Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes

Ce protocole décrit comment évaluer l'expression d'un large éventail de gènes au niveau clonal. Unicellulaire RT-qPCR produit des résultats très fiables avec une forte sensibilité pour des centaines d'échantillons et les gènes.

L’objectif global de cette expérience est d’observer l’expression de plusieurs gènes dans des cellules uniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que l’hétérogénéité des signatures moléculaires au sein d’une population cellulaire ou une signature moléculaire rare. Le principal avantage de cette technique est que des signatures moléculaires spécifiques avec au moins 48 gènes différents peuvent être évaluées dans plusieurs cellules en même temps.

Commencez cette procédure en préparant un mélange de préamplification pour 48 réactions dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez au tube 240 microlitres de tampon de rétrotranscription spécifique, 62,4 microlitres de tampon TE à faible teneur en EDTA et 9,6 microlitres d’ADN polymérase Taq. À l’aide d’une pipette électronique, répartissez 6,5 microlitres du mélange de préamplification dans chacun des 48 puits d’une plaque unicellulaire de 96 puits.

Ensuite, préparez un mélange de dosage 0,2x dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter au tube 1,4 microlitres de chaque apprêt. Ajustez le volume final à 140 microlitres avec un tampon à faible teneur en EDTA TE.

À l’aide d’une pipette électronique, répartissez 2,5 microlitres du mélange de dosage 0,2x dans les 48 puits de la plaque de tri unicellulaire de 96 puits, contenant le mélange de préamplification. Scellez la plaque avec un film de couverture. Tourbillonnez la plaque et faites-la tourner à 280 fois g pendant une minute.

Les cellules lymphoïdes innées hépatiques uniques, ou ILC, seront triées par tri cellulaire activé par fluorescence. Commencez cette procédure en utilisant une plaque vide de 96 puits comme test. Positionnez la plaque d’essai sur le support de plaque avec le puits a à gauche et vers l’expérimentateur.

Ajustez le support de plaque pour obtenir une chute au centre d’un puits avec des billes de vérification. Lorsqu’elle est correctement réglée, placez la plaque de tri unicellulaire à 96 puits contenant le mélange de test et la préamplification sur le support de plaque. Dessinez la disposition de la plaque et triez une cellule par puits de la population fermée.

Le bon positionnement de chaque cellule sur la plaque de tri à cellule unique de 96 puits est essentiel, et la disposition de la plaque doit être conservée sur un tableur. Laissez un puits contenant un mélange de test 0,2x et un mélange de préamplification sans cellules, comme contrôle sans entrée. Si vous le souhaitez, laissez deux rangées de six puits pour la dilution de l’ADNc comme contrôles de l’efficacité de l’amorce.

Immédiatement après le tri à cellule unique, vortex et rotation vers le bas de la plaque de tri à cellule unique à 96 puits. Placez la plaque dans le thermocycleur. Effectuez la transcription inverse et la préamplification comme indiqué.

La préamplification de gènes cibles spécifiques sur des cellules uniques triées est nécessaire afin d’avoir suffisamment de matériel. Diluez les échantillons pré-amplifiés en ajoutant 36 microlitres de tampon TE à faible teneur en EDTA dans chaque puits. Pour commencer cette procédure, préparez 191 microlitres d’un Master Mix en pipetant 175 microlitres d’un Master Mix qPCR et 17,5 microlitres du réactif de chargement de l’échantillon dans un tube de 1,5 millilitre.

Sur une nouvelle plaque de 96 puits, répartissez 3,6 microlitres du Master Mix dans chacun des 48 puits. Il s’agit de la plaque d’échantillonnage à 96 puits. Transférez 2,9 microlitres d’ADNc préamplifié de la plaque de tri unicellulaire à 96 puits vers la nouvelle plaque d’échantillon à 96 puits, en gardant la même position pour chaque échantillon entre les deux plaques.

Préparez une plaque d’analyse à 96 puits en distribuant trois microlitres de réactif de chargement d’essai à chacun des 48 puits sur une nouvelle plaque à 96 puits. Ajoutez trois microlitres d’amorces dans chaque puits. Le bon positionnement de chaque amorce dans la plaque de dosage à 96 puits est essentiel.

Conservez un plan de plaque sur un tableur. Pour commencer cette procédure, placez le circuit microfluidique intégré, ou IFC, sur la paillasse et vérifiez les vannes à l’aide d’une seringue. Retirez le capuchon de la seringue, placez-la perpendiculairement à une valve et appuyez fermement.

Le joint torique doit bouger. Remplissez la puce avec le liquide de la ligne de contrôle. Après avoir répété les étapes précédentes avec la deuxième vanne, retirez le film noir du bas de la puce.

Chargez la puce dans le contrôleur IFC. Sur l’écran du contrôleur IFC, sélectionnez prime, puis exécutez. Ensuite, éjectez la puce et refermez le film noir au bas de la puce.

À l’aide d’une pipette à huit canaux, transférez cinq microlitres de la plaque de dosage à 96 puits vers le côté gauche de la puce. Changez les pointes pour chaque puits de la puce. Évitez de créer des bulles, et si des bulles apparaissent, utilisez des embouts de 10 microlitres pour les éliminer.

Remplissez le côté gauche de la puce comme indiqué. De la même manière, remplissez le côté droit de la puce à l’aide de cinq microlitres de la plaque d’échantillon à 96 puits. Pour le succès de cette expérience, il est essentiel que la puce IFC soit correctement remplie pour un chargement correct dans le contrôleur IFC.

Retirez le film bleu du bas de la puce et chargez-la dans le contrôleur IFC. Sur l’écran du contrôleur IFC, sélectionnez load mix, puis exécutez. Une fois terminé, éjectez la puce et refermez le film bleu au bas de la puce.

Pour faire fonctionner la puce, sélectionnez d’abord le logiciel de collecte de données sur l’ordinateur qPCR microfluidique. Une fois qu’il démarre, sélectionnez nouvelle exécution. Sélectionnez Éjecter et charger la puce.

Après avoir configuré le logiciel comme décrit dans le protocole texte, sélectionnez Démarrer l’exécution. La réaction prendra environ 90 minutes. Pour commencer l’analyse des données, ouvrez le logiciel d’analyse PCR en temps réel, sélectionnez fichier, puis ouvrez, recherchez le dossier de l’expérience et sélectionnez chip run point b m un fichier.

Cliquez sur la vue d’analyse, le tableau des résultats et la vue de la carte thermique. Les cases marquées d’un x sont en dessous du niveau de détection de seuil et/ou avaient de mauvaises courbes d’amplification. Nommez les échantillons.

Allez dans la configuration de l’échantillon et sélectionnez nouveau SBS 96. Cliquez sur mappage et sélectionnez la disposition de l’échantillon selon la disposition de la plaque d’échantillonnage à 96 puits. Copiez et collez l’exemple de mise en page à partir du tableur.

Définissez la mise en page collée comme nom d’échantillon. Utilisez la même procédure pour nommer les dosages. Entrez les noms d’amorce dans la configuration du détecteur et définissez la disposition collée comme nom de détecteur.

Cliquez sur la vue d’analyse et analysez. Sélectionnez un fichier, exportez et enregistrez en tant que résultats de carte thermique. À l’aide de la cytométrie en flux, les populations hépatiques d’ILC ont été triées en fonction de marqueurs ILC largement exprimés, et trois populations distinctes ont été définies.

Une puce d’expression génique multiplex à cellule unique correctement chargée doit apparaître avec des lignes droites et des rangées, chaque chambre de réaction étant remplie et dans la même dimension. Une puce mal chargée aura des lignes vides et des rangées de chambres de réaction, ainsi que des lignes de pliage. Cette figure de fluorescéine amidite d’une puce correctement chargée montre des différences de luminosité de la chambre de réaction apparaissant après quelques cycles.

Les chambres de réaction avec un signal d’amplification apparaissent plus lumineuses que les chambres de réaction avec des signaux d’amplification faibles ou nuls. Après un tri cellulaire, une préamplification et un chargement appropriés, la population ILC est apparue hétérogène pour l’expression génique dans le foie de souris adultes de type sauvage. Sur la gauche se trouve une carte thermique sans modifications.

Sur la droite se trouve la carte thermique modifiée obtenue après la définition de l’échantillon et du nom du test. À l’aide d’un logiciel en ligne, des signatures d’expression génique spécifiques aux cellules et des relations entre les populations cellulaires ont été identifiées. Chaque ligne représente un gène, et chaque ligne représente la même cellule, et les trois populations de cellules sont représentées en bleu, rouge et vert.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en neuf heures, si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de suivre attentivement l’orientation de la plaque pour la distribution des cellules et des amorces. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer des signatures moléculaires rares et spécifiques dans les populations cellulaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer l’expression de plusieurs gènes dans de nombreuses cellules uniques en même temps, après un tri cellulaire, une pré-amplification et un chargement appropriés.