Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Notre protocole est important car il décrit une génération de modèles de culture tumorale 3D à partir de cellules cancéreuses primaires, et ce modèle représente mieux la biologie tumorale du monde réel que les lignées cellulaires. Cette approche est applicable à une variété de tumeurs solides. Il est également rentable car il peut être effectué du début à la fin dans un laboratoire de biologie cellulaire typique.

Les modèles tumoraux 3D générés à l’aide de cette approche soutiennent la recherche sur la sensibilité et la résistance des tumeurs aux thérapies anticancéreuses ou à une combinaison de thérapies. Cette approche génère des modèles 3D à partir de cellules cancéreuses primaires. Par conséquent, il pourrait identifier quelle thérapie est susceptible d’être efficace pour un certain patient et ainsi aider à personnaliser son traitement.

La démonstration de la procédure sera Ella Itzhaki, une doctorante de mon laboratoire. Pour commencer, prenez une petite fiole T25 avec une culture cellulaire primaire adhérente à une seule cellule et retirez le milieu de culture cellulaire. Lavez les cellules avec du PBS et ajoutez un millilitre de 1x Accutase pendant trois minutes à 37 degrés Celsius pour préparer une suspension unicellulaire de cultures de cellules tumorales primaires adhérentes de 75 à 100% de confluence.

Neutraliser la solution d’Accutase en ajoutant cinq millilitres de milieu de culture cellulaire. Aspirez les cellules avec une pipette sérologique de 10 millilitres et déposez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 800g pendant cinq minutes à température ambiante.

Retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez huit millilitres de milieu de culture cellulaire frais sur le dessus de la pastille cellulaire, puis mélangez doucement. Pour compter les cellules viables avec un hémocytomètre, prenez une partie aliquote de 50 microlitres de la suspension cellulaire et mélangez-la avec 50 microlitres de bleu de trypan. Ensuite, comptez les cellules vivantes et calculez le nombre total de cellules vivantes dans la suspension.

Ensuite, préparez le milieu de culture 3D. Et après avoir calculé le nombre de cellules nécessaires pour le test et le volume total requis, préparez la suspension cellulaire avec le nombre souhaité de cellules dans 200 microlitres du milieu de culture 3D. Mélanger délicatement avec la pipette pour assurer une distribution homogène.

Transférez la suspension dans un réservoir de pipetage et ajoutez 200 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 96 puits à fixation ultra-basse avec une pipette multicanal. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante pour renforcer le regroupement des cellules, améliorant ainsi l’agrégation cellulaire, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Après centrifugation à nouveau à 300g pendant 10 minutes à température ambiante, retirer délicatement et éliminer 50% du milieu, et ajouter 100 microlitres de milieu de culture 3D frais pour remplacer la solution existante.

Répétez cette étape et replacez la plaque dans l’incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Inspectez les cellules au microscope tous les un à deux jours pour surveiller la formation de sphéroïdes. Mesurez le diamètre des sphéroïdes formés à l’aide de l’outil de mise à l’échelle du logiciel d’imagerie.

Et une fois que le diamètre du sphéroïde atteint 100 à 200 micromètres, effectuez les expériences d’efficacité du médicament. Pour la collecte des sphéroïdes, utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour recueillir les sphéroïdes de chaque puits et déposez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube conique à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirer et jeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.

Ajouter 0,5 millilitre du milieu de culture cellulaire et remettre en suspension la pastille bien mais doucement. Pour effectuer le comptage des sphéroïdes, utilisez une plaque de 96 puits et dessinez un signe plus sur la face inférieure d’un puits pour diviser le puits en quadrants. Ajouter 50 microlitres de la suspension au puits.

Et avec une lentille d’objectif 10x, comptez les sphéroïdes manuellement au microscope. Comptez les sphéroïdes dans chaque quadrant et calculez le nombre total de sphéroïdes dans le puits. Ensuite, calculez la concentration de sphéroïdes en doublant le nombre de sphéroïdes en comptant le volume, et calculez le nombre total de sphéroïdes dans la suspension.

Dans un nouveau tube, préparer la suspension sphéroïde à une concentration de 200 sphéroïdes par 200 microlitres de milieu de culture cellulaire. Pour chaque traitement médicamenteux, préparez le stock de sphéroïdes dans un tube différent. Calculez la quantité totale nécessaire pour chaque médicament par le nombre de puits nécessaires pour les répétitions, et ajoutez le médicament dans le tube à la concentration finale nécessaire.

Transférez 200 microlitres de la suspension sphéroïde dans les puits d’une plaque de 96 puits à très faible attachement et incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Après avoir incubé les sphéroïdes avec le médicament à l’étude pendant 24 à 72 heures, centrifuger la plaque à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante et retirer délicatement 170 microlitres du milieu de culture cellulaire, en laissant 30 microlitres au fond du puits. Préparez la solution MTT et ajoutez 70 microlitres de la solution à chaque puits pour obtenir un volume final de 100 microlitres par puits.

La concentration finale de MTT dans le puits sera de 0,05 milligramme par 100 microlitres. En outre, préparez des puits blancs avec une solution MTT sans cellules. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone pendant trois à quatre heures jusqu’à ce qu’un changement de couleur de la solution dans les puits soit observé.

Lorsqu’un changement est observé, ajoutez 100 microlitres de solution Stop à chaque puits et mélangez délicatement le contenu des puits sans créer de bulles. Lire l’absorbance de la plaque dans un lecteur ELISA à paramètre à une longueur d’onde de 570 nanomètres et une longueur d’onde de fond de 630 à 690 nanomètres. Pour calculer la viabilité de la cellule, calculez le signal spécifique pour chaque puits.

Calculez ensuite la valeur moyenne des puits blancs et soustrayez cette valeur de chaque puits. Calculer la moyenne des signaux spécifiques dans les puits témoins qui contiennent des cellules qui n’ont pas été traitées avec le médicament à l’étude. Enfin, calculez la viabilité des cellules de chaque puits par rapport aux puits contenant des cellules non traitées.

La formation de sphéroïdes à partir d’une culture de cellules cancéreuses du côlon primaire au fil du temps par le nombre de cellules initialement ensemencées est montrée ici. À partir de cette figure, on peut voir que le nombre de sphéroïdes générés dépend du nombre de cellules initialement ensemencées dans chaque puits. Les sphéroïdes des cellules cancéreuses primaires du côlon après 10 jours en culture avec un ensemencement cellulaire initial de 2 000 par puits sont présentés ici.

Après une culture prolongée des sphéroïdes du cancer du côlon, ils ont commencé à s’attacher les uns aux autres et ont formé des grappes de sphéroïdes et de structures ressemblant à des raisins qui ont empêché une culture homogène et ont donc interdit l’utilisation des sphéroïdes dans les tests MTT. Les effets du palbociclib, du sunitinib et de leur combinaison sur les sphéroïdes des cellules tumorales primaires, y compris le cancer du côlon et du sein, sont présentés ici. Un test MTT a été effectué sur des sphéroïdes dérivés de cellules cancéreuses du côlon et du sein.

Les signaux MTT ont été normalisés aux valeurs des cellules traitées par DMSO. Les valeurs représentent les moyennes de quatre à huit répétitions. Les effets des différents traitements sur la croissance cellulaire ont également été évalués au microscope au jour zéro et après trois jours de traitement des sphéroïdes dérivés du cancer du côlon et des cellules cancéreuses du sein.

Les effets du trastuzumab plus vinorelbine et du 5 fluorouracile plus cisplatine sur les sphéroïdes dérivés du cancer du sein au fil du temps sont présentés dans cette figure. La variation du diamètre des sphéroïdes par rapport au jour zéro par la durée du traitement est illustrée ici. Chaque groupe de traitement comprenait quatre à six puits avec un sphéroïde dans chaque puits.

La variation moyenne est présentée ici. Les sphéroïdes sont des outils importants pour de nombreuses études au-delà de la réponse au traitement anticancéreux. Ces études abordent, par exemple, l’administration de médicaments et même des questions de biologie fondamentale telles que les interactions cellule-cellule.

Il est essentiel de démarrer un processus de génération de sphéroïdes avec une suspension unicellulaire. Il est également essentiel d’utiliser des plaques de fixation ultra-basses avec un support contenant une métrique de membrane de base de 5%.