Name: Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Découvrez la génération de sphéroïdes tumoraux 3D à partir de cellules cancéreuses primaires pour évaluer la sensibilité aux thérapies anticancéreuses. Cette méthode économique permet de personnaliser les traitements.

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La collecte d’échantillons de tumeurs humaines utilisés pour les cultures de cellules tumorales primaires a été effectuée conformément aux protocoles approuvés par le comité d’examen institutionnel (IRB) au Centre médical Rabin avec le consentement éclairé écrit des patients. Les patients admissibles à participer à l’étude comprenaient des patients atteints d’un cancer du sein, du côlon, du foie, du poumon, neuroendocrinien, ovarique ou pancréatique non métastatique, de tout cancer pédiatrique ou de tout cancer métastatique. Le seul critère d’exclusion était l’incapacité de donner un consentement éclairé.
1. Génération et collection de sphéroïdes
NOTE: L’isolement des cellules tumorales primaires peut être effectué comme décrit par Kodak et al.8. Il est important de noter que les cellules tumorales primaires utilisées pour générer les sphéroïdes peuvent être dérivées directement d’échantillons de patients obtenus par biopsie, résection, etc., ou indirectement à l’aide d’échantillons tumoraux provenant de modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX), comme décrit par Moskovits et al.9.
<ol><li>Préparer une suspension unicellulaire de cultures de cellules tumorales primaires adhérentes de 75% à 100% de confluence en prenant une petite fiole (T25) avec une culture cellulaire primaire adhérente unicellulaire, en retirant le milieu de culture cellulaire, en le lavant avec du PBS, puis en ajoutant 1 mL de 1x Accutase (une solution de détachement cellulaire) (voir le tableau des matériaux) pendant 3 min à 37 °C.</li>
	<li>Neutraliser la solution d’Accutase en ajoutant 5 mL de milieu de culture cellulaire (milieu de culture RPMI-1640 supplémenté avec 10% FBS, 1:100 pénicilline-streptomycine, 1% d’acides aminés non essentiels et 1% de L-glutamine; voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Aspirer les cellules avec une pipette sérologique de 10 ml et les déposer dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger le tube à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer le milieu de culture cellulaire, ajouter 5 mL de milieu de culture cellulaire frais sur le dessus de la pastille cellulaire et mélanger délicatement.</li>
	<li>Comptez les cellules viables avec un hémocytomètre10. Pour ce faire, prenez une partie aliquote de 50 μL de la suspension cellulaire et mélangez-la avec 50 μL de bleu de trypan. Comptez les cellules vivantes (les cellules négatives pour la couleur bleue) et calculez le nombre total de cellules vivantes dans la suspension.</li>
	<li>Préparer un « milieu de culture 3D » (milieu de culture cellulaire complété à 5 % de matrice membranaire basale ; voir le tableau des matériaux). REMARQUE: Le « milieu de culture 3D » est liquide à température ambiante. À 37 °C, la consistance devient plus gélatineuse (de sorte que les cellules restent ensemble), bien qu’elle puisse encore être pipetée (car elle ne contient que 5% de matrice membranaire basale).</li>
	<li>Calculer le nombre de cellules nécessaires pour le test et le volume total requis; chaque puits doit contenir 2 000 à 8 000 cellules dans 200 μL de milieu.</li>
	<li>Préparer une suspension cellulaire avec le nombre désiré de cellules (par exemple, 4 000 cellules) dans 200 μL du « milieu de culture 3D » et mélanger délicatement avec la pipette pour assurer une distribution homogène.</li>
	<li>Transférer la suspension dans un réservoir de pipetage. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 200 μL de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de fixation ultrabasse de 96 puits (voir le tableau des matériaux). Avant chaque collecte des cellules, mélangez bien la suspension.</li>
	<li>Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min à température ambiante pour renforcer le regroupement des cellules, améliorant ainsi l’agrégation cellulaire, et incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2.</li>
	<li>Tous les 2-3 jours, rafraîchissez le « milieu de culture 3D ». Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min à température ambiante, retirer délicatement et éliminer 50 % du milieu (100 μL), et ajouter 100 μL de « milieu de culture 3D » frais pour remplacer la solution existante. Répétez l’étape 1.11 et replacez la plaque dans l’incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2. NOTE: L’enlèvement du milieu doit être effectué lorsque la plaque est maintenue à 45°, et le milieu doit être recueilli uniquement à partir de la partie supérieure pour éviter la collecte des cellules. Un système d’aspiration sous vide ne doit pas être utilisé. Le milieu frais doit être ajouté lentement et doucement afin de ne pas perturber les sphéroïdes, qui auront déjà commencé à se former.</li>
	<li>Inspectez les cellules au microscope tous les 1-2 jours pour surveiller la formation de sphéroïdes. Mesurer le diamètre des sphéroïdes formés à l’aide de l’outil « échelle » du logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux). NOTE: L’inspection microscopique doit d’abord révéler des corps ronds à ovales irréguliers qui prennent une forme sphéroïde au fil du temps11,12.<ol><li>Lorsque le diamètre du sphéroïde atteint 100-200 μm, effectuez les expériences d’efficacité du médicament. NOTE: Les expériences d’efficacité du médicament sont effectuées lorsque les sphéroïdes atteignent ce diamètre car, à ce moment-là, la majorité des cellules prolifèrent, ce qui est propice à l’évaluation de la réponse au traitement. Les sphéroïdes de plus grand diamètre contiennent un noyau nécrotique et une couche quiescente11,12, ce qui réduit la proportion de cellules proliférantes qui répondent au traitement.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour la collecte des sphéroïdes, utilisez une pipette de 1 000 μL pour recueillir les sphéroïdes de chaque puits et déposez-les dans un tube conique de 15 mL. REMARQUE: Les sphéroïdes sont intrinsèquement fragiles et nécessitent une manipulation douce. Lors du transfert du milieu avec les sphéroïdes dans le tube conique, maintenez le tube à 45 ° et pipette lentement sur la paroi du tube. Les sphéroïdes sont visibles à l’œil.</li>
	<li>Centrifuger le tube conique à 300 x g pendant 5 min à température ambiante, puis aspirer et jeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL du milieu de culture cellulaire et remettre en suspension la pastille bien mais doucement. Évitez de faire des bulles.</li>
	<li>Effectuez le comptage des sphéroïdes en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Utilisez une plaque de 96 puits et dessinez un signe plus sur la face inférieure d’un puits pour diviser le puits en quadrants (pour aider à suivre le comptage).</li>
		<li>Ajouter 50 μL de la suspension dans le puits et compter les sphéroïdes manuellement au microscope (à l’aide d’une lentille d’objectif 10x).</li>
		<li>Comptez les sphéroïdes dans chaque quadrant, veillez à ne pas compter deux fois et calculez le nombre total de sphéroïdes dans le puits. NOTE: Pour l’exactitude du comptage, compter au moins 50 sphéroïdes dans un puits. S’il y a moins de 50 sphéroïdes, mélanger délicatement la suspension pour assurer une distribution homogène et compter à nouveau en utilisant un plus grand volume de la suspension ajoutée à un nouveau puits. Alternativement, s’il y a moins de 50 sphéroïdes dans un puits, les sphéroïdes peuvent être centrifugés et remis en suspension doucement dans un volume de <0,5 mL. S’il y a plus de 100 sphéroïdes, ajoutez le milieu de culture cellulaire à la suspension sphéroïde, mélangez doucement et recomptez.</li>
		<li>Calculez la concentration de sphéroïdes (nombre de sphéroïdes/volume de comptage [μL]), puis calculez le nombre total de sphéroïdes dans la suspension (concentration de sphéroïdes × volume total).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Essai d’efficacité du médicament (test MTT)
NOTE: Pour plus de détails, veuillez consulter van Meerloo et al.13. De plus, pour le test MTT, seul le milieu de culture cellulaire et non le « milieu de culture 3D » doit être utilisé (l’ajout de la matrice membranaire basale n’est pas nécessaire et pourrait potentiellement interférer avec le test MTT).
<ol><li>Dans un nouveau tube, préparer une suspension sphéroïde à une concentration de 200 sphéroïdes par 200 μL de milieu de culture cellulaire (milieu de culture RPMI-1640 complété par 10% FBS, 1:100 pénicilline-streptomycine, 1% d’acides aminés non essentiels et 1% de L-glutamine).<ol><li>Pour chaque traitement médicamenteux, préparez un bouillon de sphéroïdes dans un tube de 15 mL. Calculez la quantité nécessaire pour chaque médicament par le nombre de puits nécessaires pour les répétitions: (5-8) × 200 μL. Ajouter le médicament dans le tube à la concentration finale nécessaire. REMARQUE : Veuillez consulter la section des résultats représentatifs concernant les médicaments utilisés pour la présente étude et leur posologie. En outre, les détails commerciaux des médicaments sont énumérés dans le tableau des matériaux.</li>
	</ol></li>
	<li>Transférer 200 μL de la suspension sphéroïde dans les puits d’une plaque à 96 puits à très faible accessoire et incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2. N’utilisez pas les rangées et les colonnes externes de la plaque de 96 puits pour l’essai, car ces puits sont caractérisés par une évaporation accrue, ce qui pourrait entraîner une variabilité accrue entre les expériences répétées; au lieu de cela, ajoutez PBS à ces puits. NOTE: Il est essentiel que la culture des sphéroïdes soit homogène avant que la culture ne soit aliquote dans la plaque de 96 puits. De plus, une condition de contrôle (c.-à-d. sphéroïdes non traités) doit être incluse dans chaque expérience.</li>
	<li>Après avoir incubé les sphéroïdes avec le médicament à l’étude pendant 24-72 h, centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et retirer doucement 170 μL du milieu de culture cellulaire, en laissant 30 μL (y compris les sphéroïdes) au fond du puits. NOTE: L’élimination des 170 μL de milieu de culture cellulaire doit être faite avec soin, afin de ne pas éliminer les sphéroïdes. Tenez la plaque à 45° et placez une main (portant un gant foncé pour le contraste) sous les puits afin que les sphéroïdes soient visibles (points blancs).</li>
	<li>Préparer la solution de MTT (0,714 mg/mL en RPMI sans phénol, voir le tableau des matières).</li>
	<li>Ajouter 70 μL de solution de MTT à chaque puits jusqu’à un volume final de 100 μL par puits (la concentration finale de MTT dans le puits sera de 0,05 mg par 100 μL). En outre, préparez des puits « Blank » avec une solution MTT sans cellules. REMARQUE: MTT est sensible à la lumière. Par conséquent, la lumière dans la hotte doit être éteinte et le tube contenant la solution MTT doit être recouvert de papier d’aluminium.</li>
	<li>Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 pendant 3-4 h jusqu’à ce qu’un changement de couleur de la solution dans les puits (la couleur pourpre représente les cellules vivantes) soit observé.</li>
	<li>Lorsqu’un changement est observé, ajouter 100 μL de solution stop (0,1N HCl dans l’isopropanol) à chaque puits, et mélanger délicatement le contenu des puits sans créer de bulles.</li>
	<li>Lire l’absorbance de la plaque dans un lecteur Fluorometer-ELISA (voir le tableau des matériaux) à une longueur d’onde de 570 nm et une longueur d’onde de fond de 630-690 nM. REMARQUE: Si le lecteur Fluorometer-ELISA disponible ne peut pas lire la plaque de fixation ultra-basse de 96 puits, transférez le contenu de chaque puits sur une plaque correspondante à fond plat de 96 puits.</li>
	<li>Calculez la viabilité de la cellule en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Pour chaque puits, calculez le « signal spécifique » (« signal spécifique » = le signal à 570 nm - le signal à 630-690 nm). Ensuite, calculez la valeur moyenne des puits « vierges » et soustrayez cette valeur de chaque puits.</li>
		<li>Calculer la moyenne des « signaux spécifiques » dans les puits témoins qui contiennent des cellules qui n’ont pas été traitées avec le médicament à l’étude (« AV-SS-unt »).</li>
		<li>Calculer la viabilité (pourcentage) des cellules dans chaque puits par rapport aux puits avec des cellules non traitées. NOTE: Viabilité = (signal spécifique dans chaque puits/"AV-SS-unt ») × 100</li>
	</ol></li>
</ol>3. Surveillance et analyse des changements morphologiques chez les sphéroïdes
REMARQUE : En ce qui concerne le test MTT, seul le milieu de culture cellulaire et non le « milieu de culture 3D » doit être utilisé dans cette évaluation (l’ajout de la matrice membranaire basale n’est pas nécessaire et pourrait potentiellement interférer avec l’analyse).
<ol><li>Après avoir compté les sphéroïdes, diluer la suspension dans un milieu de culture cellulaire (milieu de culture RPMI-1640 supplémenté avec 10% FBS, 1:100 pénicilline-streptomycine, 1% d’acides aminés non essentiels et 1% de L-glutamine) à environ 1-2 sphéroïdes par 20 μL.</li>
	<li>Mettez 80 μL de milieu de culture cellulaire dans les puits d’une plaque de 96 puits à très faible attache, puis ajoutez 20 μL de la suspension sphéroïde aux puits. NOTE: Les puits contiendront donc 1-2 sphéroïdes dans un volume de 100 μL.</li>
	<li>Vérifiez soigneusement les puits au microscope et marquez les puits qui contiennent un sphéroïde, car ils seront utilisés pour cette analyse.</li>
	<li>Préparer le médicament à l’étude à une concentration qui est deux fois supérieure à la concentration d’intérêt. Ajouter 100 μL de la solution médicamenteuse aux puits concernés (la concentration totale dans le puits sera alors de 1x).</li>
	<li>Prenez une image de chaque puits au jour 0 (avant d’ajouter le médicament à l’étude) et utilisez l’outil « échelle » du logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux) pour déterminer les diamètres des sphéroïdes.</li>
	<li>Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO2, examiner la morphologie et mesurer le diamètre des sphéroïdes (à l’aide de l’outil « échelle ») quotidiennement pendant 3 à 7 jours, selon le moment où l’effet du médicament est observé (p. ex. dissémination cellulaire, gousses invasives, destruction de la structure, etc.).</li>
	<li>À la fin de l’expérience, tracez les changements dans les diamètres des sphéroïdes (par rapport au jour 0) au fil du temps. NOTE: Changement (pourcentage) = (diamètre du sphéroïde à un jour spécifique / le diamètre de ce sphéroïde au jour 0) × 100</li>
</ol>

<ol><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tumor+models%3A+Advantages%2C+disadvantages%2C+variables%2C+and+selecting+the+right+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4(2020).</li>
<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+What+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381(2021).</li>
<li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+de+Investigacio%CC%81n+Cli%CC%81nica%22%5BJournal%5D)">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).</li>
<li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284(2022).</li>
<li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+goes+three-dimensional%3A+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li>
<li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li>
<li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665(2022).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).</li>
<li>Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Periodicum+Biologorum%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152(2021).</li>
<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+The+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le présent protocole décrit une méthode simple pour générer des cultures cellulaires primaires 3D (sphéroïdes) dérivées d’échantillons de tumeurs humaines. Ces sphéroïdes peuvent être utilisés pour diverses analyses, y compris l’évaluation de candidats médicaments potentiels et de combinaisons de médicaments, l’identification de biomarqueurs potentiels ou de cibles thérapeutiques, et l’étude des mécanismes de réponse et de résistance. Le protocole utilise soit des cellules tumorales primaires dérivées directement d’échan...

Les études in vitro et in vivo représentent des approches complémentaires pour le développement de traitements contre le cancer. Les modèles in vitro permettent de contrôler la plupart des variables expérimentales et facilitent les analyses quantitatives. Ils servent souvent de plates-formes de criblage à faible coût et peuvent également être utilisés pour des études mécanistes1. Cependant, leur pertinence biologique est intrinsèquement limitée, car de tels modèles ne reflètent que partiellement le microenvironnement tumoral1. En revanche, les modèles in vivo, tels que les xénogreffes dérivées de patients (PDX), capturent la complexité du microenvironnement tumoral et conviennent mieux aux études translationnelles et à l’individualisation du traitement chez les patients (c’est-à-dire l’étude de la réponse aux médicaments dans un modèle dérivé d’un patient individuel)1. Cependant, les modèles in vivo ne sont pas propices aux approches à haut débit pour le dépistage des médicaments, car les paramètres expérimentaux ne peuvent pas être contrôlés aussi étroitement que les modèles in vitro et parce que leur développement prend du temps, exige beaucoup de main-d’œuvre et coûtecher 1,2.
Les modèles in vitro sont disponibles depuis plus de 100 ans et les lignées cellulaires depuis plus de 70 ans3. Au cours des dernières décennies, cependant, la complexité des modèles in vitro disponibles de tumeurs solides a considérablement augmenté. Cette complexité va des modèles de culture en 2 dimensions (2D) (structures monocouches) qui sont soit des lignées cellulaires établies dérivées de tumeurs, soit des lignées cellulaires primaires aux approches plus récentes impliquant des modèles 3 dimensions (3D)1. Dans les modèles 2D, une distinction clé est entre les lignées cellulaires établies et primaires4. Les lignées cellulaires établies sont immortalisées; Par conséquent, la même lignée cellulaire peut être utilisée à l’échelle mondiale pendant de nombreuses années, ce qui, d’un point de vue historique, facilite la collaboration, l’accumulation de données et le développement de nombreuses stratégies de traitement. Cependant, les aberrations génétiques dans ces lignées cellulaires s’accumulent à chaque passage, compromettant ainsi leur pertinence biologique. De plus, le nombre limité de lignées cellulaires disponibles ne reflète pas l’hétérogénéité des tumeurs chez les patients 4,5. Les lignées cellulaires cancéreuses primaires sont dérivées directement d’échantillons tumoraux réséqués obtenus par biopsies, épanchements pleuraux ou résections. Par conséquent, les lignées cellulaires cancéreuses primaires sont plus pertinentes sur le plan biologique car elles préservent des éléments du microenvironnement tumoral et des caractéristiques tumorales, telles que les comportements intercellulaires (par exemple, la diaphonie entre les cellules saines et cancéreuses) et les phénotypes souches des cellules cancéreuses. Cependant, la capacité de réplication des lignées cellulaires primaires est limitée, ce qui conduit à un temps de culture étroit et limite le nombre de cellules tumorales pouvant être utilisées pour les analyses 4,5.
Les modèles utilisant des cultures 3D sont plus pertinents sur le plan biologique que les modèles de culture 2D puisque les conditions in vivo sont conservées. Ainsi, les modèles de culture 3D préservent la forme et la croissance naturelles des cellules et reproduisent des éléments de l’environnement tumoral, tels que l’hypoxie, la nécrose et l’adhésion cellulaire. Les modèles 3D les plus couramment utilisés dans la recherche sur le cancer comprennent les sphéroïdes multicellulaires, les structures à base d’échafaudages et les cultures matricielles intégrées 4,6,7.
Le présent protocole génère des modèles de culture tumorale 3D (sphéroïdes multicellulaires) à partir de cellules cancéreuses primaires et évalue leur sensibilité aux médicaments à l’aide de deux approches complémentaires : un test de viabilité cellulaire (MTT) et des examens microscopiques. Les résultats représentatifs présentés ici proviennent du cancer du sein et du côlon; Cependant, ce protocole est largement applicable à d’autres types de tumeurs solides (par exemple, le cholangiocarcinome, le cancer gastrique, le cancer du poumon et le cancer du pancréas) et est également rentable, car il peut être effectué dans son intégralité dans un laboratoire typique de recherche sur le cancer / biologie cellulaire sans compter sur un équipement spécialisé. Les sphéroïdes multicellulaires générés à l’aide de cette approche peuvent être utilisés pour évaluer les candidats médicaments potentiels, identifier des biomarqueurs potentiels ou des cibles thérapeutiques, et étudier les mécanismes de réponse et de résistance.
Ce protocole est divisé en trois sections : (1) la génération, la collecte et le comptage des sphéroïdes en vue de leur utilisation comme modèle pour tester l’efficacité des médicaments; (2) dosage MTT pour évaluer l’efficacité du médicament sur les sphéroïdes; et (3) l’évaluation microscopique des changements morphologiques à la suite du traitement des sphéroïdes avec des médicaments comme autre approche pour évaluer l’efficacité des médicaments (Figure 1).

<table><tbody><tr><td>5 Fluorouracile</td><td>TEVA Israël</td><td>lot 16c22NA</td><td>Fluorouracile, Adrucil</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase Dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Cisplatine</td><td>TEVA Israël</td><td>20B06LA</td><td>Abiplatin,&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cultrex&nbsp ;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02</td><td>Matrice de membrane basale, type 3</td></tr><tr><td>DMSO (diméthylsulfoxyde)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>Fluromètre&nbsp ; Lecteur ELISA</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td>pour la solution d’arrêt</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis</td><td>. Version 1.52a</td><td>Logiciel open source ImageJ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>pour solution d’arrêt</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>1843977</td><td></td></tr><tr><td>MTT&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td>3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromure</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Palbociclib&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Sans pénicilline de calcium et de magnésium</td></tr><tr><td>&ndash ; streptomycine&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>Sans Phénol RPMI 1640</td><td>Industries biologiques, Israël</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de pipetage</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 milieu de culture&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Sunitinib</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab</td><td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Bâle, Switherland</td><td>10172154 IL</td><td>Herceptin</td></tr><tr><td>Trypan blue 0,5 % solution</td><td>Biological industries, Israël</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Fixation ultra-basse 96 plaque de puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td>Ebewe</td><td>11733027-03</td><td>Navelbine</td></tr></tbody></table>

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Malgré des progrès remarquables dans la compréhension de la biologie tumorale, la grande majorité des candidats médicaments oncologiques entrant dans les essais cliniques échouent, souvent en raison d’un manque d’efficacité clinique. Ce taux d’échec élevé met en lumière l’incapacité des modèles précliniques actuels à prédire l’efficacité clinique, principalement en raison de leur incapacité à refléter l’hétérogénéité tumorale et le microenvironnement tumoral. Ces limitations peuvent être résolues avec des modèles de culture (sphéroïdes) en 3 dimensions (3D) établis à partir d’échantillons de tumeurs humaines provenant de patients individuels. Ces cultures 3D représentent mieux la biologie du monde réel que les lignées cellulaires établies qui ne reflètent pas l’hétérogénéité tumorale. De plus, les cultures 3D sont meilleures que les modèles de culture en 2 dimensions (2D) (structures monocouches) car elles reproduisent des éléments de l’environnement tumoral, tels que l’hypoxie, la nécrose et l’adhésion cellulaire, et préservent la forme et la croissance naturelles des cellules. Dans la présente étude, une méthode a été développée pour préparer des cultures primaires de cellules cancéreuses provenant de patients individuels qui sont 3D et se développent dans des sphéroïdes multicellulaires. Les cellules peuvent être dérivées directement de tumeurs de patients ou de xénogreffes dérivées de patients. La méthode est largement applicable aux tumeurs solides (par exemple, le côlon, le sein et le poumon) et est également rentable, car elle peut être réalisée dans son intégralité dans un laboratoire typique de recherche sur le cancer / biologie cellulaire sans compter sur un équipement spécialisé. Ici, un protocole est présenté pour générer des modèles de culture tumorale 3D (sphéroïdes multicellulaires) à partir de cellules cancéreuses primaires et évaluer leur sensibilité aux médicaments en utilisant deux approches complémentaires: un test de viabilité cellulaire (MTT) et des examens microscopiques. Ces sphéroïdes multicellulaires peuvent être utilisés pour évaluer des candidats médicaments potentiels, identifier des biomarqueurs potentiels ou des cibles thérapeutiques, et étudier les mécanismes de réponse et de résistance.

Ce protocole présente des procédures pour générer une culture homogène de sphéroïdes à partir de cellules tumorales primaires, évaluer quantitativement l’efficacité du médicament sur culture sphéroïde (test MTT) et déterminer l’effet des médicaments à l’étude sur la morphologie sphéroïde. Les données des expériences représentatives sur les sphéroïdes générés à partir de cultures de cellules cancéreuses du côlon et du sein sont présentées. Des expériences similaires ont été réalisées en utilisant d’autres types de tumeurs...

Le présent protocole décrit la génération de modèles de culture tumorale 3D à partir de cellules cancéreuses primaires et l’évaluation de leur sensibilité aux médicaments à l’aide de tests de viabilité cellulaire et d’examens microscopiques.

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Notre protocole est important car il décrit une génération de modèles de culture tumorale 3D à partir de cellules cancéreuses primaires, et ce modèle représente mieux la biologie tumorale du monde réel que les lignées cellulaires. Cette approche est applicable à une variété de tumeurs solides. Il est également rentable car il peut être effectué du début à la fin dans un laboratoire de biologie cellulaire typique.Les modèles tumoraux 3D générés à l’aide de cette approche soutiennent la recherche sur la sensibilité et la résistance des tumeurs aux thérapies anticancéreuses ou à une combinaison de thérapies. Cette approche génère des modèles 3D à partir de cellules cancéreuses primaires. Par conséquent, il pourrait identifier quelle thérapie est susceptible d’être efficace pour un certain patient et ainsi aider à personnaliser son traitement.La démonstration de la procédure sera Ella Itzhaki, une doctorante de mon laboratoire. Pour commencer, prenez une petite fiole T25 avec une culture cellulaire primaire adhérente à une seule cellule et retirez le milieu de culture cellulaire. Lavez les cellules avec du PBS et ajoutez un millilitre de 1x Accutase pendant trois minutes à 37 degrés Celsius pour préparer une suspension unicellulaire de cultures de cellules tumorales primaires adhérentes de 75 à 100% de confluence.Neutraliser la solution d’Accutase en ajoutant cinq millilitres de milieu de culture cellulaire. Aspirez les cellules avec une pipette sérologique de 10 millilitres et déposez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 800g pendant cinq minutes à température ambiante.Retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez huit millilitres de milieu de culture cellulaire frais sur le dessus de la pastille cellulaire, puis mélangez doucement. Pour compter les cellules viables avec un hémocytomètre, prenez une partie aliquote de 50 microlitres de la suspension cellulaire et mélangez-la avec 50 microlitres de bleu de trypan. Ensuite, comptez les cellules vivantes et calculez le nombre total de cellules vivantes dans la suspension.Ensuite, préparez le milieu de culture 3D. Et après avoir calculé le nombre de cellules nécessaires pour le test et le volume total requis, préparez la suspension cellulaire avec le nombre souhaité de cellules dans 200 microlitres du milieu de culture 3D. Mélanger délicatement avec la pipette pour assurer une distribution homogène.Transférez la suspension dans un réservoir de pipetage et ajoutez 200 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 96 puits à fixation ultra-basse avec une pipette multicanal. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 10 minutes à température ambiante pour renforcer le regroupement des cellules, améliorant ainsi l’agrégation cellulaire, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Après centrifugation à nouveau à 300g pendant 10 minutes à température ambiante, retirer délicatement et éliminer 50% du milieu, et ajouter 100 microlitres de milieu de culture 3D frais pour remplacer la solution existante.Répétez cette étape et replacez la plaque dans l’incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Inspectez les cellules au microscope tous les un à deux jours pour surveiller la formation de sphéroïdes. Mesurez le diamètre des sphéroïdes formés à l’aide de l’outil de mise à l’échelle du logiciel d’imagerie.Et une fois que le diamètre du sphéroïde atteint 100 à 200 micromètres, effectuez les expériences d’efficacité du médicament. Pour la collecte des sphéroïdes, utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour recueillir les sphéroïdes de chaque puits et déposez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube conique à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirer et jeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.Ajouter 0,5 millilitre du milieu de culture cellulaire et remettre en suspension la pastille bien mais doucement. Pour effectuer le comptage des sphéroïdes, utilisez une plaque de 96 puits et dessinez un signe plus sur la face inférieure d’un puits pour diviser le puits en quadrants. Ajouter 50 microlitres de la suspension au puits.Et avec une lentille d’objectif 10x, comptez les sphéroïdes manuellement au microscope. Comptez les sphéroïdes dans chaque quadrant et calculez le nombre total de sphéroïdes dans le puits. Ensuite, calculez la concentration de sphéroïdes en doublant le nombre de sphéroïdes en comptant le volume, et calculez le nombre total de sphéroïdes dans la suspension.Dans un nouveau tube, préparer la suspension sphéroïde à une concentration de 200 sphéroïdes par 200 microlitres de milieu de culture cellulaire. Pour chaque traitement médicamenteux, préparez le stock de sphéroïdes dans un tube différent. Calculez la quantité totale nécessaire pour chaque médicament par le nombre de puits nécessaires pour les répétitions, et ajoutez le médicament dans le tube à la concentration finale nécessaire.Transférez 200 microlitres de la suspension sphéroïde dans les puits d’une plaque de 96 puits à très faible attachement et incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Après avoir incubé les sphéroïdes avec le médicament à l’étude pendant 24 à 72 heures, centrifuger la plaque à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante et retirer délicatement 170 microlitres du milieu de culture cellulaire, en laissant 30 microlitres au fond du puits. Préparez la solution MTT et ajoutez 70 microlitres de la solution à chaque puits pour obtenir un volume final de 100 microlitres par puits.La concentration finale de MTT dans le puits sera de 0,05 milligramme par 100 microlitres. En outre, préparez des puits blancs avec une solution MTT sans cellules. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone pendant trois à quatre heures jusqu’à ce qu’un changement de couleur de la solution dans les puits soit observé.Lorsqu’un changement est observé, ajoutez 100 microlitres de solution Stop à chaque puits et mélangez délicatement le contenu des puits sans créer de bulles. Lire l’absorbance de la plaque dans un lecteur ELISA à paramètre à une longueur d’onde de 570 nanomètres et une longueur d’onde de fond de 630 à 690 nanomètres. Pour calculer la viabilité de la cellule, calculez le signal spécifique pour chaque puits.Calculez ensuite la valeur moyenne des puits blancs et soustrayez cette valeur de chaque puits. Calculer la moyenne des signaux spécifiques dans les puits témoins qui contiennent des cellules qui n’ont pas été traitées avec le médicament à l’étude. Enfin, calculez la viabilité des cellules de chaque puits par rapport aux puits contenant des cellules non traitées.La formation de sphéroïdes à partir d’une culture de cellules cancéreuses du côlon primaire au fil du temps par le nombre de cellules initialement ensemencées est montrée ici. À partir de cette figure, on peut voir que le nombre de sphéroïdes générés dépend du nombre de cellules initialement ensemencées dans chaque puits. Les sphéroïdes des cellules cancéreuses primaires du côlon après 10 jours en culture avec un ensemencement cellulaire initial de 2 000 par puits sont présentés ici.Après une culture prolongée des sphéroïdes du cancer du côlon, ils ont commencé à s’attacher les uns aux autres et ont formé des grappes de sphéroïdes et de structures ressemblant à des raisins qui ont empêché une culture homogène et ont donc interdit l’utilisation des sphéroïdes dans les tests MTT. Les effets du palbociclib, du sunitinib et de leur combinaison sur les sphéroïdes des cellules tumorales primaires, y compris le cancer du côlon et du sein, sont présentés ici. Un test MTT a été effectué sur des sphéroïdes dérivés de cellules cancéreuses du côlon et du sein.Les signaux MTT ont été normalisés aux valeurs des cellules traitées par DMSO. Les valeurs représentent les moyennes de quatre à huit répétitions. Les effets des différents traitements sur la croissance cellulaire ont également été évalués au microscope au jour zéro et après trois jours de traitement des sphéroïdes dérivés du cancer du côlon et des cellules cancéreuses du sein.Les effets du trastuzumab plus vinorelbine et du 5 fluorouracile plus cisplatine sur les sphéroïdes dérivés du cancer du sein au fil du temps sont présentés dans cette figure. La variation du diamètre des sphéroïdes par rapport au jour zéro par la durée du traitement est illustrée ici. Chaque groupe de traitement comprenait quatre à six puits avec un sphéroïde dans chaque puits.La variation moyenne est présentée ici. Les sphéroïdes sont des outils importants pour de nombreuses études au-delà de la réponse au traitement anticancéreux. Ces études abordent, par exemple, l’administration de médicaments et même des questions de biologie fondamentale telles que les interactions cellule-cellule.Il est essentiel de démarrer un processus de génération de sphéroïdes avec une suspension unicellulaire. Il est également essentiel d’utiliser des plaques de fixation ultra-basses avec un support contenant une métrique de membrane de base de 5%.

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Dans un grand éventail d’indications de la maladie, les modèles plus physiologiquement pertinents soient développés et mis en œuvre dans les programmes de recherche. Le nouveau système de modèle décrit ici montre comment tridimensionnelle tumeur sphéroïdes peuvent être cultivées et diffusés dans un système d’axée sur la plaque du haut débit 1536 puits pour chercher de nouveaux médicaments anticancéreux.

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Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments (Vidéo) | JoVE Journal

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

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