Name: Un protocole optimisé pour le radiomarquage efficace de nanoparticules dor à laide dun 125 I-étiqueté Azide prothétique Groupe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Découvrez une méthode rapide de radiomarquage de nanoparticules d'or à l'iode-125 par réaction click sans cuivre. Cette technique offre un rendement radiochimique élevé pour les sondes d'imagerie.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale de recherche de Corée, financées par le gouvernement de la République de Corée, (subventions n° 2012M2B2B1055245 et 2012M2A2A6011335) et par le Centre de biomique RI de l’Institut coréen de recherche sur l’énergie atomique.

Attention: La forme oxydée de l&#39;iode radioactif est très volatile et doit être manipulé avec des boucliers de plomb adéquates et des flacons de plomb. Toutes les étapes radiochimique doivent être effectuées dans une hotte de charbon filtré bien ventilé, et les procédures expérimentales doivent être surveillés par des dispositifs de détection de la radioactivité. 1. Préparation des produits chimiques et la cartouche de phase inverse pour la synthèse de la I-125 d&#39; azoture marquée <ol><li> Préparation des réactifs en solution <ol><li> Dissoudre 1 mg de l&#39;azoture précurseur (2) dans 150 ul d&#39;éthanol absolu (figure 1). NOTE: Une procédure de synthèse détaillée pour le précurseur de l&#39; azoture (2) a été signalé dans le précédent article 22. </li><li> Dissoudre la chloramine T 1 mg dans 20 ul de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (pH = 7,4). </li><li> Dissoudre le métabisulfite de sodium à 2 mg dans 20 ul de H 2 O. </li></ol></li><li> Preparation de la cartouche <ol><li> Laver la cartouche TC18 avec 10 ml d&#39; éthanol absolu , puis 10 ml H 2 O. Ne pas sécher la matrice de la cartouche avec de l&#39;air. </li></ol></li></ol> 2. radiosynthèse de l&#39;azoture groupe prosthétique marqué au 125I <ol><li> Réaction iode radioactif du précurseur <ol><li> Ajouter la solution de précurseur de l&#39;azoture (1 mg dans 150 ul d&#39;éthanol absolu) et de l&#39;acide acétique (10 ul) dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 150 MBq de [125 I] NaI dans du NaOH 0,1 M (50 ul) au mélange réactionnel. </li><li> Ajouter une solution de chloramine T (1 mg dans 20 ul de 1 x solution saline tamponnée au phosphate) et fermer le mélange réactionnel microtube contenant. </li><li> Incuber le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 15 min jusqu&#39;à ce que la réaction de radio-iodation est terminée. </li><li> Ajouter une solution de métabisulfite de sodium (2 mg dans 20 ul de H 2 O) au mélange réactionnelpour arrêter la réaction de radio-iodation. </li><li> Retirer 0,2 ul du produit brut, puis diluer avec 100 ul d&#39; une solution (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) pour analyse par HPLC. Remarque: Pour toutes les expériences de HPLC, l&#39; utilisation de l&#39; acide formique à 0,1% contenant H 2 O (solvant A) et de l&#39; acide formique contenant de l&#39; acétonitrile à 0,1% (solvant B) comme éluants. </li><li> Analyser le produit brut dilué en utilisant une phase inverse analytique radio HPLC (phase inverse C18 colonne; débit: 1 ml / min; gradient d&#39;éluant: 20% de solvant B pour 0-2 min, 20-80% de solvant B pour 2-22 min, de 80 à 100% de solvant B pendant 22-23 min et 100% de solvant B pendant 23-28 min; temps de rétention: 16,4 min) (figure 2). </li></ol></li><li> Une purification du produit brut par une HPLC préparative REMARQUE: Fournir suffisamment de plomb blindage autour des parties de CLHP telles que l&#39;injecteur, la colonne, le détecteur, les flacons de collecte, et le récipient dans lequel l&#39;effluent est recueilli. <ol><li> Retirer ee totalité du mélange réactionnel dans un flacon de HPLC. Rincer le tube réactionnel avec de l&#39;acétonitrile (0,5 ml) et ajouter le liquide de rinçage dans le même flacon d&#39;injection. Diluer la solution recueillie avec H 2 O (1 ml). </li><li> Injecter le produit brut sur une préparative radio HPLC (phase inverse C18 colonne; débit: 10 ml / min; gradient d&#39;éluant: 20% de solvant B pour 0-2 min, 20-80% de solvant B pour 2-22 min, 80 à 100% de solvant B pendant 22-23 min et 100% de solvant B pendant 23-28 min). </li><li> Recueillir le pic radioactif représentant l&#39;azoture 125 I-marqué (1) (tR dans ces conditions d&#39;HPLC est de 17,8 à 18,8 min) dans un tube à essai en verre (figure 2). </li><li> Mesurer le rendement radiochimique de la fraction en utilisant un calibrateur de dose de radioactivité selon le protocole du fabricant. </li><li> Injecter le produit purifié sur une radio-HPLC analytique en utilisant les mêmes conditions de HPLC pour la détermination de la pureté radiochimique du produit. </li></ol></li><li> L&#39; extraction en phase solide du produit <ol><li> Diluer la fraction contenant le produit souhaité (1) avec 40 ml pur H 2 O. </li><li> Ajouter la solution diluée dans une cartouche TC18 préconditionnés. </li><li> Laver la cartouche avec un supplément de 15 ml H 2 O. </li><li> Éluer le produit (1) enfermé dans la cartouche avec 2 ml d&#39; acétone dans un flacon en verre de 10 ml qui est protégé par un bouclier de plomb. Mesurer la radioactivité du produit a été élue en utilisant un calibrateur de dose de radioactivité selon le protocole du fabricant. REMARQUE: Diméthylsulfoxyde (DMSO) ou de l&#39;éthanol absolu peut également être utilisé pour l&#39;élution du produit à partir de la cartouche. Environ 5 à 10% de la radioactivité colle normalement à la cartouche, et le produit restant radiomarqué ne peut pas être complètement élue en utilisant des quantités excessives de solvant organique. </li><li> Evaporer l&#39;acétone avec un courant d&#39;azote ou d&#39;argon gazeux. </li><li> Dissoudre le reSidiou avec du DMSO (100-200 ul) pour l&#39;étape suivante de radiomarquage. </li></ol></li></ol> 3. Synthèse de DBCO-groupe conjugué nanoparticules d&#39;or <ol><li> La modification de surface de l&#39; or 13 nm , la taille des nanoparticules avec DBCO contenant des groupes polyéthylène - glycol <ol><li> Nanoparticules d&#39; or Préparer sodium-citrate-stabilisé (3) (taille moyenne = 13 nm) selon un précédent rapport 24. </li><li> Ajouter une solution aqueuse de Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) à des nanoparticules d&#39;or stabilisées au citrate (10 nM, 15 ml). Agiter la solution pendant 20 min sur un agitateur orbital. </li><li> Ajouter une solution aqueuse d&#39;DBCO contenant un groupe thiol, un polyéthylène glycol (masse moléculaire moyenne = 5000, 100 uM, 1,5 ml). Agiter la solution pendant 2 heures sur un agitateur orbital. </li></ol></li><li> La purification des nanoparticules d&#39;or-DBCO modifié par le groupe <ol><li> Purifier les nanoparticules d&#39;or DBCO-groupe modifié (4) &lt;/ Strong&gt; par centrifugation successives (11.400 xg, 15 min x 3). </li><li> Décanter le surnageant et ajouter de l&#39;eau pure pour la remise en suspension des pastilles de nanoparticules d&#39;or. </li></ol></li></ol> 4. radiomarquage de DBCO-groupe modifié nanoparticules d&#39;or via la libre Copper-Click Réaction <ol><li> Synthèse de nanoparticules d&#39;or 125 I-marqué en utilisant l&#39;azoture 125 I-marqué (1) <ol><li> Préparer une solution concentrée de nanoparticules d&#39;or DBCO groupes modifiés à l&#39;aide d&#39;une centrifugation (11 400 x g, 15 min), et ajuster la concentration des nanoparticules d&#39;or de 2 pm. </li><li> Ajouter 4,1 MBq de la 125 I-marqué azoture (1) dans du DMSO (5 ul) à une suspension de nanoparticules d&#39;or (4) (2 uM, 50 ul). </li><li> Incuber le mélange réactionnel résultant à 40 ° C pendant 60 min. </li><li> Retirer une aliquote (0,2 ul) à partir du produit brut et l&#39;appliquer sur une silice-cochromatographie sur couche mince ATED (CCM) plaque. </li><li> Développer la plaque CCM à l&#39;aide d&#39;acétate d&#39;éthyle comme phase mobile. </li><li> Placer la plaque CCM sur un scanner de radio-CCM et exécuter le scanneur pour surveiller la réaction de radiomarquage (figure 3) selon le protocole du fabricant. </li></ol></li><li> Une purification du produit brut <ol><li> On purifie le mélange réactionnel contenant les nanoparticules de 125 I-marqué en or (4) par centrifugation (11 400 xg, 15 min). </li><li> Décanter le surnageant et ajouter de l&#39;eau pure pour la remise en suspension des pastilles de nanoparticules d&#39;or. </li><li> Retirer une aliquote (0,2 pi) à partir du produit purifié et l&#39;appliquer sur une plaque de CCM revêtue de silice. </li><li> Développer la plaque CCM à l&#39;aide d&#39;acétate d&#39;éthyle comme phase mobile. </li><li> Placer la plaque CCM sur un scanner radio TLC et exécuter le scanner pour déterminer le rendement radiochimique et la pureté radiochimique de la 125 I-marqué gold nanoparticules (4) (figure 3) selon le protocole du fabricant. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En général, le rendement radiochimique observée de la 125 I-marqué azoture purifié (1) était de 75 ± 10% (n = 8). Le marquage radioactif a été réalisé avec 50-150 MBq de radioactivité, et les résultats sont tout à fait conformes radiochimique. Si [125I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) que subit la désintégration radioactive pendant plus d&#39;un mois a été utilisé dans la réaction de radio - iodation, le rendement radiochimique de 1 a été observée pour êtr...

La réaction de clic sans cuivre entre les azides et les cyclooctynes a été largement appliquée au marquage bioorthogonal efficace d’un large éventail de biomolécules, de nanomatériaux et de sujets vivants1-7. En raison de l’excellente spécificité du site et de la vitesse de réaction rapide de cette réaction de conjugaison, elle a également été utilisée pour synthétiser des traceurs radiomarqués. Quelques groupes prothétiques azoïdés ou DBCO marqués 18F ont été préparés pour le marquage in vitro de divers cancers ciblant les peptides et les anticorps, ainsi que pour l’imagerie pré-ciblée in vivo des tumeurs8-13. En plus de ces exemples, la même réaction de conjugaison a été appliquée au marquage métal-radio-isotopique de nanomatériaux pour les études d’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP)14-16.
Depuis plusieurs décennies, l’iode radioactif est utilisé pour la recherche biomédicale et les essais cliniques par imagerie TEP (124I), par tomographie par émission de photons uniques (SPECT) (123I, 125I) et pour le traitement du cancer de la thyroïde (131I)17-21. Par conséquent, une méthode efficace de marquage à l’iode radioactif est d’une importance fondamentale pour diverses études, y compris les études d’imagerie moléculaire, l’analyse de la distribution des biomolécules dans les organes, l’identification de biomarqueurs et le développement de médicaments. Une stratégie de réaction par clic sans cuivre pourrait être utilisée dans le marquage à l’iode radioactif. Cependant, cette application n’a pas été étudiée de manière aussi approfondie que les biomolécules22-23 marquées au F 18. Ici, nous fournirons un protocole étape par étape pour la synthèse d’un azide marqué en 125I pour le radiomarquage de molécules dérivées du groupe DBCO. Les procédures décrites dans le présent rapport comprendront la radioiodation du précurseur stannylé, les étapes de purification par HPLC et l’extraction en phase solide. Nous démontrons également l’efficacité du radiomarquage de nanoparticules d’or de 13 nm modifiées par le groupe DBCO à l’aide de l’azoture 125marqué à l’I. Le protocole détaillé de ce rapport aidera les chimistes de synthèse à comprendre une nouvelle méthodologie de radiomarquage pour la synthèse de produits radiomarqués.

<table><tbody><tr><td>Chloramine T trihydratée</td><td>Sigma</td><td>402869</td><td></td></tr><tr><td>[125I]NaI in aq. NaOH</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEZ033A010MC</td><td></td></tr><tr><td>Sodium metabisulfite&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S9000</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma</td><td>251364</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 plus cartouche</td><td>Eaux</td><td>WAT036800</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’or(III) trihydraté</td><td>Sigma</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DBCO PEG SH (MW 5,000)</td><td>NANOCS</td><td>PG2-DBTH-5k</td><td></td></tr><tr><td>TLC gel de silice 60 F254</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical HPLC</td><td>Agilent</td><td>1290 Infinity</td><td>Numéro de modèle</td></tr><tr><td>HPLC préparatif</td><td>Agilent</td><td>1260 Infinity</td><td>Numéro de modèle</td></tr><tr><td>Analytique C18 colonne de phase inverse</td><td>Agilent</td><td>Zorbax Eclipse XDB-C18</td><td></td></tr><tr><td>Preparative C18 colonne à phase inverse</td><td>Agilent</td><td>PrepHT XDB-C18</td><td></td></tr><tr><td>Radio TLC scanner</td><td>Bioscan</td><td>AR-2000</td><td>Numéro de modèle</td></tr><tr><td>Calibrateur de dose de radio-isotope</td><td>Capintec, Inc</td><td>CRC -25R</td><td>Numéro de modèle</td></tr></tbody></table>

un protocole optimisé pour le radiomarquage efficace de nanoparticules d&#39;or à l&#39;aide d&#39;un<sup&gt; 125</sup&gt; i-étiqueté azide prothétique groupe

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Ici, nous démontrons un protocole détaillé pour la radiosynthèse d’un groupe prothétique azoté marqué à 125I et son application au radiomarquage efficace de nanoparticules d’or fonctionnalisées par le groupe DBCO à l’aide d’une réaction de clic sans cuivre. La radioiodination du précurseur stannylé (2) a été réalisée en utilisant du [125I]NaI et de la chloramine T comme oxydant à température ambiante pendant 15 min. Après purification par HPLC du produit brut, l’azoture purifié 125marqué à l’I (1) a été obtenu avec un rendement radiochimique élevé (75 ± 10 %, n = 8) et une excellente pureté radiochimique (>99 %). Pour la synthèse de nanoparticules d’or radiomarquées de 13 nm, les nanoparticules d’or fonctionnalisées par DBCO (3) ont été préparées à l’aide d’un polymère de polyéthylène glycol thiolé. Une réaction de clic sans cuivre entre 1 et 3 a donné aux 125nanoparticules d’or marquées à l’I (4) plus de 95 % du rendement radiochimique déterminé par chromatographie sur couche mince (radio-TLC). Ces résultats indiquent clairement que la méthode actuelle de radiomarquage utilisant une réaction de clic sans cuivre promue par une souche sera utile pour le radiomarquage efficace et pratique des nanomatériaux contenant du groupe DBCO.

La réaction de radio - iodation du précurseur stannylé (2) a été réalisée à l&#39; aide de 150 MBq de [125 I] NaI, l&#39; acide acétique et de chloramine T à la température ambiante pendant 15 minutes pour obtenir le produit radio - marqué (1). Après purification par HPLC preparative du mélange brut, le produit désiré a été obtenu avec 75 ± 10% (n = 8) de rendement radiochimique. Une HPLC analytique a révélé que la pureté radiochimique du prod...

Une procédure détaillée pour la synthèse d&#39;un azoture 125 I-marqué et le radiomarquage de dibenzocyclooctyne nanoparticules d&#39;or (DBCO) -groupe conjugués, 13 nm de taille à l&#39; aide d&#39; un clic réaction sans cuivre est décrite.

Un protocole optimisé pour le radiomarquage efficace de nanoparticules d&#39;or à l&#39;aide d&#39;un<sup&gt; 125</sup&gt; I-étiqueté Azide prothétique Groupe

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

L'objectif général de ce protocole est de fournir une méthode de synthèse rapide et efficace de nanoparticules d'or marquées par de l'iode radioactif en utilisant une réaction d'« click » sans cuivre favorisée par la contrainte. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions clés dans le domaine de la radiochimie, telles que la synthèse de radio-isotopes marqués depuis environ trois ans, ainsi que la production de sondes d'imagerie régulières pour des études d'imagerie par PAD ou SPEC. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de synthétiser efficacement de une à cinq particules d'or marquées à l'iode, en utilisant un groupe prosthétique azoture, avec un rendement radiochimique et une pureté radiochimique excellents.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'évaluation radioactive sont difficiles à apprendre. Ces procédures nécessitant un équipement adapté et une expérience en marquage radioactif, l'étudiante en radioactivité Ha Eun Shim démontrera la procédure dans le cadre de cette étude.Pour réaliser la réaction de radioiodation, ajoutez une solution précurseur dans un tube de 1,5 mL. Ajoutez 10 microlitres d'acide acétique à la solution précurseur à température ambiante. Puis ajoutez 150 mégabecquerels d'iode 125 dans 50 microlitres de soude 0,1 molaire au mélange réactionnel.Ajouter une solution de chloramine T et fermer le tube de microcentrifugation contenant une mélange réactionnel. Incuber le mélange réactionnel à température ambiante pendant quinze minutes jusqu'à ce que la réaction de radio-iodation soit terminée. Ensuite, ajouter une solution de métabisulfite de sodium au mélange réactionnel pour arrêter la réaction de radio-iodation.Prélvez 0,2 microlitre du produit brut, puis diluez-le avec 100 microlitres d'acétonitrile à 50 % dans l'eau pour une analyse par chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC. Analysez le produit brut dilué en utilisant une HPLC analytique radio à phase inverse. Transférez tout le mélange réactionnel dans un flacon d'HPLC.Rincer le tube à réaction avec 0,5 mL d'acétonitrile et ajouter le rinçage dans le même flacon d'injection. Diluer la solution recueillie avec 1 mL d'eau. Pour purifier le produit brut par HPLC préparative, injecter le produit brut sur une HPLC préparative radio. Recueillir le pic radioactif représentant l'azide marqué à l'iode 125 dans un tube à essai en verre. Mesurer le rendement radiochimique de la fraction à l'aide d'un calibrateur de dose d'activité radioactive conformément au protocole du fabricant. Ensuite, injecter le produit purifié sur une HPLC analytique radio à l'aide des mêmes conditions de CPG que celles utilisées pour déterminer la pureté radiochimique du produit.Pour effectuer l'extraction en phase solide du produit, diluez la fraction contenant le produit désiré avec 40 mL d'eau pure. Ajoutez la solution diluée dans une cartouche TC18 préconditionnée. Lavez la cartouche avec un supplément de 15 mL d'eau.Éluez le produit piégé dans la cartouche avec 2 mL d'acétone dans un flacon en verre de 10 mL protégé par un écran au plomb. Mesurez la radioactivité du produit éluté à l'aide d'un calibrateur de dose de radioactivité selon le protocole du fabricant. Après évaporation de l'acétone, dissolvez le résidu dans 100 à 200 microlitres de DMSO pour l'étape suivante de radiomarquage.Réaliser la synthèse des nanoparticules d'or modifiées par un groupe DBCO, comme décrit dans le protocole en texte. Préparer une solution concentrée de nanoparticules d'or modifiées par un groupe DBCO en utilisant la centrifugation. Ajuster ensuite la concentration des nanoparticules d'or à deux micromolaires.Ajouter 4,1&nbsp;méga&nbsp;bécquerel d'azide marqué à l'iode&nbsp;125 dans 5&nbsp;microlitres de DMSO à une suspension de 50&nbsp;microlitres de nanoparticules d'or à 2&nbsp;micromolaire. Incuber le mélange réactionnel obtenu à 40&nbsp;degrés&nbsp;Celsius pendant 60&nbsp;minutes. Prélever un aliquot de 0,2&nbsp;microlitre du produit brut et l'appliquer sur une plaque de chromatographie sur couche mince ou CCM silicée.Développer la plaque de CCM en utilisant l'acétate d'éthyle comme phase mobile. Placer la plaque de CCM sur un scanner radio-CCM et exécuter le balayage pour surveiller la réaction de marquage radioactif conformément au protocole du fabricant. Purifier le mélange réactionnel contenant les nanoparticules d'or marquées à l'iode 125 par centrifugation.Décanter le surnageant et ajouter de l'eau pure pour resuspendre les pastilles de nanoparticules d'or. Prélever un aliquot de 0,2 microlitre du produit purifié et l'appliquer sur une plaque de CCM recouverte de silice. Développer la plaque de CCM en utilisant l'acétate d'éthyle comme phase mobile.Placer la plaque de CCM sur un scanner radio-CCM et exécuter le balayage pour déterminer le rendement radiochimique et la pureté radiochimique des nanoparticules d'or marquées à l'iode 125, conformément au protocole du fabricant. Des résultats représentatifs du groupe prosthétique azoté marqué à l'iode 125 sont présentés ici. Un rendement radiochimique de 75 % a été déterminé à l'aide d'un calibrateur de dose d'activité radioactive.Le résultat analytique de la radio-HPLC montre une excellente pureté radiochimique du produit. Des résultats représentatifs des nanoparticules d'or marquées à l'iode 125 sont présentés ici. L'analyse radio-TLC indique que le rendement radiochimique et la pureté des nanoparticules d'or purifiées étaient tous deux supérieurs à 95 %. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement.Les implications de cette technique s'étendent à la préparation de divers sondes moléculaires à des fins thérapeutiques d'imagerie nucléaire, car la chimie de marquage dans la méthode actuelle est très efficace et simple. N'oubliez pas que le travail avec de l'iode radioactif peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des blocs de protection ou des chaussures de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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