Name: Développement et identification dune sous-population Novel of Human neutrophiles dérivé phagocytes géant In vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez comment générer et identifier des phagocytes géants dérivés de neutrophiles humains in vitro. Cette méthode permet d'étudier leur rôle dans les réponses immunitaires inflammatoires et anti-inflammatoires.

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Les auteurs remercient le Dr Edith Suss-Toby pour son aide précieuse avec les études de microscopie confocale. Cette étude a été soutenue par le ministère de l&#39;Immigration Absorption et le Comité de la planification et du budget du Conseil de l&#39;enseignement supérieur dans le cadre du programme kamea (LD et AP). Nous remercions également le soutien du chercheur de la Fondation Lady Davis Post-Doctoral Research Fellowship (OR).

Le protocole a été approuvé par le Comité des droits de l'homme locale conformément à la déclaration d'Helsinki, et tous les participants ont signé un formulaire de consentement éclairé. 1. neutrophiles isolement et le développement de Gφ dans Culture NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées en utilisant lipopolysaccharide de qualité de tissu stérile (LPS) des solutions sans gluten dans une hotte à flux laminaire Bio-sécurité. Ne pas ajouter des antibiotiques, des cytokines ou des facteurs de croissance au mémorial du parc Institut Roswell (RPMI) -1640 moyen. <ol><li> Obtenir au moins 40 ml de sang veineux de jeunes adultes en bonne santé en utilisant un ensemble du cuir chevelu veine stérile. Prélever le sang dans des tubes vacutainer contenant de l' acide acétique éthylènediamine tétra K 3 sel (K 3 EDTA) et mélanger doucement. Gardez le sang à la température ambiante. </li><li> Isoler les neutrophiles par deux étapes gradient de densité discontinu utilisant polysucrose à 1.119 et 1.077 g / ml. Apportez des solutions à la température ambiante avant de l'utiliser. NOTE: Lors de la centrifugation, le sang rougecellules (hématies) sont agrégées par le polysucrose et les sédiments rapidement. Les cellules mononucléaires (monocytes / lymphocytes) se trouvent entre le plasma supérieur / -1077 Polysucrose interface, tandis que les neutrophiles se trouvent juste au- dessus des globules rouges, à la polysaccharose -1077 / 1119 interface (voir la figure 2). Cette méthode permet la séparation simultanée de cellules mononucléaires et polynucléaires neutrophiles à partir du même individu. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig2.jpg"> Figure 2: Isolement des neutrophiles de sang total humain. Polysucrose à 1,077 g / ml est soigneusement posés sur le dessus de polysucrose-1.119 g / ml pour former un gradient discontinu. Le sang entier dilué est ensuite déposé en couche sur le dessus de la polysaccharose-1,077. Les tubes sont immédiatement soumis à une centrifugation à 700 g pendant 30 min, à température ambiante, sans frein. Trois bandes distinctes sont indiquées. (A) Des cellules mononucléaires, (B) des cellules polymorphonucléaires (PMN),et (C) des globules rouges (RBC) au fond du tube. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig2large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ajouter 12 ml polysaccharose-1119 au fond d'un tube à centrifuger stérile de polypropylène conique de 50 ml. </li><li> couche avec précaution 12 ml de polysucrose-1077 sur le polysucrose -1119. </li><li> Diluer 10 - 12 ml de sang entier à un volume final de 24 ml de sang avec des ions libres du tampon phosphate salin (PBS) contenant du sérum de veau inactivé par fœtal 2% de la chaleur (HI-FCS). couche soigneusement 24 ml du sang total dilué sur la pente supérieure du tube. </li><li> Centrifuger à 700 g pendant 30 min à température ambiante (20-24 ° C) sans frein. NOTE: Centrifugation à basse température peut entraîner une agglutination cellulaire et une mauvaise récupération. </li><li> Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse without perturber le gradient. Deux couches opaques doivent être observées (A: cellules mononucléaires et B: PMN, représentées sur la figure 2). </li><li> Aspirer et jeter le liquide jusqu'à 0,5 cm au-dessus couche A. Transfert (ou défausse) les cellules de cette couche à un tube marqué "mononucléaires". </li><li> Aspirer et jeter le reste fluide jusqu'à 0,5 cm au-dessus la couche B. Transférer les cellules de cette couche à un tube étiqueté "PMN". </li><li> Piscine PMN de chacun de deux tubes à gradient et on lave avec du PBS contenant 2% de HI-FCS à un volume final de 30 ml. Centrifuger pendant 12 min à 200 xg, éliminer le surnageant et le jeter. </li><li> Pour se débarrasser de contaminer les globules rouges (RBC), ajouter 3 ml de hypotonique 0,2% glacé NaCl stérile tout en remettant en suspension le culot en tirant doucement et avec une pointe de pipette stérile 1 ml. Gardez sur la glace pendant 30 sec. </li><li> Au bout de 30 s, la restauration isotonicité par addition de 3 ml d'eau stérile à 1,6% de NaCl froid de la glace dans le tube. </li><li> Pour les 6 ml de solution saline isotonique, ajouter 6 ml d'préchauffée (37 ° C), le milieu RPMI-1640 supplémenté avec 2% de HI-FCS et centrifuger à 250 g pendant 12 min. Jeter le surnageant. Le culot de PMN doit être propre de contamination RBC. NOTE: En cas de contamination par RBC, le culot PMN apparaît rougeâtre. </li><li> Si certains RBC contamination restent, répétez les étapes 9 et 10 une fois de plus. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de RPMI-1640 additionné de 10% de HI-FCS et compter les cellules afin de déterminer leur concentration et leur viabilité par exclusion au bleu trypan. </li><li> Ajuster la concentration de 1,25 à 1,5 x 10 6 PMN / ml ( en fonction des besoins expérimentaux), et la plaque 1,0 ml / puits dans une plaque à 24 puits. NOTE: La pureté des neutrophiles dans la population de granulocytes a toujours dépassé 95%, évaluée par mai Grunewald-Giemsa et la microscopie optique. </li><li> Après l'ensemencement, mettre les cellules dans un humidifié incubateur CO 2 de 5% à 37 ° C. </li><li> Remplacer moyenne tous les 3 jours en aspirant doucement la moitié desle milieu et en ajoutant le même volume de milieu RPMI 1640 frais complété avec 10% de HI-FCS. Utiliser LPS solutions libres et les composés et les niveaux de LPS bas dans HI-FCS (0,05 ng / ml ou moins). NOTE: Un changement de milieu doux est impératif puisque le Gφ, qui se développent dans la culture ne pas attacher fermement à la boîte de culture et de lavage vigoureux peuvent aussi se laver les cellules en développement. L'apparition de Gφ est perceptible à 3 - 4 jours après la mise en culture des PMN, en fonction du donneur de sang. La plupart des analyses et des essais décrits ici sont effectuées entre 6 - 7 jours de culture, quand Gφ sont de très grande taille. Il convient de noter que l'addition de 1 - 10 ng / ml de LPS dans le milieu RPMI-1640 n'a pas affecté le développement Gφ en culture. 14 </li></ol> 2. confocale à balayage laser <ol style="margin-left: 40px;"><li> Préparer cytospines 16 à partir de neutrophiles fraîchement isolés, et à partir du jour développé 7 cultures Gφ(Préparé à l'article 1). REMARQUE: Pour augmenter la concentration de Gφ dans le plat pour diverses analyses, retirez délicatement la moitié du milieu. Assurez-vous que Gφ ne sont pas détectés dans le milieu retiré en examinant le milieu sous un microscope optique. Puis, pipeter intensément le milieu restant à éliminer légèrement adhéré Gφ. Centrifuger le milieu pendant 10 min à 200 x g et remise en suspension du culot dans 100-120 ul de milieu. <ol><li> Utiliser 100 - 120 ul de milieu contenant des cellules pour chaque diapositive. Préparer des lames double ou en triple de chaque traitement. Spin pendant 7 minutes à 84 x g. </li></ol></li><li> Sécher les cellules filées et fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde à la température ambiante pendant 10 min sous une hotte chimique. Laver 3x avec PBS (~ 100 pi pendant quelques secondes par lavage). Pour la coloration intracellulaire, perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton X-100 dans du PBS à température ambiante pendant 10 min et lavage 5 fois avec du PBS. NOTE: À toutes les étapes, utilisez tampon / volu solution appropriéemoi de couvrir le périmètre des cellules sur la lame. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour déterminer les cellules périmètre. Attention: paraformaldéhyde est toxique. Eviter le contact avec la peau et les yeux. Porter un équipement de protection individuelle approprié. </li><li> des cellules de bloc avec 10% de sérum de chèvre normal dans du milieu RPMI-1640 et on incube pendant une nuit à 4 ° C ou à la température ambiante pendant 40 min. Laver avec du PBS. </li><li> Incuber avec l'anticorps unique (Ab) ou une combinaison des souris et des anticorps primaires de lapin (ABS) à une dilution de 1: 100 (~ 100 ul). Incuber une nuit (18 - 20 h) à 4 ° C. NOTE: Ici, monoclonal de souris Abs inclus: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b, anti-CD1c, CD15 anti et anti-Cytochrome chaîne légère b-245 (identification de phox p22-). Lapin polyclonaux Abs inclus: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B, anti-myéloperoxydase, anti-élastase neutrophile (NE), et-Nox2 anti- / gp91- phox Abs. contrôles isotypiques inclus IgG1 purifié de la souris et IgG2 et IgG de lapin. Prepare les Abs selon les instructions du fabricant et utiliser un volume approprié (environ 100 pi) pour couvrir le périmètre des cellules. </li><li> Laver les cellules et incuber avec 1/400 anticorps secondaires Cy2-CF (488A) de chèvre conjugué à IgG anti-lapin (vert) et / ou Cy5 (CF 647) de chèvre conjugué à IgG anti-souris (rouge) à la température ambiante pendant 40 min. NOTE: Diluer et préparer Abs selon les instructions du fabricant. </li><li> Après le lavage, monter des diapositives avec une goutte de milieu de montage, contenant 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire, puis placez immédiatement la lamelle. </li><li> Analyser les diapositives par un système de balayage laser confocal en utilisant un microscope à fluorescence et Plan Apo 40X objectif d'huile d'immersion. Effectuer l'analyse à moins de 30 minutes à 2 heures après la préparation des diapositives ou de conserver à 4 ° C pendant la nuit. <ol><li> Calculer la surface de la cellule et l' intensité de fluorescence en utilisant un logiciel d'imagerie (par exemple , l' image J). Pour la co-localisation, quantifier par logiciel en utilisant Manders Overlap Coefficient (MOC) 17. REMARQUE: Seules les cellules avec GPM&gt; 0,6 peuvent être considérées comme des cellules ayant co-localisation significative. </li></ol></li></ol> 3. Transmigration des PMN à travers les cellules endothéliales: Effets de l'IL-8 sur Géant phagocyte (Gφ) Formation REMARQUE: L'utilisation de 24 puits culture cellulaire perméable inserts pour le dosage de la transmigration des cellules. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Enduire la chambre supérieure de l'insert avec 150 ul fibronectine à une concentration de 50 pg / ml, et de garder à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter à la chambre supérieure à 5 x 10 4 cellules endothéliales EA.hy926 / puits, remises en suspension dans 150 ul de formulation milieu de Eagle modifié par Dulbecco (milieu de croissance complet). REMARQUE: Assurez-vous que la monocouche endothéliale est confluentes avant utilisation. </li><li> À la chambre inférieure, ajouter 700 ul de milieu de croissance complet. </li><li> Placer la membrane perméableculture cellulaire insère dans des plateaux de cluster et de la culture des cellules endothéliales EA.hy926 pendant 2 jours à 37 ° C dans 5% de CO 2. NOTE: En parallèle, le deuxième jour préparer PMN frais (tel que décrit dans la section 1). </li><li> Au bout de 2 jours, remplacer le milieu dans les chambres inférieures et supérieures des inserts. <ol><li> À la chambre inférieure, ajouter du milieu RPMI-1640 complété avec 10% de FCS et IH-interleukine (IL) -8, à une concentration finale de 50 nM / ml. Ne pas ajouter de l'IL-8 pour contrôler les chambres basses. </li><li> À chaque chambre supérieure, ajouter 10 6 frais PMN dans 100 pi de milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FCS-IH. </li></ol></li><li> Incuber les plaques à fragmentation à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 90 min. </li><li> Après 90 minutes d'incubation, éliminer les cellules de la partie supérieure et les chambres inférieures séparément et compter chaque sous-population. cellules express dans chaque chambre en pourcentage du total des cellules ajoutées. REMARQUE: Retirez délicatement les cellules de la chamb supérieureer en pipetant doucement afin d'éviter l'élimination des cellules endothéliales et les transférer dans un tube stérile. Retirer les cellules de la chambre inférieure par pipetage et de lavage de la chambre inférieure à 500 ul et le transfert à un second tube stérile. </li><li> Piscine 10 6 cellules de plusieurs puits de transmigration (chambre basse) et non-migration (chambre supérieure) fractions de PMN et de la culture pour chacun des 7 jours sans facteurs de croissance tel que spécifié dans les étapes 14 - 16 (section 1). </li><li> Spin cellules sur des lames 16 et analyser les cellules développées dans chaque condition de culture par microscopie confocale , comme décrit dans la section 2. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

phagocytes géants (Gφ) sont une sous-population nouvellement défini de cellules neutrophiles dérivé exprimant des marqueurs neutrophiles fondamentaux et spécifiques tels que CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Ce type de phagocytes neutrophiles dérivée n&#39;a pas été décrite dans la littérature auparavant. Contrairement à neutrophiles qui sont de courte durée et subissent l&#39;apoptose, Gφ sont Annexin-V-négatif et afficher la durée de vie prolongée. Pourtant, comme les neutrophiles, Gφ internaliser également des particules et de produire la NADPH oxydase dépendante ROS en réponse à ces particules et de PMA. Cependant, leur capacité à intérioriser oxLDL et par conséquent pour produire ROS sont des caractéristiques uniques de Gφ. 14 Un certain nombre de facteurs ont été montrés pour influencer leur développement dans la culture. L&#39;absence de cytokines externes ou des facteurs de croissance dans le milieu de croissance est essentiel (en particulier le GM-CSF / IL-4). Cependant, la migration des neutrophiles vers IL-8 fut un facteur discriminant entre ceux qui developed en Gφ et ceux qui ne l&#39;a pas. En outre, l&#39; internalisation des débris provenant de neutrophiles apoptotiques, l&#39;expression de protéines de autophagie (de LC3B) et fonctionnelle NADPH oxydase, ont tous montré impératif pour leur développement, puisque leur inhibition a empêché la formation Gφ (Figure 1). Il semble que le développement de ces cellules géantes provenant de neutrophiles est différent de celui caractérisant la formation de cellules géantes dans la lignée monocyte / macrophage. Le formulaire multi-nucléées dernières cellules géantes associées à des maladies diverses inflammatoires chroniques, 20, 21 tandis que le Gφ neutrophile décrit ci développent par l&#39; intermédiaire autophagocytose par engloutit les restes cellulaires et restent pour la plupart mononuclées tout au long de leur développement, 14 (rarement cependant, parfois , une seconde noyau peut être observé). En outre, un certain nombre de contrôles mis en place leur origine neutrophile: (1) expression des marqueurs neutropilic spécifiques et l&#39;absence de marqueurs dendritiques et la lignée monocytaire, (2) leur développement entravé dans les monocytes / PMN co-cultures, (3) leurs différents modèles de mouvement dans la culture de macrophages (comme en témoigne l&#39;imagerie des cellules vivantes et le temps microscopie -lapse), 14 (4) leur adhésion à la lumière des plats en plastique et (5) de leur développement pur CD15 + / CD14 - PMN acquis par cytométrie en flux. Certaines des fonctions identifiées in vitro peuvent nous donner des indices quant à leurs fonctions potentielles in vivo. Par exemple, les capacités de Gφ à consommer de grandes quantités de granules de polynucléaires neutrophiles et des débris, la présence de grandes vacuoles et le LC3B d&#39;expression - une protéine autophagy ce qui contribue à diminuer l&#39; inflammation grâce à des interactions de régulation avec des voies de signalisation de l&#39; immunité innée, 22 - qui capacités support de balayage. En tant que tel, Ces résultats indiquent également que Gφ pourrait être opérationnel dans les sites inflammatoires où le système Mφ / DC est insuffisante ou dépassés, et contribuent ainsi à la résolution de l&#39;inflammation. Cette notion pourrait être étayée par le fait que dans les cultures de monocytes / neutrophiles mixtes développement Gφ est entravée. 14 En outre, étant donné que Gφ express oxLDL scavenger récepteurs (CD36, CD68), internaliser oxLDL, et produire des ROS en réponse à elle, peut indiquer qu&#39;ils sont impliqués dans les processus athérosclérotiques pour résoudre l&#39; inflammation. Depuis Gφ développé qu&#39;à partir de neutrophiles qui ont migré vers l&#39;IL-8, et la transmigration de neutrophiles à travers les monocouches endothéliales vers IL-8 représente le recrutement de neutrophiles aux sites inflammatoires aigus, cette constatation peut également soutenir les fonctions anti-inflammatoires. A l&#39;inverse, la performance de Gφ dans certaines conditions inflammatoires pourrait leur permettre de remplir les constituants granulaires et ROS, ainsi, contribuer à paret l&#39;inflammation des cohérents lésions tissulaires. 20 Cependant, dans l&#39; ensemble, leurs capacités autophagiques indiquent que Gφ sont susceptibles impliqués dans la diminution de la réponse inflammatoire plutôt que de perpétuer. Il est intéressant que nous avons récemment identifié la présence de Gφ dans les plaques athéroscléreuses humaines. (en préparation). Pourtant, un grand nombre de questions restent à démêler. Par exemple, sont Gφ pro- ou anti-inflammatoire? Quels sont les facteurs qui déterminent leur formation et la fonction in vitro ou in vivo? Quels spécifiques neutrophiles est leur sous-population cellulaire précurseur qui facilite leur développement en Gφ? Sont-ils associés à certaines pathologies et qui? Collectivement, ce qui pose des questions intéressantes quant à leur origine et fonctions potentielles. Cependant étapes critiques et les pièges au sein du protocole devraient être gardés à l&#39;esprit. Une étape cruciale dans le développement de Gφ ide mise en culture des cellules neutrophiles purs dans un milieu dépourvu de cytokines, des facteurs de croissance ou des antibiotiques. Une autre étape cruciale consiste à exclure que Gφ développer à partir des monocytes contaminantes et de déterminer l&#39;origine de neutrophile Gφ. Ainsi, après la séparation du sang par gradient discontinu, les neutrophiles ont été ensuite soumises à une étape supplémentaire de purification par cytométrie de flux en utilisant des granulocytes et CD15 + ouverture de porte / CD14 - marqueurs. Le Gφ développé obtenu à partir de neutrophiles qui ont été encore purifiées par cytométrie de flux de séparation ne diffèrent pas de ceux qui ne sont pas soumis à cette étape de purification. Par conséquent, la plupart des expériences ont été effectuées sans l&#39;cytométrie étape de purification en raison de la perte de cellules supplémentaires. Il faut noter que, dans certains cas rares, des eosinophiles ont été observées dans la culture. Leur taille est restée inchangée pendant toute la période de culture. Il faut aussi noter que bien qu&#39;il existe un certain nombre de méthodespour la séparation des neutrophiles du sang humain, la méthode décrite ici est la seule méthode, nous avons employé et donc nous ne pouvons pas comparer le développement Gφ par d&#39;autres méthodes disponibles pour la séparation des neutrophiles. Un écueil majeur dans l&#39;enquête Gφ résulte de l&#39;impossibilité d&#39;obtenir un nombre suffisant de population Gφ pur approprié pour différents dosages biochimiques. Il est pratiquement impossible dans les conditions de nos expériences ont été menées. Tout d&#39;abord, le rendement en Gφ est faible. 1,0 x 10 6 PMN ensemencée environ 1-200 Gφ développent au bout de sept jours dans la culture, en fonction du donneur de sang. Deuxièmement, il est fondamentalement difficile au moment de séparer la Gφ développée dans la culture des débris de neutrophiles restant dans le plat. Ces contraintes ont rendu pratiquement impossible d&#39;analyser les cellules par des méthodes de biologie moléculaire ou de biochimie. Par conséquent, ce protocole se concentre à décrire l&#39;identification et la fonction Gφ en utilisant la lumièreet microscopie confocale. Leur transformation morphologique de neutrophiles dans Gφ dans la culture a également été suivie par imagerie des cellules vivantes et Vidéomicroscopie. 14 Apparemment, beaucoup plus grands volumes de sang peuvent être nécessaires pour mettre en œuvre des méthodes de biologie biochimiques ou moléculaires et de surmonter le faible rendement obtenu et à séparer le Gφ viable de débris de neutrophiles dans le plat. En résumé, nous avons récemment décrit pour la première fois le développement de Gφ dans la culture, une sous-population de phagocytes à long terme d&#39;origine neutrophile. Par conséquent, il est la seule méthode actuellement disponible pour obtenir Gφ en culture, bien que les deux limitations majeures mentionnées ci-dessus doivent être surmontés (le faible rendement de l&#39;Gφ obtenu en culture et l&#39;impossibilité de séparer le Gφ développé à partir des débris de neutrophiles dans la culture plat). Pourtant, leur préparation et leur identification, présentés dans ce protocole, est essential pour les scientifiques intéressés par les réponses inflammatoires et neutrophiles la biologie et de la plasticité, afin d&#39;étudier plus avant l&#39;importance potentielle et les fonctions de Gφ.

neutrophiles polynucléaires (PMN) constituent la plus grande population de leucocytes dans le sang, servant de la première ligne de défense contre les pathogènes envahisseurs en produisant un large éventail de molécules cytotoxiques. La vue traditionnelle a longtemps été celle du sang circulant, de courte durée, phagocytes professionnels, qui sont les premiers à arriver à des sites inflammatoires aigus pour lutter contre les infections et de l'aide dans le jeu des agents pathogènes et les particules nocives. 1 Dans leur état non activé, les neutrophiles sont constitutivement engagés à l' apoptose. Lors de la migration du sang vers des sites inflammatoires, l'activation des neutrophiles subissent pour résoudre l'inflammation. Ils phagocytent et tuent les micro-organismes envahissants, en produisant un réseau de molécules cytotoxiques espèces réactives de l'oxygène (ROS), des enzymes lytiques telles que l'élastase neutrophile (NE) et les cathepsines ayant une activité microbicide. Pour les agents pathogènes de pièges, les neutrophiles libèrent également des pièges extracellulaires (TNE), Qui se composent de fils chromatine nucléaires contenant des peptides antibactériens et diverses enzymes lytiques. Cependant, la libération incontrôlée de ces molécules cytotoxiques à partir de neutrophiles peut aussi perpétuer des réponses inflammatoires et provoquer des lésions aux tissus environnants. 2 Par conséquent, un jeu efficace de neutrophiles apoptotiques par les macrophages (Mφ) et des cellules dendritiques (DC) est essentielle pour résoudre l' inflammation. 3, 4, 5, 6 Ces dernières années cependant, il est devenu de plus en plus évident que les neutrophiles sont très polyvalents cellules, dont les fonctions vont bien au-delà de la phagocytose et l'agent pathogène à mort. 6, 7 En subissant l' amorçage ou l' activation, la plasticité neutrophiles gagne progressivement attention. neutrophiles Par exemple, les bactéries et les mycobactéries contestés ont été montrés àsécréter de l'interleukine (IL) -10 et le contrôle de la réponse inflammatoire, suggérant la présence de réponses immuno-régulation. 8 neutrophiles post-mitotiques se sont révélés trans-différencier en cellules Mφ-like, ou des cellules DC , comme par digestion et de la présentation des fragments antigéniques quand ils sont traités avec des cytokines et des facteurs de croissance, 9, 10 par conséquent, servir un rôle crucial dans l' intégration innée et adaptative réponses. 3, 6 Activation par des facteurs de croissance promu engloutissement de neutrophiles apoptotiques ou des débris de cellules, de ce fait, ce qui facilite la clairance de débris sur les sites inflammatoires et la résolution de l' inflammation, 3, 9 en particulier lorsque le système de dédouanement Mφ / DC est insuffisante ou dépassés, 11, 12 suggérant «l'autorégulation» potentiel pour aider à rerésoudre la réponse inflammatoire. Ce, depuis l'apoptose est une forme d'auto-mort réglementé qui peut inhiber la libération extracellulaire de composés cytotoxiques et ainsi prévenir les blessures aux tissus environnants. 6 une survie prolongée est une autre caractéristique de l'activation des neutrophiles et a été mise en évidence par traitement avec divers facteurs de l'hôte dérivés tels que le granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), des cytokines inflammatoires telles que l'interféron ( IFN) -γ, du facteur de nécrose tumorale (TNF) -a produits et / ou dérivés d'agents pathogènes, ce qui permet de moduler leur neutrophiles réaction de survie. 6 En fait, la survie des neutrophiles est une condition préalable à sa plasticité et était associé à sa capacité à effectuer la phagocytose. 6, 13 Par conséquent, il a également été montré associer à phénotypiques et fonctionnelles des changements qui Depended sur l'expression génique régulée à la hausse en induisant la synthèse de nouvelles protéines impliquées dans la prolongation de la durée de vie des neutrophiles et l'apoptose diminuée. dix Contrairement à neutrophiles qui sont de courte durée et constitutivement subissent l'apoptose dans la culture, ou les neutrophiles cytokines / facteurs de croissance activés, décrits ci-dessus, qui ont étendu la durée de vie, nous avons récemment identifié une nouvelle, petite sous-population de neutrophiles qui se développe spontanément dans la culture norme prolongée les conditions de neutrophiles fraîchement isolés du sang humain , sans ajouter à l' extérieur des cytokines ou des facteurs de croissance. 14 phagocytes géants Ces cellules neutrophiles dérivés, qui ne sont pas décrits auparavant dans la littérature ont été qualifiées de (Gφ). Le Gφ ont prolongé la durée de vie dans la culture, ils sont complètement développés dans les 5-7 jours, et sont caractérisées par des caractéristiques morphologiques uniques, l'expression phénotypique et fonctions. Ils sont largement agrandies en raison de autophagocytose des morts restes neutrophiles, vacuoles, et contiennent phagolysosomes. Le Gφ expriment le marqueur de granules de polynucléaires neutrophiles spécifiques - groupe de différenciation (CD) 66b, les granules azurophiles des marqueurs - CD63 et de la myéloperoxydase (MPO) et des neutrophiles marqueurs supplémentaires , tels que CD11b, NE, CD15, les sous - unités de la NADPH oxydase gp91- phox et p22- phox et le -LC3BII marqueur de l' autophagie. 14, 15 Fonctionnellement, ils activement take-up des billes de latex et de particules de zymosan, et générer des ROS en réponse à zymosan et phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) stimulation. Il est intéressant, à la différence des neutrophiles frais, Gφ aussi exprimer de manière intensive les récepteurs scavenger CD68 et CD36, take-up oxydation des lipoprotéines de basse densité (oxLDL), et générer des ROS en réponse à une stimulation avec oxLDL. En outre, Gφ sont dépourvus des marqueurs de la lignée monocytes CD14, CD16 et CD163 ou les marqueurs dendritiques CD1c et CD141. En outre, phagocytosis et autophagie et probablement la NADPH oxydase fonctionnelle sont des conditions préalables à leur développement. Ce depuis, l'phagocytose inhibiteur cytochalsin B, les inhibiteurs de l'autophagie 3-methyladenine (3-MA) ​​et bafilomycine (BafA1) et l'inhibiteur de la NADPH oxydase - diphénylène iodonium (DPI) - a empêché leur développement. En outre, les monocytes / neutrophiles co-cultures ainsi que l'exposition à l'hypoxie intermittente entravé leur développement, alors que l'adaptation des neutrophiles à l'hypoxie soutenue était évidente. 14,15 Leur développement suggéré dans la culture est illustrée à la figure 1 protocole .Le dans le présent document décrit étape par étape la préparation de Gφ de fraîchement isolés neutrophiles circulants du sang humain, leur développement, l' identification et certaines caractéristiques de base. Ce protocole peut être utilisé pour poursuivre l'enquête et révéler le large spectre et les rôles de ces nouveaux décrit et intrigant neutrophiles dérivé Gφ pour characterize leur signification et leurs fonctions potentielles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig1.jpg"> Figure 1: Représentation schématique du géant des cellules de développement en 7 Cultures Day neutrophiles. Il est suggéré que dans les sites inflammatoires (1) neutrophiles subissent la mort cellulaire apoptotique, et (2) la libération membrane encerclées fragments contenant des débris nucléaires, des granulés (vert et points rouges), et d' autres constituants subcellulaires qui déclenchent des mécanismes de autophagie. (3) les phagocytes géants (Gφ) développer dans des cultures de cellules neutrophiles à long terme dépourvu de cytokines ou de facteurs de croissance par l' intériorisation des corps apoptotiques et des débris de neutrophiles, tout en maintenant la fonction de NADPH oxidase.They sont caractérisés par différentes neutrophile CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / NE, des marqueurs grands phagosomes enserrant les granules et les débris cellulaires et les récepteurs scavenger CD36 et CD68. Gb1; sont des cellules mononucléées la plupart du temps, capables d'internaliser également diverses particules et LDL oxydé et générer des ROS. Les membranes des vacuoles de remplissage Gφ contiennent LC3B (marqué en bleu foncé), un marqueur de la membrane autophagosomal, ce qui suggère une association stricte entre l'autophagie et la formation de phagocyte géant. Gφ ne se développent pas dans un milieu contenant du GM-CSF / IL-4. En outre, des inhibiteurs tels que l'inhibiteur de la NADPH oxydase - diphénylène iodonium (DPI), les inhibiteurs de l'autophagie 3-methyladenine (3-MA) ​​et bafilomycine (BafA1) et l'inhibiteur de la phagocytose cytochalasine B (. Cyto B) abolissent leur formation. (4) les fonctions potentielles Gφ in vivo peuvent inclure des propriétés et la participation aux processus athérosclérotiques anti ou pro-inflammatoires (ce chiffre est basé sur nos résultats 14, 15 et a été modifié à partir de la rédaction d' accompagnement par BErton 20). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig1large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Set stérile pour les veines du cuir chevelu (21GX3/4)&nbsp ;</td><td>Bio Diagnostics Ltée</td><td># 20080312</td><td>Une aiguille strile pour venicule</td></tr><tr><td>VACUETTE HOLDEX Support à usage unique PP</td><td>Greiner Bio-One</td><td># 450263</td><td>Pour sécuriser lors de la ponction veineuse&nbsp ;</td></tr><tr><td>VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td># 455036</td><td>Tube stérile pour prélèvement sanguin</td></tr><tr><td>Nunclon MultiDish (24 puits x 1 ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td># 142475</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique en polypropylène (50 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td># E14103PJ</td><td></td></tr><tr><td>Transwell-24 puits (test de transmigration)</td><td>Corning</td><td># CA-3415</td><td>Membrane en polycarbonate, 6,5 mm de diamètre, 3 & mu ; m pores)&nbsp ;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 moyen</td><td>BioIndustries</td><td># 01-100-1A</td><td>Ne pas ajouter d’antibiotiques&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>EA.hy926 (ATCC CRL2922)&nbsp ; &nbsp ;</td><td>BioIndustries</td><td># CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s&nbsp ; Aigle modifié' s Medium</td><td>BioIndustries</td><td># 302002</td><td>milieu de croissance complet</td></tr><tr><td>Polysaccharose - Histopaque1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 1119-1</td><td>Qualité de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Polysaccharose - Histopaque1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 1077-1</td><td>Qualité de culture tissulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) - sans ions</td><td>BioIndustries</td><td># 02-023-1A</td><td>Qualité de biologie cellulaire et de biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (HI-FCS)</td><td>BioIndustries</td><td># 04-121-1B</td><td>Grade de biologie cellulaire ou de culture tissulaire, faible LPS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td># S3014</td><td>Qualité de biologie moléculaire, convient à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, 16 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td># 15710</td><td>Grade de biologie cellulaire ou grade de culture tissulaire (seulement 16 % PFA)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td>Grade de biologie moléculaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>BioIndustries</td><td># 04-009-1</td><td>Biologie cellulaire et biologie moléculaire Trypan</td></tr><tr><td>blue</td><td>BioIndustries</td><td># 031021B</td><td>Grade de culture tissulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>May-Gr&uuml ; nwald</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># MG500</td><td>Biologie cellulaire-(procédure n° GS-10)</td></tr><tr><td>Kit de coloration Giemsa</td><td>Sigma</td><td># 48900</td><td>Grade de biologie cellulaire-(procédure n° GS-10)</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BioIndustries</td><td># 03090105</td><td></td></tr><tr><td>Interleukine-8 humaine (CXCL8)</td><td>PeproTech</td><td># 200-08-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 (clone 5A3B11B5)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-58951</td><td>IgG2b de souris ; exprimée par&nbsp ; monocytes</td></tr><tr><td>Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-5275</td><td>IgG1 de souris ; exprimée par les neutrophiles</td></tr><tr><td>Anti-CD66b (clone 80H3)</td><td>AbD Serotec</td><td># MCA216</td><td>IgG1 de souris ; exprimée par les neutrophiles</td></tr><tr><td>Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-090-695</td><td>IgG2a de souris ; exprimée par&nbsp ; cellules dendritiques</td></tr><tr><td>Anti-CD15 (clone MY-1)</td><td>Abcam</td><td># ab754</td><td>IgM de souris ; exprimée par les neutrophiles</td></tr><tr><td>Chaîne légère anti-cytochrome b-245 (p22-phox) (clone 44.1)</td><td>BioLegend</td><td># 650001</td><td>IgG2a de souris ; pour reconnaître le complexe de neutrophiles NADPH oxydase</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Protein Tech</td><td># 16192-1-AP</td><td>Rabbit IgG ; pour reconnaître le récepteur de piégard oxLDL&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-LC3B</td><td>Sigma</td><td># L7543</td><td>IgG de lapin&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-myéloperoxydase</td><td>Abcam</td><td># ab45977</td><td>IgG de lapin</td></tr><tr><td>Élastase anti-neutrophile</td><td>Calbiochem</td><td># 481001</td><td>IgG de lapin&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-NOX2 (gp91-phox)</td><td>Abcam</td><td># ab131083</td><td>IgG de lapin</td></tr><tr><td>Anti-CD36 (SR-B3)</td><td>Novus Biologicals</td><td># NB400-144</td><td>IgG</td></tr><tr><td>de lapin Souris purifiée IgG1, &kappa ; Contrôle des isotypes (clone MG1-45)</td><td>BioLegend</td><td># 401401</td><td>Anticorps utilisés comme contrôle des isotypes</td></tr><tr><td>Souris purifiées IgG2a, &kappa ; Contrôle des isotypes (clone MOPC-173)</td><td>BioLegend</td><td># 400263</td><td>Anticorps utilisés comme contrôle des isotypes</td></tr><tr><td>IgG normales de lapin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-2027</td><td>Anticorps utilisés comme contrôle des isotypes</td></tr><tr><td>CF488A Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L)</td><td>Biotium&nbsp ;</td><td># 20012</td><td>Anti-Lapin IgG avec le colorant fluorescent vert CF488A</td></tr><tr><td>CF647 Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L)</td><td>Biotium&nbsp ;</td><td># 20043</td><td>Anti-Lapin IgG avec le colorant fluorescent rouge CF647</td></tr><tr><td>CF488A Chèvre Anti-Souris IgG (H+L)</td><td>Biotium&nbsp ;</td><td># 20010</td><td>IgG anti-souris avec le colorant fluorescent vert CF488A</td></tr><tr><td>CF647 IgG anti-souris de chèvre (H+L)</td><td>Biotium&nbsp ;</td><td># 20040</td><td>Anti-souris IgG avec le colorant fluorescent rouge CF647</td></tr><tr><td>Médium de montage fluorescent avec DAPI</td><td>Vectashield H-1000 ; Laboratoire Vecteur Inc.</td><td># E19-18</td><td>Coloration nucléaire</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser (LSM 700)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 3523000380 Plan</td><td>Apo 40X objectif à huile d’immersion&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel Zeiss CLSM (ZEN 2010)</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>version 6.0</td><td>Pour l’analyse de colocalisation</td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>Wayne Rasband, NIH, États-Unis</td><td>version 1.49k</td><td>Pour la détermination des zones cellulaires et de l’intensité de fluorescence</td></tr><tr><td>Microscope optique (Axiovert 25)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 201060153</td><td>Examen des cellules en culture</td></tr><tr><td>Centrifugeuse (Megafuge 1.0 R)</td><td>Heraeus Instruments</td><td># D-37520</td><td>Séparation des cellules du sang ; préparation des cytospins</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée (Zeiss Axio Observer Z.1)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 3834001470</td><td>Démonstration du développement de phagocytes géants</td></tr><tr><td>Système d’incubation à température contrôlée (Cube& Box)</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>Système de contrôle de la température pour microscopes</td></tr><tr><td>&nbsp ; caméra CCD numérique à résolution (AxioCam HRm)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 117090279</td><td>Pour capturer des données d’image à contraste élevé à partir d’objets cellulaires examinés</td></tr><tr><td>Stylo barrière hydrophobe (Elite PAP Pen)</td><td>Diagnostic Biosystems</td><td># K039</td><td>Pour définir le périmètre cellulaire pour la coloration par immunofluorescence</td></tr></tbody></table>

développement et identification d'une sous-population novel of human neutrophiles dérivé phagocytes géant in vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophiles (PMN) sont surtout connus pour leurs fonctions phagocytaires contre l&#39;invasion des agents pathogènes et des micro-organismes. Ils ont la demi-vie la plus courte parmi les leucocytes et dans leur état non activé sont constitutivement commis à l&#39;apoptose. Lors de l&#39;embauche à des sites inflammatoires pour résoudre l&#39;inflammation, ils produisent un réseau de molécules cytotoxiques avec mise à mort antimicrobienne puissante. Pourtant, lorsque ces puissantes molécules cytotoxiques sont libérés de manière incontrôlée, ils peuvent endommager les tissus environnants. Ces dernières années cependant, la polyvalence neutrophiles est de plus en plus mis en évidence, en démontrant les fonctions de plasticité et immunorégulatrices. Nous avons récemment identifié une nouvelle sous-population de neutrophiles dérivés, qui se développe spontanément dans des conditions standard de culture sans addition de facteurs cytokines / de croissance tels que facteur de stimulation des colonies de granulocytes (GM-CSF) / interleukine (IL) -4. Leurs capacités phagocytaires des restes de neutrophiles contribuent largement à augmenter leurtaille immense; phagocytes géants donc on les appelait (Gφ). Contrairement à neutrophiles, Gφ vivent longtemps dans la culture. Ils expriment le cluster de différenciation (CD) des marqueurs de neutrophiles CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / myéloperoxydase (MPO) / élastase neutrophile (NE), et sont dépourvus de l&#39;monocytaire marqueurs de la lignée CD14 / CD16 / CD163 et les marqueurs CD1c / de CD141 dendritiques . Ils prennent également en place latex et zymosan, et réagissent en oxydatif à la stimulation avec opsonisé-zymosan et PMA. Gφ expriment également le piégeur des récepteurs CD68 / CD36, et contrairement à neutrophiles, internaliser oxydée-lipoprotéines de basse densité (oxLDL). En outre, contrairement neutrophiles frais ou monocytes cultivés, ils répondent à oxLDL l&#39;absorption par des espèces réactives de l&#39;oxygène a augmenté (ROS). En outre, ces phagocytes contiennent la chaîne légère associée aux microtubules protéine-1 3B (LC3B) vacuoles enrobés, indiquant l&#39;activation de l&#39;autophagie. L&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs spécifiques, il est évident que, à la fois la phagocytose et autophagy sont prerequisites pour leur développement et leur NADPH oxydase dépendante probable ROS. Nous décrivons ici un procédé pour la préparation de cette nouvelle sous-population de cellules à vie longue neutrophile dérivé phagocytaires en culture, leur identification et de leurs caractéristiques connues actuellement. Ce protocole est essentiel pour l&#39;obtention et la caractérisation Gφ afin d&#39;étudier plus leur signification et les fonctions.

Neutrophiles autophagocytose et le développement en culture Neutrophiles autophagocytose et leur développement en Gφ dans les 7 jours de culture est représenté sur les figures 3 et 4. Par jours 4 - 7, leur taille était considérablement agrandie, 15 et autophagosytosis était évident dès 90 min après la co-culture des neutrophiles avec des taches membranaires fluorescentes (PKH-26, rouge; PKH-67, vert). 14 En tant que témoin à ce neutrophiles sous - population, certaines cultures de neutrophiles ont également été traités avec GM-CSF / IL-4. Les cellules traitées par des cytokines ont augmenté en taille au sein de 7 - 14 jours en culture comme décrit précédemment. 18, 19 Mais, étaient plus petits que Gφ et avait des projections cytoplasmiques ressemblant à DC-comme des cellules (Figure 5), comme indiqué précédemment b y Oehler et al. 19 En outre, le GM-CSF / IL-4 cellules traitées ont été négatifs ou avaient une faible expression CD66b, 15 démontrant clairement les différences morphologiques et potentiellement fonctionnels ainsi. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig3.jpg"> Figure 3: autophagocytose dans le développement phagocytes Giant (Gφ) dans la culture. neutrophiles purifiés fraîchement isolées ont été marquées avec PKH-67 (vert) ou PKH-26 (rouge) membrane colorants fluorescents à temps zéro, puis co-cultivées et suivis jusqu'à sept jours. Les cellules ont été centrifugées sur des lames de verre, les noyaux ont été colorés avec du DAPI et les échantillons ont été analysés par microscopie confocale. Autophagocytose est déjà perceptible après 90 min de co-culture. La fusion du rouge et du vert au jaune et orange est clairement évident dans le Gφ développement.fichiers / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "&gt; S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig4.jpg"> Figure 4: Développement de Giant phagocytes (Gφ) dans la culture. neutrophiles purifiés fraîchement isolés ont été suivis jusqu'à 7 jours en culture. Les cellules ont été filées sur des lames de verre à des intervalles de temps indiqués, colorées avec mai Grunewald-Giemsa, et analysées avec un microscope à champ clair. Un individu avec quelques éosinophiles est présenté à titre de comparaison. Notez que la taille des éosinophiles reste inchangé dans la culture. huile Grossissement 100X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig4large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig5.jpg"> Figure 5: Comparaison entre le développement de Géant phagocytes (G φ) et GM-CSF / IL traité neutrophiles dans la culture. (A) May Grunwald-Giemsa neutrophiles colorées cultivées sans (Gφ) et avec le GM-CSF / IL-4 pendant 7 jours. Les échantillons ont été analysés avec un microscope à champ clair. Grossissement, X40. Les cellules développées dans des cultures avec un milieu complété avec du GM-CSF / IL-4 montrent des projections cytoplasmiques répandues mais sont plus petites que Gφ. (B) neutrophiles fraîchement isolés ont été marqués avec PKH-26 (rouge) colorant et cultivées dans un milieu exempt de cytokine pendant 7 jours ou étiquetés avec PKH-67 (vert) colorant et cultivées dans un milieu additionné de GM-CSF / IL-4 pour 7 jours. Ensuite, les cellules développées ont été mélangés dans un rapport 1: 1 et co-cultivées pendant 2 heures. Les cellules ont été fixées et analysées par confocale MICRoscopy. Ce chiffre a été modifié de la référence. 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig5large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Pour approfondir le cours du développement Gφ, leurs modifications morphologiques ont également été suivies par microscopie time-lapse. Vidéo-1 (jour 3 au jour 4) et vidéo-2 (4 de jour en jour 5) démontrent leur développement dans les cultures de neutrophiles purifiés. Ces Gφ sont non-adhérente ou légèrement adhérente avec une capacité de mouvement limitée et ingèrent activement entourant les restes de neutrophiles et de débris. Clip-3, le mouvement des dérivées de monocytes et Mφ Gφ est comparée à une culture de monocyte / neutrophile mixte. Le Mφ explore activement (à gauche, cellule sans étiquette). Le Gφ (à droite), est lumineuse PKH-26 cellules marquées. Vidéo-1: illustre le développement du géant phagocytes dans les cultures purifiées PMN sur Days 3 - 4 par Time-lapse Microscopy. Les neutrophiles ont été suivis dans la culture du jour 3 au jour 4 par time-lapse système de microscopie time-lapse une microscopie est composé de microscope inversé fluorescent motorisé, et un B / W caméra CCD haute résolution, avec une sur l'incubateur de la scène. Capture d'image acquisition de time-lapse a été prise toutes les 10 min. Publié à l' origine en référence 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-1.mpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov2.jpg"> Vidéo-2: illustre le développement de Géant phagocytes dans Purifié PMN Culture Days 4-5 par Timoi-lapse Microscopy. Les neutrophiles ont été suivis dans la culture du jour 4 au jour 5 par microscopie time-lapse. Le système de microscopie time-lapse est composé de microscope inversé motorisé fluorescent, et un B / W caméra CCD haute résolution, avec une sur l'incubateur de la scène. Capture d'image acquisition de time-lapse a été prise toutes les 10 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-2.mp4" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov3.jpg"> Vidéo-3: un phagocyte géant et un macrophage Développé en co-culture. Monocytes / neutrophiles co-culture a été suivie-up du jour 4 au jour 5 par microscopie time-lapse. monocyte-macrophage dérivé (à gauche); lumineux (PKH-26 teinté cellulaire) phagocyte géant neutrophiles dérivés (à droite). Le système de microscopie time-lapse pour la vidéo est composé de micr inversé fluorescent motoriséoscope, et un B / W caméra CCD haute résolution, avec une sur l'incubateur de la scène. Capture d'image acquisition de time-lapse a été prise toutes les 10 min. Publié à l' origine en référence 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-3.mp4" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> Expression des marqueurs dans les phagocytes géants L'origine neutrophile de Gφ a été vérifiée par l' expression positive des marqueurs de neutrophiles suivants CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (Figure 6). Le Gφ a également exprimé la NADPH oxydase, les récepteurs scavenger oxLDL - CD68 et CD36, et contenait vacuoles LC3B revêtues et les agrégats (identifiés par Western blot comme LC3BII 15), ce qui démontre la présence d'un marqueur d'autophagie. Cependant, ils ont été négatifs pour la lignée monocytaire (CD14, CD16 et CD163) et Dendritcellules ic (CD1c et CD141) marqueurs, suggérant que Gφ ne se pose pas de monocytes contaminantes. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig6.jpg"> Figure 6: Expression de différents marqueurs pour les neutrophiles, monocytes et cellules dendritiques en géant phagocytes (Gφ) après 7 jours de culture. expression positive de l'neutrophiles spécifique granule marqueur CD66b, le azurophile granulés marqueurs CD63 et MPO, élastase neutrophile et CD15. expression négative pour les CD1c et CD141 marqueurs dendritiques et les marqueurs de la lignée monocytes CD14, CD16 et CD163. En outre, Gφ exprimé l'autophagie marqueur LC3B, les récepteurs scavenger CD68 et CD36 et les sous-unités NADPH oxydase sous-unités gp91-phox / p22-phox. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI, et les échantillons ont été analysés par microscopie confocale. Ce chiffre a été modifié depuis les références. 14 p&gt;, 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig6large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Fonctions de Gφ - NADPH Oxidase Activation, ROS Production et phagocytose: Phagocytose de billes de latex et le zymosan opsonisé était évidente dans Gφ. Gφ également généré basale ROS (figure 7A), et a répondu à zymosan et PMA stimulation par oxydatif (Figure 7B-D). Cependant, à la différence des monocytes ou neutrophiles, Gφ généré ERO également en réponse à la stimulation et oxLDL ont été colorées par l' huile rouge O (figure 7B, F). À noter, le traitement des neutrophiles fraîches avec l'inhibiteur de la NADPH oxydase - DPI, non seulement inhibé la production de ROS, mais aussi pformation Gφ revented dans la culture, ce qui suggère que la signalisation ROS est essentiel pour la formation Gφ. 14, 15 <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig7.jpg"> Figure 7: Burst oxydative, phagocytose et oxLDL Uptake par Giant phagocytes (Gφ). Production (A) Basal ROS est évident dans les lysosomes de Gφ. (B) la production de ROS en réponse à LDL oxydées (oxLDL), PMA et zymosan (particules de zymosan sont clairement indiquées). (C) nitrobleu tétrazolium (NBT) test Gφ montrant l' activité d'éclatement respiratoire avec et sans PMA (diapositives sont des souillures, mais les inserts sont colorés au May Grunwald-Giemsa). (D) NBT essai et mai Grunewald-Giemsa colorées Gφ avec du PMA et PMA / DPI qui inhibe la NADPH oxydase et ROS. (E) Phagocytose de Latex et zymosan IgG-opsonisé dans PKH-26 (rouge) cellules colorées. (F) Oil Red O coloration dans non traitée et traitée oxLDL Gφ. Ce chiffre a été modifié depuis les références. 14, 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig7large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Transmigration de PMN à travers les cellules endothéliales Afin d'identifier les neutrophiles potentiels des sous-populations qui pourraient se développer dans Gφ, la migration des neutrophiles à travers les monocouches de cellules endotheliales a été déterminé (figure 8A). Après 90 minutes, 62,3 ± 12,2% des neutrophiles à travers les cellules endothéliales transmigré vers l'IL-8 dans le compartiment inférieur. Il convient de noter, Gφ positif pour CD66b / CD15 / LC3B développé seulement de la population transmigré de neutrophiles , tandis que les cellules qui se sont développées à partir de la fraction de neutrophiles non-migration étaient plus petits en taille et en négatif pour les marqueurs neutrophiles CD66b / CD15 (figure 8B, 8C) . <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig8.jpg"> Figure 8: Effets de l' IL-8 dépendant PMN Transmigration à travers les cellules endothéliales sur Géant phagocyte (Gφ) Formation. (A) Un schéma illustrant dosage de transmigration de neutrophiles à travers des monocouches de cellules endothéliales (CEs) vers l' IL-8. Ce test peut être considéré comme un modèle pour les neutrophiles recrutement vers des sites inflammatoires aigus. (B - C) Dans l'analyse de la migration cellulaire (spécifié dans le protocole 3), transmigrant (B) et non-migration (C) neutrophiles fractions ont été cultivées pendant sept jours sans facteurs de croissance (comme dans le protocole 1). Ensuite, les cellules ont été centrifugées sur des lames de verre et analysées par microscopie confocale. Les cellules fixées ont été colorées pour CD66b (rouge), LC3B (vert) et CD15 (rouge). Les noyaux ont été colorés avec DAPI (bleu). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig8large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous décrivons ici un procédé permettant l&#39;obtention et l&#39;identification d&#39;une sous-population nouvellement caractérisé par des phagocytes géantes neutrophile dérivé. Ces cellules se développent dans la culture à partir de neutrophiles frais du sang humain, et sont caractérisées par la phagocytose, l&#39;autophagie, immensément grande taille, et la durée de vie prolongée. Cette méthode est indispensable d&#39;étudier plus avant cette sous-population de neutrophiles dérivé unique.

Développement et identification d'une sous-population Novel of Human neutrophiles dérivé phagocytes géant In vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Les objectifs généraux de cette méthode sont de générer et d’identifier des phagocytes géants cultivés in vitro dérivés de neutrophiles humains circulants afin d’étudier leur rôle dans les réponses immunitaires inflammatoires et anti-inflammatoires. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir et identifier une nouvelle sous-population de phagocytes géants qui se développent à partir de neutrophiles humains pour maintenir des conditions de culture à long terme. Cette technique peut être utilisée pour approfondir la signification et les fonctions des phagocytes géants, ainsi que pour répondre à des questions clés sur leur activation et leur plasticité.Eva Leder, notre assistante de recherche, et Oksana Rogovoy, post-doc, toutes deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Utilisez un ensemble de veines du cuir chevelu stériles pour obtenir au moins 40 millilitres de sang veineux d’un jeune volontaire en bonne santé. Ensuite, mélangez doucement le sang dans une hotte à flux laminal de biosécurité.Diluez 10 à 12 millilitres d’aliquotes de l’échantillon de sang entier jusqu’à un volume final de 24 millilitres avec du PBS préchauffé sans ions contenant 2 % de FCS inactivé par la chaleur. Ajoutez ensuite 12 % de millilitres de polysaccharose 1119 au fond d’un tube à centrifuger conique en polypropylène stérile de 50 millilitres par aliquote d’échantillon de sang, suivi d’une superposition soigneuse de 12 millilitres de polysaccharose 1077 sur la solution de gradient de polysaccharose 1119. Pipeter soigneusement 24 millilitres de sang dilué dans des tubes individuels des solutions de gradient de densité et séparer les cellules par centrifugation.Les deux couches opaques résultantes doivent être observées. Jetez le fluide jusqu’à 0,5 centimètre au-dessus de la couche de cellule mononucléaire dans chaque tube. Transférez ensuite les cellules mononucléées de chaque échantillon dans un seul nouveau tube.Ensuite, jetez le liquide restant jusqu’à 0,5 centimètre au-dessus de la cellule polymorphonucléaire ou de la couche PMN et transférez les PMN de chaque échantillon dans un nouveau tube différent. Laver les NMP dans un volume final de 30 millilitres de PBS contenant 2 % de FCS inactivé par la chaleur, suivi d’une lyse des globules rouges avec trois millilitres de chlorure de sodium hypotonique stérile et glacé. Après 30 secondes sur la glace, rétablissez l’isotonicité avec trois millilitres de chlorure de sodium stérile glacé à 1,6 %.Ajoutez ensuite six millilitres de milieu RPMI 1640 à 37 degrés Celsius complété par un FCS inactivé par la chaleur et collectez les cellules par centrifugation. Remettre le granulé en suspension dans quatre millilitres de RPMI 1640 complété par 10 % de FCS inactivé par la chaleur. Après le comptage, ajustez la concentration à 1,25 à 1,5 fois 10 puissance six PMN par millilitre de milieu de culture et placez un millilitre de cellules par puits dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits.Placez ensuite la plaque dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, en nourrissant les cultures en remplaçant doucement la moitié du milieu par du milieu frais RPMI 1640 complété par 10 % de FCS inactivé par la chaleur tous les trois jours. Les neutrophiles se différencieront en phagocytes géants dans les sept jours suivant la culture. Le septième jour de culture, retirez soigneusement la moitié du milieu de chaque puits.Ensuite, pipetez vigoureusement le milieu restant pour éliminer les phagocytes géants légèrement adhérents. Transférez les cellules détachées de deux à quatre puits de chaque groupe de traitement dans des tubes coniques individuels de 15 millimètres et collectez les cellules par centrifugation, en remettant les granulés en suspension dans 100 à 120 microlitres de milieu par tube. Équipez ensuite deux à trois supports par groupe de traitement de lames de microscope, de cartes filtrantes et d’entonnoirs.Ensuite, ajoutez tout le volume de cellules de chaque tube dans l’entonnoir Cytospin approprié. Ensuite, chargez les supports sur un Cytospin et faites tourner les cellules sur les lames. Faites sécher les lames filées pendant 10 minutes.Ensuite, utilisez un marqueur stable à l’eau pour dessiner une barrière hydrophobe autour des cellules et fixez les échantillons avec 4 % de paraformaldéhyde sous une hotte chimique à température ambiante. Après 10 minutes, rincez brièvement les lames trois fois avec environ 100 microlitres de PBS par lavage. Ensuite, perméabilisez les cellules avec 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante, suivies de cinq lavages de PBS comme cela vient d’être démontré.Bloquez la liaison non spécifique avec 10 % de sérum de chèvre normal dans le milieu RPMI 1640 pendant la période appropriée, suivie d’un seul lavage PBS. Maintenant, ajoutez une petite quantité d’eau dans la boîte pour maintenir l’humidité, puis étiquetez les cellules avec environ 100 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt approprié pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre sombre humidifiée. Ensuite, effectuez un seul lavage PBS, puis ajoutez l’anticorps secondaire conjugué à la fluorescence approprié.Après 40 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, lavez les échantillons pour éliminer l’excès d’anticorps et montez les lames avec une goutte de milieu de montage par échantillon et une lamelle. Analysez les lames par microscopie à fluorescence confocale à balayage laser en 30 à 120 minutes sous un objectif d’huile d’immersion 40X. Calculez ensuite la surface cellulaire, l’intensité de fluorescence et la co-localisation à l’aide du logiciel approprié.Le développement des neutrophiles en phagocytes géants dans les sept jours suivant la culture peut être observé sur ces images. L’autophagocytose est évidente dès 90 minutes après la culture de neutrophiles avec des colorants membranaires fluorescents avec un diamètre cellulaire considérablement élargi apparent entre le quatrième et le septième jour. Cependant, si les cultures de neutrophiles sont complétées par du GM-CSF et de l’IL-4, les cellules présentent un diamètre global plus petit et des projections cytoplasmiques ressemblant à des cellules dendritiques.La microscopie à intervalle de temps des phagocytes géants aux jours trois et quatre et quatre et cinq jours révèle des cellules nulles ou légèrement adhérentes avec une capacité de mouvement limitée qui ingère activement les restes et les débris de neutrophiles environnants. Dans cette culture mixte de neutrophiles monocytaires, la migration d’un macrophage rampant activement peut être comparée au mouvement presque stationnaire d’un phagocyte géant marqué par fluorescence dans le même puits de culture. L’origine neutrophile des phagocytes géants peut être vérifiée par leur expression positive de l’absence de marqueurs neutrophiles et leur absence d’expression des marqueurs cellulaires monocytaires et dendritiques.Les phagocytes géants génèrent également des espèces réactives basales de l’oxygène et répondent à la stimulation zymosane et PMA par explosion oxydative. Cependant, contrairement aux monocytes ou aux neutrophiles, ils répondent également par des rafales oxydatives à la stimulation des lipoprotéines de basse densité oxydées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à sept jours.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de remplacer doucement la moitié du milieu lors de l’alimentation des cultures de neutrophiles. Suite à cette procédure, d’autres techniques de coloration peuvent être réalisées pour répondre aux questions sur les fonctions supplémentaires de ces cellules intrigantes in vitro ainsi qu’in vivo. Cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des neutrophiles pour explorer l’activation et la plasticité des neutrophiles et identifier ces cellules in vivo dans des conditions physiologiques et physiopathologiques chez l’homme.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir et d’identifier les phagocytes géants en culture. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain peut être potentiellement infectieux et que des précautions telles que le port de gants, le fait de jeter tous les liquides et d’utiliser du matériel jetable dans les contenants appropriés pour les produits à risque biologique sont indispensables lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

Cette vidéo présente une technique in vitro pour générer et isoler des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles sont isolés du sang périphérique et stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA) pour produire des TNE. Au cours de l’incubation, les neutrophiles subissent un processus de mort cellulaire (NETosis) pour libérer des TNE composées de chromatine décondensée mélangée à des protéines cytoplasmiques granulaires.

Une technique in vitro pour générer des pièges extracellulaires de neutrophiles humains

Les neutrophiles jouent un rôle important non seulement dans la défense de l’hôte contre les micro-organismes envahisseurs, mais sont également impliqués dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ici, nous décrivons des techniques liées à l’isolement de neutrophiles ayant des propriétés antitumorales et des méthodes de surveillance de la fonction antitumorale des neutrophiles in vitro et in vivo.

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

Les neutrophiles sont le type de globules blancs le plus abondant. L’isolement des neutrophiles du sang humain par la méthode de séparation par gradient de densité et la différenciation des cellules promyélocytaires humaines (HL60) le long de la voie granulocytaire sont décrits ici ; Tester leur rôle sur la sensibilité des cellules du lymphome aux agents anti-lymphomes.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Ce manuscrit décrit une méthode simple pour mesurer le pH du phagosome et de la zone, ainsi que le pH cytoplasmique des neutrophiles humains et de souris en utilisant l'indicateur ratiométrique seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Ceci est réalisé en utilisant la microscopie à fluorescence confocale cellules vivantes et l'analyse d'image.

Imagerie du neutrophile Phagosome et Cytoplasme L&#39;utilisation d&#39;un pH Ratiométrique Indicateur

Nous présentons ici un protocole visant à détecter la présence de neutrophiles dans les sections fixes/perméabilisées histologie et évaluer l’état d’activation des neutrophiles purifiées direct. En particulier, le peptide de40 MUB lie la lactoferrine présente dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. Exposition du contenu par perméabilisation ou activation neutrophile granule permet le marquage des neutrophiles.

Le Peptide de40 MUB destinés à détecter l’Inflammation induite par le neutrophile événements

Ce protocole détaille une méthode pour isoler les neutrophiles du sang total, des manteaux bouffants ou des membranes de leucaphérèse, obtenant un bon rendement, une pureté élevée et une activation cellulaire minimale. Nous utilisons la purification par gradient, la sédimentation des globules rouges (RBC) et la lyse des globules rouges pour obtenir une préparation de neutrophiles de haute qualité / pureté.

Isolement des neutrophiles humains du sang total et des buffys

Ce protocole comprend un ensemble de tests fonctionnels des neutrophiles à utiliser comme méthode de criblage pour couvrir les fonctions de différentes voies de signalisation. Le protocole comprend une évaluation initiale et simple de la viabilité cellulaire, de la pureté, de la production d’espèces réactives de l’oxygène, de la migration en temps réel, de la phagocytose et d’une suggestion préliminaire de pièges extracellulaires à neutrophiles.

Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles

Ce manuscrit décrit un protocole pour la préparation d’une banque ATAC-seq de neutrophiles à partir de moelle osseuse murine, visant à garantir une viabilité optimale des neutrophiles et une qualité de bibliothèque élevée. Il offre des instructions étape par étape sur la préparation des BMC, le tri immunomagnétique et la construction de bibliothèques, servant de guide précieux, en particulier pour les nouveaux venus dans l’étude des neutrophiles.

Bibliothèque ATAC-Seq Préparation de neutrophiles dérivés de la moelle osseuse murine

Les neutrophiles de basse densité (LDN) augmentent considérablement dans plusieurs maladies. Les LDN sont généralement isolés par tri cellulaire. Nous présentons une méthode pratique pour obtenir de la NDT pure et viable. Après la centrifugation du sang périphérique par gradient de densité, les cellules sont incubées avec des microbilles magnétiques, puis la LDN est séparée par des colonnes magnétiques.

Méthode à microbilles magnétiques rapides pour la purification efficace de neutrophiles de faible densité

Découvrez comment générer et identifier des phagocytes géants dérivés de neutrophiles humains in vitro. Cette méthode permet d'étudier leur rôle dans les réponses immunitaires inflammatoires et anti-inflammatoires.

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