (figure 4). Nous avons quantifié la capture cellulaire de 60% ​​et 80% ont été libérés (figure 3C). Lorsque nous avons étendu cette approche à un mélange de RAW 264.7 macrophages et les cellules MCF7GFP, 50% des macrophages RAW ont été captur...

Ce protocole décrit la fonctionnalisation de surface personnalisable de la desthiobiotine, de la streptavidine et du système APTES afin d’isoler des types de cellules spécifiques d’intérêt. De plus, ce manuscrit couvre les applications, l’optimisation et la vérification de ce processus.

Une méthode d&#39;isolement cellulaire ciblée via verre fonctionnalisation de surface

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

L'objectif général de ce processus de fonctionnalisation de surface en verre est de permettre la capture douce et le relâchement de cellules d'intérêt. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'angiogenèse tumorale, en permettant le criblage de biomarqueurs cellulaires indiquant une résistance aux médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est entièrement personnalisable, pour pratiquement n'importe quel type cellulaire d'intérêt.À condition qu'il existe un anticorps spécifique au type cellulaire, la surface peut être adaptée pour capturer ces cellules. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'angiogenèse cancéreuse, elle peut également être appliquée à d'autres maladies, car des échantillons purifiés sont nécessaires au développement de traitements plus personnalisés. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous tentions de développer un mécanisme de relâchement réversible pour la capture de cellules, en utilisant l'interaction entre la desthiobiotine et la famille de l'avidine.Après avoir nettoyé une surface en verre dans une machine à plasma d'oxygène pendant cinq minutes conformément au protocole indiqué, préparez 2,5 millilitres d'une solution de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) reconstituée à 2 % en mélangeant 50 microlitres d'APTES et 2,45 millilitres d'éthanol dans un tube conique. Déposez la solution d'APTES sur les surfaces en verre à l'aide d'une pipette, puis recouvrez les surfaces et placez-les sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 50 minutes afin de répartir uniformément la couche d'APTES. Pendant ce temps, préchauffez le four à 55 degrés Celsius pour les plaques à huit et 24 puits, ou à 90 degrés Celsius pour les boîtes en verre.Après avoir retiré les plaques de l'agitateuse, rincez les surfaces en verre avec de l'éthanol conformément au protocole décrit dans le texte. Séchez les surfaces à l'aide d'un gaz azote à 100 %. Ensuite, placez les plaques à huit et à 24 puits au four pendant deux heures, ou les boîtes en verre au four pendant une heure.Ensuite, préparez 2,5 millilitres de d-Desthiobiotine, ou solution DSB, en mélangeant 1,5 milligramme par millilitre de DSB dans 37,5 microlitres de DMSO, puis en ajoutant cinq milligrammes par millilitre de EDC à 2 462,5 microlitres de tampon MES 0,1 Molaire, pH 6. Mélangez ensuite les deux solutions. Après 15 minutes, ajoutez un microlitre de BME pour arrêter la réaction entre la DSB et l'EDC.Retirer les surfaces de verre fonctionnalisées à l'APTES chaudes du four et les laisser refroidir pendant cinq à dix minutes. Ajouter du tampon MES sur les surfaces de verre pour les rincer en tenant la pipette à un angle de 70 degrés, de sorte que la pointe ne soit pas directement dirigée vers la surface. Ensuite, expulser et aspirer le tampon à partir d'un point fixe, comme le coin du puits.Ensuite, rincer deux fois supplémentaires avec le tampon MES. Appliquer la solution DSB sur les surfaces en verre. Les transférer sur une serviette en papier humide à l'intérieur d'une boîte de Pétri, couvrir la boîte et incuber au réfrigérateur pendant 18 à 24 heures.Après l'incubation à quatre degrés Celsius, rincez chaque surface de verre trois fois avec du PBS, comme démontré précédemment dans cette vidéo. Ensuite, diluez la solution mère de streptavidine, ou SAV, à 0,4 milligramme par millilitre, puis appliquez-la uniformément sur les surfaces de verre afin de former une fine couche. Après avoir incubé le verre de 18 à 24 heures, rincez chaque surface trois fois avec 150 microlitres de PBS.Humidifiez ensuite une serviette en papier avec de l'eau déionisée et placez-la à plat dans une boîte de Pétri de 14 centimètres autour des plaques afin de maintenir l'humidité dans les puits. Recouvrez la boîte de Pétri avec les surfaces en verre et placez-la dans un réfrigérateur de niveau de sécurité biologique 1 à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation. Pour effectuer la capture des cellules, aspirez le milieu des flacons T175 contenant les cellules.Ensuite, rincer les cellules avec du PBS et aspirer le tampon. Ajouter 10 millilitres d'un agent de détachement non enzymatique, tel que la solution de dissociation cellulaire, dans le flacon. Puis incuber à 37 degrés Celsius pendant six minutes.Après six minutes, ajouter 10 millilitres de HBSS froid pour diluer l'agent de détachement. Ensuite, prélever 20 microlitres des cellules et utiliser un hémocytomètre pour les compter. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g, à quatre degrés Celsius, pendant cinq minutes.Et utilisez du HBSS pour resuspendre les cellules à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre. Pipetez plusieurs fois de haut en bas pour bien resuspendre les cellules en solution et réduire l'agglutination cellulaire, qui pourrait diminuer la liaison des anticorps. Ensuite, divisez la suspension cellulaire en solutions distinctes, témoin et expérimentale.Ajoutez les anticorps biotinylés aux solutions cellulaires respectives et incubez-les sur un mélangeur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Utilisez 150 microlitres de HBSS pour laver le verre fonctionnalisé dans des plaques à huit puits trois fois, comme démontré précédemment dans la vidéo. Ajoutez la solution cellulaire dans les puits et incubez sur de la glace, avec agitation, pendant 45 minutes.Entre-temps, préparez une solution de biotine à 20 millimolaire dans du HBSS stérile. Ensuite, après l'incubation, rincez délicatement la solution cellulaire du verre à l'aide de 150 microlitres de HBSS. Après avoir répété le rinçage deux fois supplémentaires, ajoutez 150 microlitres de la solution de biotine dans chaque puits de libération correspondant, puis incubez pendant 20 minutes afin de permettre la progression de la réaction.Récupérez les cellules liées de façon non spécifique en lavant les cellules avec du HBSS. Ensuite, procédez à l'imagerie et à l'analyse de fluorescence conformément au protocole décrit dans le texte. Incluez des images de cellules vivantes dans un flacon en tant que témoin.Dans cette expérience, les cellules MCF7GFP ont été exposées à la surface fonctionnalisée. 60 % des cellules ont été capturées à l’aide de l’anticorps HLA-ABC. Après exposition à 20 millimolaire de biotine, 80 % des cellules capturées ont été libérées.Comme illustré ici, lorsque les cellules MCF7GFP ont été mélangées avec les cellules RAW 264,7, 50 % des macrophages RAW ont été capturés, et l'ajout de 20 micromolaire de biotine a ensuite libéré 80 % des cellules RAW capturées. Cette figure montre que les macrophages RAW utilisés comme témoin positif n'exhibent aucune activité de fluorescence. En revanche, les cellules MCF7GFP utilisées comme témoin négatif sont positives pour la fluorescence GFP.Étant donné qu'un excès d'anticorps peut réduire la capture des cellules, la concentration en anticorps a été optimisée par titrage allant de zéro à 10 000 nanogrammes par millilitre d'anticorps HLA. Les résultats ont montré que la concentration idéale en anticorps se situait entre 100 et 1 000 nanogrammes par millilitre. De plus, des expériences d'optimisation cellulaire ont déterminé que la concentration idéale de cellules pouvant être capturées se situe entre un fois dix puissance cinq et un fois dix puissance six cellules, car les quantités inférieures à ce nombre sont inférieures au bruit de fond.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours, avec moins de six heures de temps expérimental, hors les incubations nocturnes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de recueillir les lavages cellulaires au cours des expériences, car ils peuvent fournir des informations essentielles sur l'efficacité de la surface. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la cytométrie en flux peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les niveaux d'expression des récepteurs que pourraient présenter les cellules d'intérêt.Depuis son développement, la fonctionnalisation de surface a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des biomatériaux pour explorer l'intégration biocompatible de matériaux, tels que les implants chez les patients pour diverses maladies et blessures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de fonctionnaliser des surfaces de verre afin de capturer et de libérer des cellules d'intérêt, permettant ainsi des analyses ultérieures. N'oubliez pas que manipuler des cellules vivantes en présence d'azoture de sodium peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles qu'une formation adéquate, l'utilisation d'équipements de protection individuelle (EPI) et une élimination appropriée doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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