Imagerie du neutrophile Phagosome et Cytoplasme L'utilisation d'un pH Ratiométrique Indicateur

Le but général de cette technique de microscopie confocale est d'imaginer le pH et la surface de la vacuole phagocytaire et du cytoplasme des neutrophiles. Cette méthode permet la surveillance et la quantification des changements dynamiques du pH dans la vacuole phagocytaire et dans le cytoplasme, ainsi que du volume de la vacuole phagocytaire. Ces mesures varient selon l'activité de la NADPH oxydase et peuvent être utilisées comme marqueurs indirects de sa fonction et des flux ioniques à travers la membrane de la vacuole phagocytaire.

L'avantage principal de cette technique est que le phagosome et le cytoplasme peuvent être imagés simultanément à l'aide d'un colorant possédant une large gamme de pH. Pour commencer cette procédure, préparez une aliquote d'ester succinimidyle de carboxy-S-1 en diluant 50 microgrammes de ce composé dans 100 microlitres de DMSO de haute pureté. Vortexez soigneusement pour bien mélanger.

Ensuite, préparez un millilitre de Candida inactivé par la chaleur, ou HK Candida, à une concentration de 1 fois 10 puissance 8 dans du bicarbonate de sodium 0,1 molaire dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez 100 microlitres de carboxy-S-1, une goutte à la fois, au HK Candida tout en mélangeant sur vortex à 2 000 tr/min. Ensuite, enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et placez-le sur un rouleau à température ambiante pendant une heure.

Après une heure, laver les HKC-S-1 trois fois par centrifugation à 2 250 ×g pendant 10 minutes à chaque fois. Pour les deux premiers lavages, reprendre le culot dans 15 millilitres de bicarbonate de sodium 0,1 molaire. Après le troisième lavage, reprendre le culot dans un millilitre de tampon BSS.

Transférez la suspension de HKC-S-1 dans des tubes contenant des aliquotes de 100 microlitres et stockez-les à moins 20 degrés Celsius. Pour opsoniser HKC-S-1 pour les neutrophiles humains, ajoutez 100 microlitres de sérum humain IGG à 100 microlitres de HKC-S-1 décongelé. Mélangez à l’aide d’un agitateur chauffant à 37 degrés Celsius et 1 1000 tr/min pendant 60 à 90 minutes, puis sur un rouleau, à quatre degrés Celsius pendant deux heures.

Après cela, laver l'échantillon trois fois dans du tampon BSS par centrifugation à 17 000 ×g pendant une minute à chaque fois. Ensuite, reprendre l'échantillon dans 100 microlitres de tampon BSS. Pour les neutrophiles du sang périphérique humain, prélever 15 millilitres de sang par ponction veineuse chez un donneur sain et le transférer dans une seringue de 20 millilitres contenant 90 microlitres de solution d'héparine sodique à 1 000 UI par millilitre.

À l’aide d’une pipette, injectez 1,5 millilitre de solution de dextran à 10 % dans la seringue. Retournez-la délicatement trois fois, puis laissez-la en position verticale sur la paillasse pendant 30 à 60 minutes. Après 30 à 60 minutes, le sang devrait se séparer approximativement en deux parties égales, avec une couche supérieure de buffy coat de couleur paille et une couche inférieure contenant les érythrocytes.

Repousser délicatement la couche supérieure à l’aide d’une aiguille ou l’aspirer avec une pipette, puis la transférer dans un tube de 15 millilitres en évitant de prélever la couche rouge. À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, ajouter trois à quatre millilitres de milieu de gradient de densité au fond du tube, sous la couche de buffy coat, afin d’obtenir deux couches distinctes. Ensuite, centrifuger l’échantillon à 900 ×g pendant 10 minutes.

Versez délicatement le surnageant et laissez le culot rouge en place. Ensuite, vortexez doucement pour perturber le culot. Puis, ajoutez sept millilitres d'eau distillée et stérilisée par autoclavage au culot et retournez le tube pendant 20 secondes pour resuspendre le culot.

Ensuite, ajouter sept millilitres de solution saline 2x et retourner le tube plusieurs fois pour mélanger, ce qui lyse les globules rouges restants, puis centrifuger l'échantillon à 300 ×g pendant cinq minutes. Verser le surnageant et resuspendre le culot dans du tampon BSS à environ quatre fois 10 à la puissance six par millilitre. Dans cette procédure, pré-traiter une plaque de microscopie à huit puits avec 200 microlitres de poly-L-lysine dans chaque puits pendant 40 à 60 minutes à température ambiante, puis éliminer le poly-L-lysine et laver les puits deux fois avec 200 microlitres d'eau distillée.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la suspension cellulaire préparée dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Préparez ensuite un aliquot d'ester S-1-AM en ajoutant 100 microlitres de DMSO de haute pureté dans un tube et mélangez au vortex. Dans un petit tube, ajoutez 1,7 millilitre de tampon BSS et 20 microlitres de S-1-AM, puis mélangez le mélange au vortex.

Ensuite, lavez les puits deux fois avec 200 microlitres de tampon BSS et remplacez le tampon par la solution S-1-AM. Veillez à ne pas perturber la monocouche cellulaire attachée au fond des puits en pipetant délicatement le liquide le long de la paroi des puits. Incubez ensuite l'échantillon à température ambiante pendant au moins 25 minutes.

Ensuite, laver les puits deux fois avec 200 microlitres de tampon BSS. Pour tester un inhibiteur, préparer un mélange maître du médicament approprié dans du tampon BSS et laver les puits deux fois avec ce mélange. Puis, soniquer les HKC-S-1 opsonisées pendant environ trois secondes à cinq microns et ajouter 10 microlitres du produit à chaque puits, avant d'incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes, afin de préparer les cellules à être observées pour des images instantanées de la phagocytose.

À l’aide d’un microscope confocal, régler la longueur d’onde du laser de manière à exciter les cellules à 555 nanomètres et détecter l’émission par deux détecteurs entre 560 et 600 nanomètres, et au-delà de 610 nanomètres. Ensuite, observer les cellules à l’aide d’un objectif à immersion huile de 63X. Utiliser une numérisation en mosaïque en mode continu pour visualiser la tuile centrale.

À l’aide de l’intensité de fluorescence et du gain des canaux du détecteur, ajuster la mise au point et l’intensité du laser ainsi que le gain des deux canaux afin d’optimiser l’image. Ensuite, séparer l’image à l’aide des paramètres pour visualiser les deux canaux. Avant le début de l’expérience, vérifier qu’il n’y a pas de saturation de l’intensité de fluorescence dans le cytoplasme ou les vacuoles, ce qui se manifesterait par des points rouges.

Si c'est le cas, réduisez l'intensité du laser de manière à obtenir un nombre minimal de points rouges, tout en assurant que les cellules et les phagosomes soient suffisamment lumineux et nets pour être visibles. Dans cette procédure, ouvrez ImageJ et chargez le fichier image choisi pour l'analyse dans la barre d'outils. Pour combiner les deux canaux, utilisez Image, Color, puis Make Composite.

Cliquez avec le bouton droit pour choisir un fichier afin d'enregistrer les résultats. Ensuite, cliquez sur l'outil de ligne dans la barre d'outils et double-cliquez pour augmenter la largeur à deux. Tracez une ligne traversant la largeur d'un phagosome, puis cliquez avec le bouton droit pour mesurer le pH.

Le pH cytoplasmique peut être mesuré de la même manière en traçant une ligne à travers le cytoplasme. Une fois les mesures terminées, cliquez avec le bouton droit pour choisir Enregistrer le fichier. Pour mesurer la surface du phagosome, utilisez la quatrième icône de la barre d'outils afin de dessiner à main levée autour de la zone.

Ensuite, cliquez avec le bouton droit pour sélectionner Mesurer la surface. Voici une clé visuelle qualitative des couleurs approximatives des phagosomes marqués par S-1 correspondant au pH. La couleur jaune indique une acidité plus élevée, tandis que le rouge indique une alcalinité plus élevée.

Cette image montre des neutrophiles médullaires chez la souris dépourvus du canal Hvcn1, 20 minutes après la phagocytose. Les phagosomes apparaissent très rouges, alcalins et gonflés. La flèche rouge indique ici une Candida intracellulaire, tandis que cette flèche pointe vers une Candida extracellulaire.

Cette image montre des neutrophiles de moelle osseuse de souris de type sauvage ayant ingéré des Candida. Ils sont nettement moins alcalins que les neutrophiles de souris déficientes pour Hvcn1. Cette image montre des neutrophiles de sang périphérique humain au même point temporel après la phagocytose.

Ils apparaissent légèrement plus alcalins que les cellules de type sauvage de souris, mais les phagosomes ne sont toujours pas aussi grands et rouges que ceux des cellules avec invalidation de Hvcn1, et cette image montre des neutrophiles humains ayant phagocyté des Candida en présence de cinq micromoles de diphénylé iodonium. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre à cinq heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire attention lors de l'isolement des neutrophiles afin qu'ils ne soient pas activés.

Afin de déterminer si les effets observés sur les variations du pH vacuolaire ou cytosolique ou sur le volume vacuolaire sont dus à des modifications du burst respiratoire, ce dernier peut être mesuré par d'autres méthodes permettant de quantifier directement la production de radicaux libres ou la consommation d'oxygène. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des neutrophiles humains, puis colorer et imager le phagosome et le cytoplasme. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons sanguins humains peut présenter un danger extrême, et que des précautions telles que le port de gants et de vêtements de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.