Développement et identification d'une sous-population Novel of Human neutrophiles dérivé phagocytes géant In vitro

Les objectifs généraux de cette méthode sont de générer et d’identifier des phagocytes géants cultivés in vitro dérivés de neutrophiles humains circulants afin d’étudier leur rôle dans les réponses immunitaires inflammatoires et anti-inflammatoires. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir et identifier une nouvelle sous-population de phagocytes géants qui se développent à partir de neutrophiles humains pour maintenir des conditions de culture à long terme. Cette technique peut être utilisée pour approfondir la signification et les fonctions des phagocytes géants, ainsi que pour répondre à des questions clés sur leur activation et leur plasticité.

Eva Leder, notre assistante de recherche, et Oksana Rogovoy, post-doc, toutes deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Utilisez un ensemble de veines du cuir chevelu stériles pour obtenir au moins 40 millilitres de sang veineux d’un jeune volontaire en bonne santé. Ensuite, mélangez doucement le sang dans une hotte à flux laminal de biosécurité.

Diluez 10 à 12 millilitres d’aliquotes de l’échantillon de sang entier jusqu’à un volume final de 24 millilitres avec du PBS préchauffé sans ions contenant 2 % de FCS inactivé par la chaleur. Ajoutez ensuite 12 % de millilitres de polysaccharose 1119 au fond d’un tube à centrifuger conique en polypropylène stérile de 50 millilitres par aliquote d’échantillon de sang, suivi d’une superposition soigneuse de 12 millilitres de polysaccharose 1077 sur la solution de gradient de polysaccharose 1119. Pipeter soigneusement 24 millilitres de sang dilué dans des tubes individuels des solutions de gradient de densité et séparer les cellules par centrifugation.

Les deux couches opaques résultantes doivent être observées. Jetez le fluide jusqu’à 0,5 centimètre au-dessus de la couche de cellule mononucléaire dans chaque tube. Transférez ensuite les cellules mononucléées de chaque échantillon dans un seul nouveau tube.

Ensuite, jetez le liquide restant jusqu’à 0,5 centimètre au-dessus de la cellule polymorphonucléaire ou de la couche PMN et transférez les PMN de chaque échantillon dans un nouveau tube différent. Laver les NMP dans un volume final de 30 millilitres de PBS contenant 2 % de FCS inactivé par la chaleur, suivi d’une lyse des globules rouges avec trois millilitres de chlorure de sodium hypotonique stérile et glacé. Après 30 secondes sur la glace, rétablissez l’isotonicité avec trois millilitres de chlorure de sodium stérile glacé à 1,6 %.

Ajoutez ensuite six millilitres de milieu RPMI 1640 à 37 degrés Celsius complété par un FCS inactivé par la chaleur et collectez les cellules par centrifugation. Remettre le granulé en suspension dans quatre millilitres de RPMI 1640 complété par 10 % de FCS inactivé par la chaleur. Après le comptage, ajustez la concentration à 1,25 à 1,5 fois 10 puissance six PMN par millilitre de milieu de culture et placez un millilitre de cellules par puits dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits.

Placez ensuite la plaque dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, en nourrissant les cultures en remplaçant doucement la moitié du milieu par du milieu frais RPMI 1640 complété par 10 % de FCS inactivé par la chaleur tous les trois jours. Les neutrophiles se différencieront en phagocytes géants dans les sept jours suivant la culture. Le septième jour de culture, retirez soigneusement la moitié du milieu de chaque puits.

Ensuite, pipetez vigoureusement le milieu restant pour éliminer les phagocytes géants légèrement adhérents. Transférez les cellules détachées de deux à quatre puits de chaque groupe de traitement dans des tubes coniques individuels de 15 millimètres et collectez les cellules par centrifugation, en remettant les granulés en suspension dans 100 à 120 microlitres de milieu par tube. Équipez ensuite deux à trois supports par groupe de traitement de lames de microscope, de cartes filtrantes et d’entonnoirs.

Ensuite, ajoutez tout le volume de cellules de chaque tube dans l’entonnoir Cytospin approprié. Ensuite, chargez les supports sur un Cytospin et faites tourner les cellules sur les lames. Faites sécher les lames filées pendant 10 minutes.

Ensuite, utilisez un marqueur stable à l’eau pour dessiner une barrière hydrophobe autour des cellules et fixez les échantillons avec 4 % de paraformaldéhyde sous une hotte chimique à température ambiante. Après 10 minutes, rincez brièvement les lames trois fois avec environ 100 microlitres de PBS par lavage. Ensuite, perméabilisez les cellules avec 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante, suivies de cinq lavages de PBS comme cela vient d’être démontré.

Bloquez la liaison non spécifique avec 10 % de sérum de chèvre normal dans le milieu RPMI 1640 pendant la période appropriée, suivie d’un seul lavage PBS. Maintenant, ajoutez une petite quantité d’eau dans la boîte pour maintenir l’humidité, puis étiquetez les cellules avec environ 100 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt approprié pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre sombre humidifiée. Ensuite, effectuez un seul lavage PBS, puis ajoutez l’anticorps secondaire conjugué à la fluorescence approprié.

Après 40 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, lavez les échantillons pour éliminer l’excès d’anticorps et montez les lames avec une goutte de milieu de montage par échantillon et une lamelle. Analysez les lames par microscopie à fluorescence confocale à balayage laser en 30 à 120 minutes sous un objectif d’huile d’immersion 40X. Calculez ensuite la surface cellulaire, l’intensité de fluorescence et la co-localisation à l’aide du logiciel approprié.

Le développement des neutrophiles en phagocytes géants dans les sept jours suivant la culture peut être observé sur ces images. L’autophagocytose est évidente dès 90 minutes après la culture de neutrophiles avec des colorants membranaires fluorescents avec un diamètre cellulaire considérablement élargi apparent entre le quatrième et le septième jour. Cependant, si les cultures de neutrophiles sont complétées par du GM-CSF et de l’IL-4, les cellules présentent un diamètre global plus petit et des projections cytoplasmiques ressemblant à des cellules dendritiques.

La microscopie à intervalle de temps des phagocytes géants aux jours trois et quatre et quatre et cinq jours révèle des cellules nulles ou légèrement adhérentes avec une capacité de mouvement limitée qui ingère activement les restes et les débris de neutrophiles environnants. Dans cette culture mixte de neutrophiles monocytaires, la migration d’un macrophage rampant activement peut être comparée au mouvement presque stationnaire d’un phagocyte géant marqué par fluorescence dans le même puits de culture. L’origine neutrophile des phagocytes géants peut être vérifiée par leur expression positive de l’absence de marqueurs neutrophiles et leur absence d’expression des marqueurs cellulaires monocytaires et dendritiques.

Les phagocytes géants génèrent également des espèces réactives basales de l’oxygène et répondent à la stimulation zymosane et PMA par explosion oxydative. Cependant, contrairement aux monocytes ou aux neutrophiles, ils répondent également par des rafales oxydatives à la stimulation des lipoprotéines de basse densité oxydées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à sept jours.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de remplacer doucement la moitié du milieu lors de l’alimentation des cultures de neutrophiles. Suite à cette procédure, d’autres techniques de coloration peuvent être réalisées pour répondre aux questions sur les fonctions supplémentaires de ces cellules intrigantes in vitro ainsi qu’in vivo. Cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des neutrophiles pour explorer l’activation et la plasticité des neutrophiles et identifier ces cellules in vivo dans des conditions physiologiques et physiopathologiques chez l’homme.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir et d’identifier les phagocytes géants en culture. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain peut être potentiellement infectieux et que des précautions telles que le port de gants, le fait de jeter tous les liquides et d’utiliser du matériel jetable dans les contenants appropriés pour les produits à risque biologique sont indispensables lors de l’exécution de cette procédure.