Imagerie du neutrophile Phagosome et Cytoplasme L'utilisation d'un pH Ratiométrique Indicateur

Ce manuscrit décrit une méthode simple pour mesurer le pH du phagosome et de la zone, ainsi que le pH cytoplasmique des neutrophiles humains et de souris en utilisant l'indicateur ratiométrique seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Ceci est réalisé en utilisant la microscopie à fluorescence confocale cellules vivantes et l'analyse d'image.

L’objectif global de cette technique de microscopie confocale est d’imager le pH et la surface de la vacuole phagocytaire des neutrophiles et du cytoplasme. Cette méthode permet de surveiller et de quantifier les changements dynamiques du pH dans la vacuole phagocytaire et dans le cytoplasme, ainsi que le volume de la vacuole phagocytaire. Ces mesures changent avec l’activité de la NADPH oxydase et peuvent être utilisées comme marqueurs de substitution de sa fonction et des flux d’ions à travers la membrane de la vacuole phagocytaire.

Le principal avantage de cette technique est que le phagosome et le cytoplasme peuvent être imagés simultanément avec un colorant qui a une large gamme de pH. Pour commencer cette procédure, préparez une aliquote d’ester carboxy-S-1 succinimidylique en diluant 50 microgrammes de celui-ci dans 100 microlitres de DMSO de haute qualité. Vortex il bien mélanger.

Ensuite, préparez un millilitre d’un fois 10 à la huitième chaleur tuée ou HK Candida dans 0,1 molaire de bicarbonate de sodium dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez 100 microlitres de carboxy-S-1, une goutte à la fois, au HK Candida tout en mélangeant sur un vortex à 2 000 tr/min. Après cela, enveloppez le tube avec du papier d’aluminium et placez-le sur un rouleau à température ambiante pendant une heure.

Au bout d’une heure, laver le HKC-S-1 trois fois par centrifugation à 2, 250 fois g pendant 10 minutes à chaque fois. Pour les deux premiers lavages, remettez la pastille en suspension dans 15 millilitres de bicarbonate de sodium 0,1 molaire. Après le troisième lavage, mettez-le en suspension dans un millilitre de tampon BSS.

Transférez la suspension HKC-S-1 dans les tubes d’aliquotes de 100 microlitres et stockez-les à moins 20 degrés Celsius. Pour opsoniser HKC-S-1 pour les neutrophiles humains, ajoutez 100 microlitres de sérum IGG humain à 100 microlitres de HKC-S-1 décongelé. Mélangez-le sur un shaker à 37 degrés Celsius et 1 1000 tr/min pendant 60 à 90 minutes, puis sur un rouleau, à quatre degrés Celsius pendant deux heures.

Après cela, laver l’échantillon trois fois dans le tampon BSS par centrifugation à 17 000 fois g pendant une minute chacune. Par la suite, mettez à nouveau l’échantillon en suspension dans 100 microlitres de tampon BSS. Pour les neutrophiles du sang périphérique humain, prélever 15 millilitres de sang par ponction veineuse d’un donneur sain et le transférer dans une seringue de 20 millilitres contenant 90 microlitres de solution d’héparine sodique à 1 000 UI par millilitre.

À l’aide d’une pointe de pipette, injectez 1,5 millilitre de solution de dextran à 10 % dans la seringue. Retournez-le doucement trois fois, puis laissez-le debout sur le banc pendant 30 à 60 minutes. Après 30 à 60 minutes, le sang devrait se diviser grossièrement en deux, avec une couche supérieure de couche leucocytaire de couleur paille et une couche inférieure contenant des érythrocytes.

Poussez délicatement la couche supérieure à l’aide d’une aiguille ou retirez-la à l’aide d’une pointe de pipette, puis transférez-la dans un tube de 15 millilitres et évitez de retirer la couche rouge. À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, ajoutez trois à quatre millilitres de milieu à gradient de densité au fond du tube, sous la couche de couche leucocytaire, pour obtenir deux couches distinctes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 900 fois g pendant 10 minutes.

Videz le surnageant et laissez la pastille rouge derrière vous. Ensuite, faites doucement tourbillonner pour perturber la pastille. Ensuite, ajoutez sept millilitres d’eau distillée autoclavée à la pastille et retournez-la pendant 20 secondes pour remettre la pastille en suspension.

Ensuite, ajoutez sept millilitres de solution saline 2x et retournez-le plusieurs fois pour mélanger, en lysant les globules rouges restants, puis centrifugez l’échantillon à 300 fois g pendant cinq minutes. Videz le surnageant et remettez la pastille en suspension dans le tampon BSS à environ quatre fois 10 à six par millilitre. Dans cette procédure, prétraitez une plaque de microscopie à huit puits avec 200 microlitres de poly-L-lysine dans chaque puits pendant 40 à 60 minutes à température ambiante, puis retirez la poly-L-lysine et lavez les puits deux fois avec 200 microlitres d’eau distillée.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la suspension cellulaire préparée dans chaque puits et incubez-la à température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Après cela, préparez une aliquote d’ester S-1-AM en ajoutant 100 microlitres de DMSO de haute qualité dans un tube et un vortex pour mélanger. Dans un petit tube, ajoutez 1,7 millilitres de tampon BSS et 20 microlitres de S-1-AM et vortex le mélange.

Ensuite, lavez les puits deux fois avec 200 microlitres de tampon BSS et remplacez le tampon par une solution S-1-AM. Veillez à ne pas perturber la monocouche cellulaire fixée au fond du puits en pipetant doucement le liquide le long de la paroi des puits. Ensuite, incubez l’échantillon à température ambiante pendant au moins 25 minutes.

Ensuite, lavez les puits deux fois avec 200 microlitres de tampon BSS. Pour tester un inhibiteur, préparez un mélange maître du médicament approprié dans le tampon BSS et lavez les puits deux fois avec. Ensuite, sonifiez le HKC-S-1 opsonisé pendant environ trois secondes à cinq microns et ajoutez-en 10 microlitres dans chaque puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes, rendant les cellules prêtes à être imagées pour des instantanés de phagocytose.

À l’aide d’un microscope confocal, ajustez la longueur d’onde du laser de sorte que les cellules soient excitées à 555 nanomètres et que l’émission soit détectée par deux détecteurs à 560 à 600 nanomètres, et à plus de 610 nanomètres. Ensuite, visualisez les cellules à l’aide d’une lentille à immersion dans l’huile 63X. Utilisez une image de numérisation de tuile en mode continu pour afficher la tuile centrale.

En utilisant l’intensité de fluorescence et le gain des canaux du détecteur, ajustez la mise au point et l’intensité du laser ainsi que le gain des deux canaux pour optimiser l’image. Après cela, divisez l’image à l’aide des paramètres pour afficher les deux canaux. Avant le début de l’expérience, vérifiez qu’il n’y a pas de saturation de l’intensité de fluorescence dans le cytoplasme ou les vacuoles, qui apparaîtraient sous forme de points rouges.

Si c’est le cas, réduisez l’intensité du laser afin qu’il y ait un nombre minimal de points rouges, mais que les cellules et les phagosomes soient suffisamment brillants et clairs pour être vus. Dans cette procédure, ouvrez ImageJ et chargez le fichier image choisi pour l’analyse dans la barre d’outils. Pour combiner les deux couches, utilisez Image, Couleur, puis Rendre composite.

Faites un clic droit pour choisir un fichier pour stocker les résultats. Ensuite, cliquez sur l’outil Ligne dans la barre d’outils et double-cliquez pour augmenter la largeur à deux. Tracez une ligne sur la largeur d’un phagosome puis faites un clic droit pour mesurer le pH.

Le pH cytoplasmique peut être mesuré de la même manière en traçant une ligne à travers le cytoplasme. Une fois les mesures terminées, faites un clic droit pour choisir Enregistrer le fichier. Pour mesurer l’aire du phagosome, utilisez la quatrième icône le long de la barre d’outils pour dessiner à main levée autour de l’aire.

Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner Mesurer la zone. Voici une clé visuelle qualitative de la couleur approximative des phagosomes colorés en S-1 correspondant au pH. La couleur jaune indique plus d’acidité tandis que le rouge indique plus d’alcalinité.

Cette image montre des neutrophiles de moelle osseuse liés à la souris dépourvus du canal Hvcn1 20 minutes après la phagocytose. Les phagosomes apparaissent très rouges, alcalins et gonflés. La flèche rouge pointe ici vers un Candida intracellulaire, tandis que cette flèche pointe vers un Candida extracellulaire.

Cette image montre des neutrophiles de moelle osseuse de souris de type sauvage qui ont ingéré Candida. Ils sont beaucoup moins alcalins que les neutrophiles knock-out Hvcn1. Cette image montre les neutrophiles du sang périphérique humain au même moment après la phagocytose.

Ils semblent légèrement plus alcalins que les cellules sauvages de la souris, mais les phagosomes ne sont toujours pas aussi grands et rouges que les cellules knock-out Hvcn1, et cette image montre des neutrophiles humains qui ont phagocyté Candida en présence de cinq diphénylènes iodonium micromolaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre à cinq heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être prudent lors de l’isolement des neutrophiles afin qu’ils ne soient pas activés.

Afin de déterminer si les effets que l’on observe sur les changements du pH vacuolaire ou cytosolique ou du volume vacuolaire sont dus à des changements dans l’explosion respiratoire, alors cette explosion respiratoire peut être mesurée d’autres manières qui mesurent directement la production de radicaux libres ou la consommation d’oxygène. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les neutrophiles humains, puis de colorer et d’imager le phagosome et le cytoplasme. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de sang humain peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de vêtements de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.