Bibliothèque ATAC-Seq Préparation de neutrophiles dérivés de la moelle osseuse murine

Cette recherche vise à optimiser le protocole de construction de la bibliothèque ATAC-Seq pour l’étude de l’accessibilité de la chromatine des neutrophiles. Cette optimisation facilitera l’étude de la reprogrammation épigénétique des neutrophiles et révélera leurs mécanismes de réponse immunitaire sous divers défis et révélera des cibles thérapeutiques potentielles pertinentes pour l’apparition et la progression des maladies. La demi-vie moyenne des neuroneutrophiles est de 12,5 heures et leur demi-vie individuelle est encore plus courte, en raison de leur sensibilité accrue aux stimulations microenvironnementales.

Par conséquent, l’isolement des neutrophiles hautement actifs et la formation de noyaux neutrophiles de haute qualité sont des étapes essentielles mais difficiles pour la construction réussie de banques ATAC-Seq. Nous avons découvert que la séparation immunomagnétique améliore l’efficacité du tri des neutrophiles, garantissant une grande pureté et fournissant un protocole évolutif pour générer des banques ATAC-Seq de haute qualité à partir de neutrophiles de rongeurs. Pour commencer, prenez la souris mâle euthanasiée âgée de six à huit semaines et pesant de 19 à 21 grammes.

À l’aide de petits ciseaux et d’une pince, séparez soigneusement le fémur de l’articulation de la hanche et du tibia. Après avoir retiré la peau attachée et le muscle squelettique, rincez le fémur avec du PBS froid dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Ensuite, coupez les épiphyses du fémur et insérez doucement une aiguille de calibre 28 attachée à une seringue de deux millilitres dans la cavité de la moelle.

Rincer la moelle osseuse avec du PBS froid contenant 2 % de sérum de veau fœtal. Ensuite, utilisez une crépine de cellules de 70 micromètres pour filtrer la suspension cellulaire dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence. Centrifugez le tube à 500 G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius.

Après cela, retirez soigneusement le surnageant, en laissant environ 100 microlitres de liquide au fond, et tapotez doucement le tube pour détacher la pastille. Ensuite, lyse les érythrocytes dans les cellules de la moelle osseuse à l’aide d’un tampon de lyse sans polyformaldéhyde. Enfin, lavez les cellules deux fois avec un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de sérum de veau fœtal avant de les remettre en suspension dans un volume de deux millilitres.

Pour commencer, mettez en suspension les cellules de moelle osseuse préparées dans deux millilitres de milieu RPMI 1640 et centrifugez-les à 500 G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius. Aspirez la majeure partie du surnageant, laissant derrière vous environ 100 microlitres et tapotez doucement le tube pour détacher la pastille. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de billes de LY-6G et tapotez doucement le tube pour les mélanger avec les cellules de la moelle osseuse.

Après avoir remis les billes en suspension dans des cellules de deux millilitres de PBS, centrifugez le tube à 500 G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius. Retirez la majeure partie du surnageant et ajoutez du PBS supplémentaire pour un volume final d’un millilitre. Positionnez la colonne MS dans le champ magnétique d’un séparateur de tri de cellules activées magnétiques compatible.

Rincez la colonne avec 500 microlitres de PBS et répétez l’opération après le passage complet dans la colonne MS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de suspension de cellules de moelle osseuse marquée magnétiquement dans la colonne MS. Une fois que le réservoir de la colonne est vide, remplissez-le immédiatement.

Dès que le réservoir de la colonne est épuisé, retirez la colonne du champ magnétique et positionnez-la sur un tube de cinq millilitres. Après avoir distribué deux millilitres de PBS sur la colonne, enfoncez fermement le piston dans la colonne pour expulser les neutrophiles marqués magnétiquement. Centrifugez les 50 000 suspensions unicellulaires contenant des neutrophiles à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius dans un tube de 0,2 millilitre.

Une fois le surnageant jeté, remettre les neutrophiles en suspension dans 50 microlitres de tampon de lyse pré-refroidi. Mélangez délicatement la solution à l’aide d’une pipette et incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Après avoir centrifuger à nouveau les neutrophiles et éliminé le surnageant, récupérez le noyau.

Placez le tube sur de la glace avant de commencer les procédures ultérieures. Pour commencer, préparez le mélange de réaction de marquage contenant la transposase Tn5 dans un tube PCR. Préchauffez les billes de purification d’amplicon réfrigérées à 25 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes.

Remettre en suspension le noyau neutrophile extrait avec 50 microlitres de mélange de réaction de marquage et agiter doucement avec une pipette. Centrifugez pendant cinq secondes à 2 600 G.Ensuite, incubez le tube de réaction dans un instrument PCR à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de billes de purification d’amplicon prévortex au lysat et mélangez-les soigneusement dans la solution.

Incuber le tube de réaction à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir centrifugé le tube pendant cinq secondes, placez le tube de réaction sur un support magnétique jusqu’à ce que la solution devienne claire pour purifier le fragment d’ADN interrompu. Retirez délicatement le surnageant.

Ensuite, lavez les billes magnétiques avec 200 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparé, tout en maintenant le tube de réaction sur la grille magnétique pendant 30 secondes. Ensuite, retirez le tube de réaction du support magnétique. Ajoutez 26 microlitres d’eau distillée double pour couvrir les billes magnétiques et incuber.

Une fois le tube centrifugé, séparez les billes magnétiques à l’aide d’une grille magnétique jusqu’à ce que la solution devienne claire. Transférez soigneusement 24 microlitres de surnageant dans un nouveau tube PCR. Ajoutez ensuite 27,5 microlitres de billes de purification d’amplicon à 50 microlitres de produits PCR et mélangez-les soigneusement dans la solution.

Incuber le tube de réaction à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes. Centrifugez le tube pendant cinq secondes. Purifiez la bibliothèque d’acide désoxyribonucléique en plaçant le tube de réaction sur une grille magnétique jusqu’à ce que la solution devienne claire.

Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube PCR stérilisé et jetez les billes magnétiques. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes de purification d’amplicon au surnageant et mélangez soigneusement les billes magnétiques dans la solution. Après avoir incubé le tube de réaction à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes, centrifugez-le pendant cinq secondes.

Placez le tube de réaction sur une grille magnétique avant de retirer le surnageant. Lavez les perles magnétiques deux fois avec 200 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparé. Séchez les billes magnétiques pendant cinq minutes avec le couvercle ouvert.

Une fois le tube de réaction retiré du support magnétique, ajoutez 22 microlitres d’eau double distillée pour couvrir les billes magnétiques et incuber. Séparez les billes à l’aide d’une grille magnétique jusqu’à ce que la solution devienne claire. Transférez soigneusement 20 microlitres de surnageant dans un nouveau tube PCR stérilisé avant de le stocker à moins 20 degrés Celsius.

La pureté des neutrophiles a été vérifiée à 98,5 % dans des cellules viables après tri immunomagnétique. L’ADN de la banque de séquençage ATAC a montré des longueurs de fragments comprises entre 100 et 1 000 paires de bases, sans contamination par de petits ou de grands fragments. Une distribution typique de la taille des fragments à ATAC-Seq avec des pics périodiques a été observée, représentant des régions libres de nucléosomes, des mononucléosomes, des dinucléosomes et des trinucléosomes.

Par rapport au contrôle, les neutrophiles stimulés par le LPS ont montré une accessibilité accrue à la chromatine dans des gènes tels que IL-10, STAT-1, IL12A, CXCL1 et IRAK1.