Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

L’objectif de ce protocole de criblage de siRNA est d’étudier l’impact du silençage génique sur la croissance des sphéroïdes de la lignée cellulaire cancéreuse. Par rapport aux techniques traditionnelles de culture cellulaire bidimensionnelle, les sphéroïdes cancéreux présentent des conditions plus similaires à celles rencontrées dans les tumeurs in vivo. Cette méthode est utile pour l’évaluation fonctionnelle des gènes fréquemment modifiés dans les cancers humains et, plus important encore, elle peut être utilisée pour déterminer quels gènes sont des oncogènes potentiels ou des suppresseurs de tumeurs dans des conditions de culture plus complexes, telles que celles observées dans la culture tridimensionnelle, et en particulier, en cas d’hypoxie.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facilement adaptable afin que les chercheurs puissent l’utiliser pour étudier leurs gènes d’intérêt particuliers dans leurs lignées cellulaires préférées. Nous pensons qu’il s’appuie sur les approches actuelles de criblage ciblé de l’ARN. Il est généralement admis que les criblages ciblés, plutôt que les souches du génome entier, permettent aux scientifiques de poser des questions spécifiques et de générer des résultats plus robustes.

Nous avons analysé l’effet du silençage génique sur la viabilité et la taille des sphéroïdes, mais vous pouvez également utiliser des colorants biométriques pour une lecture d’écran différente, comme l’apoptose. La démonstration de la procédure est assurée par Patty Wai de notre laboratoire. Commencez par décongeler des plaques de 96 puits contenant la banque de siRNA à température ambiante.

Ensuite, essorez pendant cinq minutes à 1 000 fois g, à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 10 microlitres de milieu sérique réduit contenant le réactif de transfection optimisé dans les puits de chaque plaque. Incuber pendant 15 minutes pour permettre la formation de complexes de transfection, contenant des siRNA.

Comme pour tout pipeline de criblage, la capacité de formation de sphéroïdes des lignées cellulaires dans des conditions de transfection doit être optimisée de manière robuste avant d’effectuer le criblage complet. Ensuite, essayez de tester les cellules à tamiser jusqu’à ce qu’elles se détachent du ballon. Une fois que les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec un volume approprié de milieu spécifique à la lignée cellulaire, transférez-la dans un tube à centrifuger et faites-la tourner pendant cinq minutes à 1 000 fois g dans une centrifugeuse de paillasse pour recueillir les cellules.

Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans une suspension unicellulaire avec un volume de milieu approprié. Effectuez un comptage de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Diluez ensuite la suspension à 5 000 cellules par 180 microlitres avec un milieu froid.

Transférez la suspension cellulaire dans un réservoir. À l’aide d’une pipette multicanaux, réglée à 180 microlitres, pipeter pour mélanger et transférer la suspension cellulaire sur la plaque à 96 puits contenant l’ARNi. Centrifugez la plaque à 1 000 fois g dans une centrifugeuse pré-refroidie à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis incubez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.

À ce stade, les cellules apparaîtront comme une mosaïque au fond des puits. Après 24 heures, observez les cellules au microscope. À ce stade, les cellules doivent être agrégées pour former un seul sphéroïde au centre du puits.

Ajoutez 100 microlitres de milieu complet dans chaque puits pour favoriser la croissance avant de retourner à l’incubateur. Après trois jours de croissance, retirez délicatement 100 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 100 microlitres de milieu frais. Le septième jour, examinez les sphéroïdes au microscope, puis procédez à la quantification de la taille des sphéroïdes sur un lecteur de plaques qui peut surveiller quantitativement la croissance des sphéroïdes au fil du temps.

Pour quantifier la taille du sphéroïde, ouvrez d’abord le logiciel sur l’ordinateur. Sélectionnez Plaque à 96 puits, sélectionnez le type de plaque approprié et entrez un nom d’expérience. Ensuite, insérez la plaque à 96 puits contenant les sphéroïdes dans un cytomètre d’imagerie à plaque micro-puits de paillasse.

Ensuite, sélectionnez l’application Tumorsphere. Sélectionnez la mise au point basée sur l’image pour modifier la mise au point afin que le sphéroïde soit net et ait un contraste optimal. Sélectionnez les puits à analyser et lancez l’analyse.

Ensuite, assurez-vous que le masque d’objet représente précisément la taille du sphéroïde. Pour les sphéroïdes BT474 cultivés pendant sept jours, ajustez la précision à élevée et réglez le diamètre minimum de la colonie à 200 microns. Utilisez la fonction Exporter pour exporter les données sous la forme d’un fichier de données annoté qui sera analysé afin d’identifier les siARN ayant un effet statistiquement significatif sur la surface des sphéroïdes.

Après l’imagerie, retirez 100 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 100 microlitres de colorant de viabilité luminescente pour déterminer la viabilité cellulaire. Après avoir incubé les plaques pendant 15 minutes, scannez la plaque à l’aide d’un lecteur de plaques luminescent. Ce protocole peut également être adapté pour être utilisé avec d’autres lignées cellulaires cancéreuses.

La procédure de transfection inverse des témoins non ciblés n’a pas affecté de manière significative la viabilité des lignées testées, tandis que la transfection de l’ubiquitine B, un contrôle positif de destruction des cellules, a significativement diminué la viabilité. Les cellules BT474 ont été transfectées inversement avec la banque de siARN siGENOME humain de 200 gènes en trois exemplaires. La surface et la viabilité des sphéroïdes ont été observées.

Des valeurs aberrantes significatives avec un score z supérieur à 1,7 ont été identifiées. Les ARNi qui ont considérablement augmenté ou réduit la surface et la viabilité des sphéroïdes sont ombrés en bleu, et le rouge représente les ARNi de contrôle. Cet ensemble de micrographies montre des images représentatives des sphéroïdes BT474 sept jours après la transfection inverse avec E-Cadhérine, un contrôle non ciblant, PIK3CA, ERBB2 ou siRNA SF3B1.

Cet histogramme montre comment le traitement avec chaque siRNA a affecté la viabilité cellulaire sept jours après la transfection inverse. L’inactivation d’ERBB2 et de PIK3CA a considérablement réduit la viabilité cellulaire par rapport aux témoins. Cette image démontre que les sphéroïdes peuvent être immunomarqués avec succès pour révéler l’impact du silençage génique sur les protéines cibles.

Une fois maîtrisés, plusieurs centaines de gènes peuvent être criblés dans plusieurs lignées cellulaires en une journée, ce qui permet d’identifier de manière robuste de nouveaux gènes potentiellement importants pour la survie en culture tridimensionnelle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver avec succès des sphéroïdes de cellules cancéreuses qui se prêtent au silençage génique médié par l’ARNs. Vous serez également en mesure d’étudier l’impact du silençage génique en effectuant une immunohistochimie sur les sphéroïdes.

Cela peut offrir des informations spatiales précieuses qui peuvent vous informer sur la biologie sous-jacente.