Name: Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Apprenez l'analyse d'expression génique unicellulaire par RT-qPCR multiplex pour caractériser l'hétérogénéité des populations lymphoïdes rares. Cette méthode permet d'évaluer simultanément 48 gènes dans de nombreuses cellules.

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Ce travail a été soutenu par l’Institut Pasteur, l’INSERM, l’Université Paris Diderot et par le Ministère de la Recherche (à S.C.) ; l’Association pour la Recherche sur le Cancer (à S.C. et R.G.) ; le Programme d’Investissements d’Avenir REVIVE et l’Agence Nationale de Recherche (ANR ; subvention ''Twothyme'' à A.C.) ; Bourse ANR ''Myeloten'' (à R.G.) ; et l’Institut National du Cancer (Rôle du microenvironnement immunitaire au cours de la carcinogenèse hépatique, à R.G.). Nous remercions la plateforme du Centre d’immunologie humaine et de cytométrie de l’Institut Pasteur pour son soutien.

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité de sécurité Institut Pasteur en accord avec le ministère français de l'Agriculture et des lignes directrices de l'UE. 1. Préparer une unique cellule Plate Tri 96 puits <ol><li> Préparer préamplification mélange dans un tube de 1,5 ml par addition de 5,0 pi de tampon spécifique rétrotranscription, 1,3 ul de faible teneur en acide éthylènediaminetétra-tampon (EDTA) TE (solution à 10 mM de TE, pH 8, et d'une solution 0,1 mM d'EDTA, 0,2 uM filtrée ) et 0,2 ul d'ADN polymerase Taq par puits (figure 1a). </li><li> Sur une plaque à 96 puits, distribuer 6,5 pi de mélange de pré-amplification dans chaque puits (à 48 puits). Cette plaque est la seule cellule plaque de tri de 96 puits. REMARQUE: L'utilisation d'une pipette électronique est recommandé pour ce protocole. Il permet des mesures de volume précis et reproductibles et un gain de temps. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig1.jpg"> (A) Sur la seule cellule à 96 puits plaque de triage, le mélange de pré-amplification est distribué en premier, suivi par le mélange d'essai à 0,2x. (B) Le dossier de chaque position à cellule unique doit être conservé sur une feuille de calcul. Un puits sans cellule est appelée "pas d'entrée" bien et peut être utilisé comme témoin. Deux rangées peuvent être épargnés pour contrôler l' efficacité primaire avec de l' ADNc (dilution des dilutions successives d' un sur dix de l'équivalent de 10 5 cellules à une cellule). (C) Sur la plaque de dosage à 96 puits, le réactif test de chargement est distribué en premier, suivi par l'addition des amorces. Ne pas oublier de garder une mise en page de chaque position primaire. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858fig1large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="3"><li> Préparer un mélange d'essai de 0,2 x dans un tube de 1,5 ml par addition de 1,4 pi de chaque amorce ( les amorces 20x, jusqu'à 48 sondes différentes, voir le tableau 1). Ajuster le volume final à 140 ul avec du tampon TE faible EDTA. </li><li> Distribuer 2,5 ul du mélange de dosage de 0,2 x à 48 puits dans la plaque à 96 puits à cellule unique de tri contenant le mélange de pré-amplification. NOTE: Le volume final dans chaque puits de la plaque d'échantillon de 96 puits devrait être de 9 pi. </li><li> Sceller la plaque avec un film de couverture. Vortex la plaque et le tourner vers le bas à 280 xg pendant 45 sec. Rangez la cellule unique plaque de tri de 96 puits à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement. </li></ol> 2. Single cellulaire Dissociation <ol><li> L' utilisation d' un système de distribution de CO 2, euthanasier une souris par l' hypoxie. Fixer la souris sur une plaque de dissection et ouvrir la cavité péritonéale longitudinalement avec des ciseaux. </li><li> Récupérez ILC du foie. <ol><li> Avant l'isolement du foie, rincer la livcellules er-circulation. <ol><li> Pour faire ressortir la veine porte, déplacer le petit et le gros intestin vers le côté gauche de la souris; la veine porte apparaît comme la plus grande veine dans la cavité péritonéale. </li><li> Avec une seringue de 10 ml et une aiguille de 0,45 mm, rincer le foie avec un milieu de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à travers la veine porte. Pour faciliter le rinçage du foie, couper l'artère gastrique avec des ciseaux. </li><li> Pour enlever la vésicule biliaire, pincer la base de la vésicule biliaire avec une pince et le séparer du foie avec des ciseaux. </li><li> Afin d'isoler le foie, pincer la base du foie avec une pince, et en utilisant des ciseaux, séparer le foie du reste de la cavité péritonéale. </li><li> Transférer le foie dans un tube de potier avec 5 ml de rpmi (RPMI) sériques de 2% de veau foetal (FCS). </li></ol></li></ol></li><li> Dissocier le foie avec une dissociation mécanique à l'aide d'un pilon. Transférer le milieu dans un tube de 15 ml. Amener le volume totalà 14 ml avec du RPMI 2% de FCS. Laisser la suspension de cellules sur la glace pendant 15-20 min pour décanter les hépatocytes. </li><li> Récupérer le surnageant (sans les hépatocytes) dans un nouveau tube de 15 ml en utilisant une pipette de 1 ml (12 ml de surnageant peuvent être attendus). Isoler à 120 xg pendant 7 minutes à 10 ° C. Jeter le surnageant après centrifugation. </li><li> Remettre en suspension le culot obtenu à l' étape 2.4 dans 14 ml de milieu de gradient de densité (par exemple de Percoll 40%). Isoler à 600 xg pendant 20 min à 20 ° C. Retirer le surnageant par aspiration. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 ml d'acétate de potassium (ACK). Laisser à température ambiante pendant 1 min. Au bout de 1 min, porter le volume total à 14 ml avec de l'équilibre salé solution de Hank (HBSS), 2% de FCS. Isoler à 120 xg pendant 7 minutes à 10 ° C. Jeter le surnageant. </li><li> Colorer les cellules. <ol><li> Reprendre le culot dans 300 ul de mélange d'anticorps biotinylé (voir le tableau Matériaux; ajouter tous les anticorps biotinylés mentionnented) et transférer les cellules dans 1,5 ml tube. Laissez-le dans l'obscurité pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Porter le volume total à 1 ml avec du HBSS 2% de FCS. Isoler à 120 xg pendant 7 minutes à 10 ° C. Reprendre le culot dans 300 ul de mélange d'anticorps fluorochrome couplé et conjugué à un fluorochrome streptavidine (voir le tableau des matériaux, ajouter tous les anticorps fluorochrome couplé mentionnés). Laissez-le dans l'obscurité pendant 20 min à 4 ° C. </li></ol></li><li> Porter le volume total à 1 ml avec du HBSS 2% de FCS. Isoler à 120 xg pendant 7 minutes à 10 ° C. Eliminer le surnageant à l'aide d'une pipette de 1 ml. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de HBSS et l'iodure de propidium (Pi; 1: 4000). REMARQUE: Lorsque vous utilisez les marqueurs de cellules de surface ILC largement exprimées, 3 populations sont définies: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + et NKp46 - IL-7Rα +. Toutes les populations triées sont lignée - CD3 - CD4 - CD45.2 +. </li></ol> 3. Single-cellule Fluorescence-tri cellulaire activé (FACS) <ol><li> Utilisez FACS pour trier les cellules individuelles 13. REMARQUE: Différents types de cellules peuvent être triés sur le même 96 puits à cellule unique plaque de tri (Figure 2). <ol><li> Utiliser FACS pour trier une cellule par puits contenant le mélange de dosage de 0,2 x et le mélange de pré-amplification de la cellule unique plaque de triage à 96 puits. Utiliser une cellule unique plaque de tri de 96 puits fraîchement préparé ou dégeler si stocké à -20 ° C. <ol><li> Mettre une plaque de 96 puits scellée sur le support de plaque FACS. Utiliser une plaque à 96 puits vide comme un test. Positionner la plaque avec le A1-bien sur la gauche et vers l'expérimentateur. </li><li> Ajuster le support de plaque afin d'obtenir une chute du centre du puits A1 avec des billes de vérification. </li><li> Répétez l'étape 3.1.1.2 avec tous les puits dans la ligne A. </li><li> Retirez le joint de la plaque à 96 puits et trier 100 perles de vérification par puits. Vérifiez dla formation de ROP dans le centre du puits. </li><li> Lorsqu'il est correctement ajusté, placez le 96 puits à cellule unique plaque de tri sur le support de plaque. Dessinez le plan de plaque et trier 1 cellule par puits. NOTE: Le positionnement correct de chaque cellule sur la plaque de tri de 96 puits à cellule unique est essentielle. Une disposition de la plaque doit être conservée sur un logiciel de tableur. La disposition de la plaque sera utilisée dans les prochaines étapes (figure 1b) 14. Laissez un puits contenant mélange d'essai de 0,2x et de pré-amplification mélange sur la plaque de l'échantillon de 96 puits sans cellules. Ce puits est utilisé comme témoin non-entrée. Laisser deux rangées de 6 puits pour une dilution d'ADNc. Ces puits sont utilisés comme témoins pour l' efficacité primaire (figure 1b). </li><li> Rangez la cellule unique plaque de tri de 96 puits à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Pré-amplification <ol><li> Utilisez une seule plaque-tri cellulaire obt frais ou décongelé 96 puitsained à l'étape 3.1.1.6. Vortex la plaque et le tourner vers le bas (280 g pendant 45 sec). </li><li> Placez le 96 puits à cellule unique plaque de tri sur le thermocycleur. Effectuer une transcription inverse et de préamplification selon le programme indiqué dans la figure 3 et le tableau 2. </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig3.jpg"> Figure 3: programme de pré-amplification. Afin d'obtenir suffisamment de matériel, de pré-amplification de gènes cibles spécifiques sur des cellules individuelles triées est nécessaire. La cellule unique plaque de tri de 96 puits est chargé sur un thermocycleur à suivre le programme de pré-amplification. Les produits de pré-amplification sont ensuite dilués avec du tampon TE faible EDTA et peuvent être utilisées immédiatement ou congelées à -20 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858fig3large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="3"><li> Diluer le pré-amplilified échantillons par addition de 36 ul de tampon TE faible EDTA dans chaque puits. </li><li> Sceller la plaque avec un film de couverture. Vortex la plaque et le tourner vers le bas (280 g pendant 45 secondes). Rangez le 96 puits à cellule unique plaque pré-amplifiée, le tri à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement. </li></ol> 5. Préparer une plaque d'échantillon de 96 puits <ol><li> Préparer 191 pi de mélange maître en ajoutant 175 pi de mélange maître qPCR et 17,5 pi de réactif de chargement d'échantillon. </li><li> Sur une nouvelle plaque de 96 puits, distribuer 3,6 pi de mélange maître dans chaque puits (jusqu'à 48 puits). Ceci est la plaque d'échantillons à 96 puits. </li><li> Transférer 2,9 ul d'ADNc pré-amplifié à partir de la plaque d'échantillon de 96 puits à la nouvelle plaque de 96 puits. Gardez la même position pour chaque échantillon entre la plaque de tri cellulaire 96 unique et la plaque d'échantillon de 96 puits. </li><li> Sceller la plaque avec un film de couverture. Vortex la plaque et le tourner vers le bas (280 g pendant 45 sec). Placez la nouvelle plaque de 96 puits sur la glace à l'abri de la lumière. Rangez le 96 puits sample plaque à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement. </li></ol> 6. Préparer une plaque de dosage à 96 puits <ol><li> Sur une nouvelle plaque de 96 puits, 3 ul de distribuer le réactif test de chargement dans chaque puits (à 48 puits). Cette plaque est appelée la plaque de dosage à 96 puits. </li><li> Ajouter 3 ul d'amorces à chaque puits. Gardez une mise en page sur un logiciel de feuille de calcul (figure 1c et le tableau 1; utiliser toutes les amorces énumérées dans le tableau 1). Le bon positionnement de chaque amorce sur la plaque d'essai de 96 puits est essentiel pour les prochaines plusieurs étapes. <ol><li> Si le nombre d'échantillons est inférieur à 48, ajouter de l'eau au lieu d'amorces pour les puits non utilisés. </li></ol></li><li> Sceller la plaque avec un film de couverture. Vortex la plaque et le tourner vers le bas (280 g pendant 45 sec). Rangez la plaque essai de 96 puits à -20 ° C ou de l'utiliser immédiatement. NOTE: Pour éviter la congélation et la décongélation répétées des amorces, distribuer les amorces pour le mélange de pré-amplification et pour le 96-well plaque d'essai en même temps. </li></ol> 7. unicellulaire Gene expression Chip <ol><li> Placez le circuit microfluidique intégré (IFC) sur le banc et vérifier les valves en utilisant la seringue plafonné. Ouvrez la seringue, le placer perpendiculairement à la valve, et appuyez fermement. Le joint torique doit se déplacer. Remplir la puce avec le fluide de la ligne de commande (0,3 ml de tuberculine). </li><li> Répétez l'étape 7.1 avec la deuxième vanne. REMARQUE: Aucun liquide ne doit être déversé sur la puce. </li><li> Retirez le film bleu du fond de la puce. Chargez la puce dans le contrôleur IFC. Sur l'écran du contrôleur IFC, sélectionnez "PRIME", puis "Exécuter". Le contrôle des lignes microfluidiques dure 10 min. </li><li> Ejecter la puce et re-sceller le film bleu sur le fond de la puce. </li></ol><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig4.jpg"> Figure 4: une seule cellule multiplex expression génique puce chargement. Ces étapes nécessitent gprécision reat, en particulier lors du transfert de la plaque de 96 puits au multiplex puce gène d'expression unique cellule. Pour éviter les erreurs de chargement et mauvais placement, il est fortement recommandé de travailler de manière séquentielle. Le volume prélevé pour chaque transfert doit être contrôlée pendant le processus de pipetage. Enfin, il est important d'éviter les bulles et pour les enlever en cas de formation. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858figfourlarge.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <ol start="5"><li> À l'aide d'une pipette à 8 canaux, de transfert 5 ul de la plaque de dosage à 96 puits sur le côté A1 (côté gauche) de la puce. Remplir la partie gauche de la puce, comme il est indiqué sur la figure 4. Veillez à toujours tirer le même volume dans les conseils. <ol><li> Ne pas créer de bulles. Si des bulles apparaissent, retirez-les en utilisant 10 conseils ul. Modifier conseils pour chaque puits de la puce. </li></ol></li><li> Répétez l'étape 7.5 sur le côté droit of la puce en utilisant 5 ul de la plaque d'échantillon de 96 puits. </li><li> Retirez le film bleu du fond de la puce. Chargez la puce dans le contrôleur IFC. Sur l'écran du contrôleur IFC, sélectionnez "RUN SCRIPT", puis "Exécuter". Le chargement des lignes fluidiques dure 45 min. </li><li> Ejecter la puce et re-sceller le film bleu sur le fond de la puce. </li></ol> 8. Exécutez la puce <ol><li> Sur l'ordinateur qPCR microfluidique, sélectionnez le logiciel "Data Collection". Une fois qu'il commence, sélectionnez "Nouveau Exécuter". </li><li> Sélectionnez "Ejecter", retirer le film bleu du fond de la puce, et charger la puce. Placez la puce pour obtenir le puits A1 sur la gauche et vers l'expérimentateur. </li><li> Le "cadre du projet", sélectionnez "None" puis "Suivant". </li><li> Sélectionnez "run New chip", "répertoire Nouvelle puce" (créer un dossier pour l'expérience), et «Suivant». </li><li> Sur "l'expression de gènes", sélectionnez "; Référence passive = ROX "(carboxy-x-rhodamine) et" sonde unique; "sélectionner le filtre approprié selon les amorces Sélectionnez." Suivant ". </li><li> Sélectionnez "Parcourir" et sélectionnez le programme approprié en fonction des amorces utilisées. NOTE: "Default-10min-Hotstart.pcl" est le programme le plus couramment utilisé pour les multiplex à cellule unique RT-qPCR. </li><li> Sélectionnez "Start Run". La réaction dure environ 90 min. </li><li> Une fois terminé, sélectionnez "Ejecter-Done." </li></ol> Analyse 9. Données <ol><li> Ouvrez le logiciel "Real-Time PCR Analyse", sélectionnez "Fichier" et "Ouvrir", trouver le dossier d'expérience, et sélectionnez "fichier ChipRun.bml." </li><li> Cliquez sur "Analyse de la vue", "Résultats Table" et "Heat Map View»; boîtes marquées d'un "X" sont en dessous du niveau de détection de seuil et / ou eu de mauvaises courbes d'amplification. </li><li> Nommez les échantillons. Allez dans "Sample Setup" et select "New SBS 96." Cliquez sur "Mapping" et sélectionnez "..." Copier et coller la conception échantillon de mise en page à partir du logiciel de tableur. Définir la mise en page collé comme "Nom de l'échantillon." </li><li> Nommez les essais. Répétez l'étape 9.3 avec les noms d'amorces dans «Configuration du détecteur." Définir la mise en page collé comme «Detector Nom." </li><li> Cliquez sur "vue de l'analyse" et "Analyser"; les noms des échantillons et l' amorce seront attribués automatiquement aux échantillons et les amorces (figure 7). </li><li> Calculer Ct, Delta Ct, et Pliez Change pour chaque échantillon. Utilisez un gène de ménage comme un contrôle interne (ici, Gapdh): ACt = échantillon Ct - contrôle interne Ct Pliez Change = 2 - (contrôle ΔCtsample-ΔCtnegative) <ol><li> Cliquez sur "Configuration du détecteur" et sélectionnez le puits sans contrôle d'entrée (utilisez le gène de ménage comme un contrôle interne pour normaliser l'expression des gènes). Sélectionnez "Editor "," définir la référence, "et" Mise à jour ". </li><li> Sélectionnez tous les puits à laquelle le contrôle interne défini ci-dessus sera appliqué. Sélectionnez "Editor" et "définir comme test." Sélectionnez un gène de référence approprié et cliquez sur "Update". </li><li> Sélectionnez "Sample Setup" pour sélectionner ainsi le contrôle négatif. Sélectionnez "Editor" et définir "Référence". Cliquez sur "Update". </li><li> Sélectionnez "Analyse de la vue" et "Analyser"; le Delta Ct et le changement Fold seront automatiquement calculés. </li></ol></li><li> Exporter les données. Sélectionnez "Fichier" et "Exporter, enregistrer sous" Tableau Résultats ", sélectionnez le dossier de destination, et cliquez sur" Enregistrer "et" Quitter ". </li><li> Répétez l'étape 9.7, mais au lieu de "Résultats de la table," Enregistrer sous "Résultats HeatMap." </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit comment obtenir des informations d&#39;expression génique exhaustive au niveau clonal. Ici, nous avons étudié le foie ILC compartiment hétérogénéité. Après un tri à cellule unique des différentes populations de la CIT (basées sur des marqueurs de surface ILC largement exprimés), les échantillons ont été pré-amplifiées pour les gènes présélectionnés spécifiques. Ensuite, l&#39;ADNc obtenu et des amorces ont été chargées sur une RT-qPCR puce microfluidique multiplex. Enfin, nous avons obtenu l&#39;expr...

Au cours des dernières années, les cellules lymphoïdes innées (de ILC) ont été de plus en plus étudié. En dépit de leur manque de récepteurs spécifiques d&#39;un antigène, ils appartiennent à la lignée lymphoïde et représentent des sentinelles importantes pour l&#39;homéostasie tissulaire et une inflammation. CVA sont actuellement classés en trois groupes en fonction de leur expression de combinaisons spécifiques de facteurs de transcription ainsi que sur leur capacité à produire des cytokines 6, 7. ILC contribuent à de nombreuses situations homéostatiques et physiopathologiques dans divers organes via la production de cytokines spécifiques 8, 9. Pour être en mesure de comprendre le rôle de ces cellules, il est important de déterminer les différentes sous-populations de la CDI par organe et d&#39;identifier leurs relations de développement. En outre, des phénomènes de plasticité entre les différents sous-ensembles ont été liés. En étudiant l&#39;hétérogénéitédes cellules présentes dans un organe, il est possible de délimiter leur stade de maturation et de distinguer leurs fonctions spécifiques. Pour illustrer la technique de multiplexage à cellule unique RT-qPCR, ILC hépatiques ont été choisis, avec un accent particulier sur leur hétérogénéité au sein du même groupe CIT (type 1 ILC) 10. Tout d&#39;abord, grâce à l&#39;utilisation de la cytométrie de flux, trois populations distinctes de la CDI ont été caractérisées dans le foie. Groupe 1 CIT représente environ 80% des effecteurs innés, tandis que les deux autres populations sont les populations ILC hépatiques rares (moins de 5% des effecteurs innés). Ces populations ont été triés à l&#39;aide largement exprimées marqueurs de surface cellulaire des populations ILC. En conséquence, les populations triées ILC dans le foie semblent largement semblables l&#39;un à l&#39;autre. Multiplex unique cellule RT-qPCR a émergé comme l&#39; une des meilleures techniques pour enquêter rapidement sur l&#39;hétérogénéité de ces populations 11 </sup&gt;. Deux caractéristiques sont déterminées en prenant avantage du multiplex unicellulaire technique de RT-PCR quantitative. Tout d&#39;abord, en regardant au niveau clonal, il est possible de récupérer l&#39;expression génique spécifique d&#39;une cellule pour une comparaison entre les cellules qui présentent apparemment des stades de développement similaires. Puis, en regardant une combinaison pré-sélectionnée de l&#39;expression des gènes, nous allons déterminer de nouvelles signatures de gènes basée sur les profils d&#39;expression génique simultanées à un point de temps. Ces éléments permettent la collecte d&#39;une grande variété de données d&#39;expression d&#39;un grand nombre de cellules, même sur des populations rares, car la technique est réalisée au niveau clonal. Ainsi, l&#39;hétérogénéité ILC dans le foie peut être évaluée de manière adéquate. Ensuite, en triant toutes les cellules avec un phénotype ILC global, un large aperçu de l&#39;expression multiple gène du foie populations ILC est obtenue, même si elles représentent des populations extrêmement rares. Une puce à base de microfluidique permet l&#39;expérimentation de mêmeune petite quantité de matériau cellulaire. En conséquence, les profils d&#39;expression génétique des populations de cellules rares peuvent être obtenus. Grâce à un logiciel en ligne de signature génétique d&#39;analyse, les grappes de la population cellulaire et les relations cellulaires potentiels peut être étudiée. Par conséquent, les tests fonctionnels peuvent être effectués pour valider les données de classification au niveau in vivo. Des dizaines d&#39;expressions de gènes pourraient être évalués de manière concomitante sur des centaines ou des cellules plus simples sur la même puce 3, 11, 12. Conception de l&#39;essai est la partie la plus longue et la plus importante de l&#39;expérience. La détermination des gènes pertinents à l&#39;hypothèse à tester est essentielle pour obtenir des résultats pertinents. Deuxièmement, le contrôle interne (tels que des marqueurs de surface connus utilisés pour le tri) et des contrôles spécifiques sont nécessaires. Ceci est crucial pour tester la spécificité amorce d&#39;amplification, l&#39;efficacité de l&#39;amplification, et til absence de concurrence de l&#39;amorce. Par conséquent, en travaillant avec une seule cellule multiplex RT-PCR quantitative est une technique qui fait gagner du temps, car l&#39;expression de multiples gènes d&#39;une cellule est évaluée en même temps. En utilisant la même puce et la combinaison de réactifs pour toutes les cellules limite les éventuelles erreurs de manipulation et permet la reproductibilité entre les échantillons. Au total, les différents aspects de multiplex à cellule unique RT-qPCR permet la production de résultats très fiables au niveau clonal, avec un grand niveau de sensibilité pour une grande variété d&#39;échantillons et de gènes. Les résultats obtenus offrent des données puissants et robustes pour les tests biostatistiques. Ceci peut être réalisé en raison de l&#39;aspect microfluidique du procédé, ce qui permet de travailler sur de très petites quantités de matériau et conduit à des résultats exhaustifs. Enfin, en utilisant un logiciel en ligne, il est possible de comparer les populations désirées.

<table><tbody><tr><td>Cells Direct One Step qRT-PCR kit</td><td>Applied Biosystems&nbsp ;</td><td>11753100</td><td>Kit de détection de sonde d’amorçage. Contient 2x mélange réactionnel, enzyme SSIII Platinium.</td></tr><tr><td>Low TE EDTA Buffer</td><td>Affymetrix</td><td>75793 100ML</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 96 puits</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AB 1100</td><td>Plaques 96 puits adaptées au tri cellulaire et au thermocyclage Film</td></tr><tr><td>de couverture</td><td>Dominique Dutscher</td><td>106570</td><td>Film de couverture en aluminium ; éviter la contamination et l’évaporation</td></tr><tr><td>Actb</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00607939_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Aes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01148854_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Ahr</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00478932_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Bcl2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00477631_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>c-myc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00487804_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Cbfb</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01251026_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Cd27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01185212_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Cd49a</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01306375_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>CD49b</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00434371_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Cxcr5</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00432086_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Cxcr6</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm02620517_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Eomes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01351985_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Ets1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01175819_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Foxo1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00490672_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Gapdh</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm03302249_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Gata3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00484683_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Gm-csf</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01136644_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Hes1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01342805_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00446968_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Id2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01293217_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Il-12rb2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00711781_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Il-18r1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00515178_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Il-1rl1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00434237_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Il-22</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm001226722_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Il-23r</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00519943_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Il-2ra</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01340213_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Il-2rb</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01195267_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>IL-7r</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00434295_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Klr5</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm04207528_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Lef1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00550265_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Ncr1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01337324_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Nfil3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01339838_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Notch1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00435249_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Notch2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00803069_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Rora</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01173766_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Rorc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01261022_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Runx3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00490666_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Tbx21</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01299453_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Tcf3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01175588_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Tcf7</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00493445_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Tle1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00495643_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Tle3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00437097_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Tsc22d3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01306210_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Tnfrsf11a</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00437132_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Tox</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00455231_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Zbtb16</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01176868_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>Zbtb7b</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00784709_s1</td><td>20x amorce</td></tr><tr><td>qPCR Master mix&nbsp ;</td><td>Applied BioSystems</td><td>P/N 4304437</td><td></td></tr><tr><td>2x Assay Loading Reagent</td><td>Fluidigm</td><td>P/N 85000736</td><td>Dosage spécifique du milieu à charge dans une puce microfluidique multiplex RT-qPCR.&nbsp ;</td></tr><tr><td>2x Sample Loading Reagent</td><td>Fluidigm</td><td>P/N 85000735</td><td>Milieu de densité spécifique pour charger des échantillons dans une puce microfluidique multiplex RT-qPCR.&nbsp ;</td></tr><tr><td>48.48 multiplex RT qPCR puce microfluidique</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-48.48</td><td>48.48 Dynamic Array IFC pour l’expression des gènes ; puce pour réaction RT-qPCR multiplexe à cellule unique</td></tr><tr><td>48.48 multiplex RT qPCR contrôleur de puce microfluidique</td><td>Fluidigm</td><td>89000020</td><td>48.48 Contrôleur IFC ; contrôle de la puce système fluidique interne, chargement des échantillons et dosages dans des chambres de réaction</td></tr><tr><td>multiplexe RT qPCR thermocycleur microfluidique</td><td>Fluidigm</td><td>GE48.48</td><td>48.48 Dynamic Array IFC thermocycleur à 96</td></tr><tr><td>puits</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AB 1100</td><td>Plaques 96 puits adaptées au tri cellulaire et au thermocyclage</td></tr><tr><td>Souris C57Bl/6</td><td>Janvier</td><td>C57Bl/6 miceJ@RJ</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309639</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14040174</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>24020133</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>CVFSVF000U</td><td>Eurobio Abcys</td><td>Standard sérum de veau fœtal</td></tr><tr><td>Tube Potter</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube de 15 ml</td><td>Tube de Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>de 1,5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Machine FACS</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75004538</td><td></td></tr><tr><td>1 000 & micro ; l conseils</td><td>Fisher Scientific</td><td>10313272</td><td></td></tr><tr><td>P1000&nbsp ;</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Tube Facs</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 Anticorps de souris à la biotine</td><td>Sony</td><td>1103520</td><td>anticorps</td></tr><tr><td>anti-CD19 Anticorps de souris à la biotine</td><td>Sony</td><td>1177520</td><td>anticorps</td></tr><tr><td>anti-TCRab Anticorps de souris à la biotine BioLegend</td><td></td><td>Anticorps</td> de <td>lignée</td>109204</tr><tr><td>anti-TCRgd Anticorps de souris à la biotine</td><td>BD Biosciences</td><td>Anticorps de 553176</td><td>lignée</td></tr><tr><td>anti-Ter119 Anticorps de souris à la biotine</td><td>BD Biosciences</td><td>Anticorps de 553672</td><td>lignée</td></tr><tr><td>anti-Gr1 Anticorps de souris à la biotine</td><td>BD Biosciences</td><td>Anticorps de 553125</td><td>lignée</td></tr><tr><td>anti-CD45.2 Anticorps de souris PerCPCy5.5</td><td>BioLegend</td><td>109828</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-IL7ra PeCy7 anticorps</td><td>anti-souris ebioSciences</td><td>25-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD3 BV510 anticorps anti-souris</td><td>BD Biosciences</td><td>563024</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD4 BV786 anticorps murin</td><td>BD Biosciences</td><td>563727</td><td></td></tr><tr><td>anti-NKp46 PE anticorps de souris</td><td>ebioSciences</td><td>12-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sony</td><td>2626025</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Pipette électronique</td><td>Eppendorf</td><td>4986000017</td><td></td></tr><tr><td>Combitips 0,1 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS+</td><td></td></tr><tr><td>Accudrop</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td>billes de vérification pour FACS</td></tr></tbody></table>

unicellulaire gene expression utilisant multiplex rt-qpcr à caractériser hétérogénéité des rares populations lymphoïdes

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

L&#39;expression des gènes hétérogénéité est une caractéristique intéressante pour enquêter dans les populations lymphoïdes. L&#39;expression des gènes dans ces cellules varie au cours de l&#39;activation cellulaire, le stress, ou la stimulation. L&#39; expression du gène de multiplexage unicellulaire permet l&#39;évaluation simultanée de plusieurs dizaines de gènes 1, 2, 3. Au niveau d&#39;une seule cellule, l&#39; expression des gènes multiplex détermine la population hétérogénéité 4, 5. Il permet la distinction de l&#39;hétérogénéité de la population en déterminant à la fois le mélange probable de stades précurseurs diverses entre les cellules matures et aussi la diversité des réponses cellulaires à des stimuli. Cellules lymphoïdes innées (CIT) ont récemment été décrit comme une population de effecteurs innées de la réponse immunitaire 6, 7. Dans ce protocole, l&#39;hétérogénéité des cellules de la CIT, ilcompartiment Patic est étudiée au cours de l&#39;homéostasie. Actuellement, la technique la plus largement utilisée pour évaluer l&#39;expression du gène est RT-qPCR. Cette expression génétique méthode mesure seul gène à la fois. En outre, cette méthode ne permet pas d&#39;estimer l&#39;hétérogénéité de l&#39;expression génique, étant donné que plusieurs cellules sont nécessaires pour un test. Cela conduit à la mesure de l&#39;expression du gène moyen de la population. Lors de l&#39;évaluation grand nombre de gènes, RT-qPCR devient une durée de vie, et la méthode d&#39;échantillonnage consommant reagent-. Par conséquent, les compromis limitent le nombre de gènes ou de populations de cellules qui peuvent être évalués, ce qui augmente le risque de manquer l&#39;image globale. Ce mémoire décrit multiplex unicellulaire par RT-PCR quantitative peut être utilisée pour surmonter ces limitations. Cette technique a bénéficié de récentes avancées technologiques microfluidique 1, 2. Les réactions qui se produisent dans les puces multiplex RT-qPCR ne sont pas excEED niveau-nanolitre. Par conséquent, l&#39;expression des gènes de cellules isolées, ainsi que l&#39;expression des gènes multiples simultanées peuvent être effectuées dans un reagent-, échantillon-, et d&#39;une manière rentable. Il est possible de tester le gène cellulaire signature hétérogénéité au niveau clonal entre les sous - ensembles de cellules dans une population à différents stades de développement ou dans des conditions différentes de 4, 5. Travailler sur les populations rares avec un grand nombre de conditions au niveau d&#39;une seule cellule est plus une restriction.

populations lymphoïdes présentent une grande diversité dans l'expression des gènes. Dans ce protocole, le foie compartiment ILC hétérogénéité a été étudiée en utilisant une seule cellule multiplex RT-qPCR expression génique. Contrairement à d'autres techniques d'expression génique, multiplex unicellulaire RT-qPCR expression génique permet de travailler sur plusieurs populations, même les plus rares, dans le même temps. Cette spécificité, associée à une sensibilité élevée au niveau clonal...

Ce protocole décrit comment évaluer l&#39;expression d&#39;un large éventail de gènes au niveau clonal. Unicellulaire RT-qPCR produit des résultats très fiables avec une forte sensibilité pour des centaines d&#39;échantillons et les gènes.

Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

L’objectif global de cette expérience est d’observer l’expression de plusieurs gènes dans des cellules uniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que l’hétérogénéité des signatures moléculaires au sein d’une population cellulaire ou une signature moléculaire rare. Le principal avantage de cette technique est que des signatures moléculaires spécifiques avec au moins 48 gènes différents peuvent être évaluées dans plusieurs cellules en même temps.Commencez cette procédure en préparant un mélange de préamplification pour 48 réactions dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez au tube 240 microlitres de tampon de rétrotranscription spécifique, 62,4 microlitres de tampon TE à faible teneur en EDTA et 9,6 microlitres d’ADN polymérase Taq. À l’aide d’une pipette électronique, répartissez 6,5 microlitres du mélange de préamplification dans chacun des 48 puits d’une plaque unicellulaire de 96 puits.Ensuite, préparez un mélange de dosage 0,2x dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter au tube 1,4 microlitres de chaque apprêt. Ajustez le volume final à 140 microlitres avec un tampon à faible teneur en EDTA TE.À l’aide d’une pipette électronique, répartissez 2,5 microlitres du mélange de dosage 0,2x dans les 48 puits de la plaque de tri unicellulaire de 96 puits, contenant le mélange de préamplification. Scellez la plaque avec un film de couverture. Tourbillonnez la plaque et faites-la tourner à 280 fois g pendant une minute.Les cellules lymphoïdes innées hépatiques uniques, ou ILC, seront triées par tri cellulaire activé par fluorescence. Commencez cette procédure en utilisant une plaque vide de 96 puits comme test. Positionnez la plaque d’essai sur le support de plaque avec le puits a à gauche et vers l’expérimentateur.Ajustez le support de plaque pour obtenir une chute au centre d’un puits avec des billes de vérification. Lorsqu’elle est correctement réglée, placez la plaque de tri unicellulaire à 96 puits contenant le mélange de test et la préamplification sur le support de plaque. Dessinez la disposition de la plaque et triez une cellule par puits de la population fermée.Le bon positionnement de chaque cellule sur la plaque de tri à cellule unique de 96 puits est essentiel, et la disposition de la plaque doit être conservée sur un tableur. Laissez un puits contenant un mélange de test 0,2x et un mélange de préamplification sans cellules, comme contrôle sans entrée. Si vous le souhaitez, laissez deux rangées de six puits pour la dilution de l’ADNc comme contrôles de l’efficacité de l’amorce.Immédiatement après le tri à cellule unique, vortex et rotation vers le bas de la plaque de tri à cellule unique à 96 puits. Placez la plaque dans le thermocycleur. Effectuez la transcription inverse et la préamplification comme indiqué.La préamplification de gènes cibles spécifiques sur des cellules uniques triées est nécessaire afin d’avoir suffisamment de matériel. Diluez les échantillons pré-amplifiés en ajoutant 36 microlitres de tampon TE à faible teneur en EDTA dans chaque puits. Pour commencer cette procédure, préparez 191 microlitres d’un Master Mix en pipetant 175 microlitres d’un Master Mix qPCR et 17,5 microlitres du réactif de chargement de l’échantillon dans un tube de 1,5 millilitre.Sur une nouvelle plaque de 96 puits, répartissez 3,6 microlitres du Master Mix dans chacun des 48 puits. Il s’agit de la plaque d’échantillonnage à 96 puits. Transférez 2,9 microlitres d’ADNc préamplifié de la plaque de tri unicellulaire à 96 puits vers la nouvelle plaque d’échantillon à 96 puits, en gardant la même position pour chaque échantillon entre les deux plaques.Préparez une plaque d’analyse à 96 puits en distribuant trois microlitres de réactif de chargement d’essai à chacun des 48 puits sur une nouvelle plaque à 96 puits. Ajoutez trois microlitres d’amorces dans chaque puits. Le bon positionnement de chaque amorce dans la plaque de dosage à 96 puits est essentiel.Conservez un plan de plaque sur un tableur. Pour commencer cette procédure, placez le circuit microfluidique intégré, ou IFC, sur la paillasse et vérifiez les vannes à l’aide d’une seringue. Retirez le capuchon de la seringue, placez-la perpendiculairement à une valve et appuyez fermement.Le joint torique doit bouger. Remplissez la puce avec le liquide de la ligne de contrôle. Après avoir répété les étapes précédentes avec la deuxième vanne, retirez le film noir du bas de la puce.Chargez la puce dans le contrôleur IFC. Sur l’écran du contrôleur IFC, sélectionnez prime, puis exécutez. Ensuite, éjectez la puce et refermez le film noir au bas de la puce.À l’aide d’une pipette à huit canaux, transférez cinq microlitres de la plaque de dosage à 96 puits vers le côté gauche de la puce. Changez les pointes pour chaque puits de la puce. Évitez de créer des bulles, et si des bulles apparaissent, utilisez des embouts de 10 microlitres pour les éliminer.Remplissez le côté gauche de la puce comme indiqué. De la même manière, remplissez le côté droit de la puce à l’aide de cinq microlitres de la plaque d’échantillon à 96 puits. Pour le succès de cette expérience, il est essentiel que la puce IFC soit correctement remplie pour un chargement correct dans le contrôleur IFC.Retirez le film bleu du bas de la puce et chargez-la dans le contrôleur IFC. Sur l’écran du contrôleur IFC, sélectionnez load mix, puis exécutez. Une fois terminé, éjectez la puce et refermez le film bleu au bas de la puce.Pour faire fonctionner la puce, sélectionnez d’abord le logiciel de collecte de données sur l’ordinateur qPCR microfluidique. Une fois qu’il démarre, sélectionnez nouvelle exécution. Sélectionnez Éjecter et charger la puce.Après avoir configuré le logiciel comme décrit dans le protocole texte, sélectionnez Démarrer l’exécution. La réaction prendra environ 90 minutes. Pour commencer l’analyse des données, ouvrez le logiciel d’analyse PCR en temps réel, sélectionnez fichier, puis ouvrez, recherchez le dossier de l’expérience et sélectionnez chip run point b m un fichier.Cliquez sur la vue d’analyse, le tableau des résultats et la vue de la carte thermique. Les cases marquées d’un x sont en dessous du niveau de détection de seuil et/ou avaient de mauvaises courbes d’amplification. Nommez les échantillons.Allez dans la configuration de l’échantillon et sélectionnez nouveau SBS 96. Cliquez sur mappage et sélectionnez la disposition de l’échantillon selon la disposition de la plaque d’échantillonnage à 96 puits. Copiez et collez l’exemple de mise en page à partir du tableur.Définissez la mise en page collée comme nom d’échantillon. Utilisez la même procédure pour nommer les dosages. Entrez les noms d’amorce dans la configuration du détecteur et définissez la disposition collée comme nom de détecteur.Cliquez sur la vue d’analyse et analysez. Sélectionnez un fichier, exportez et enregistrez en tant que résultats de carte thermique. À l’aide de la cytométrie en flux, les populations hépatiques d’ILC ont été triées en fonction de marqueurs ILC largement exprimés, et trois populations distinctes ont été définies.Une puce d’expression génique multiplex à cellule unique correctement chargée doit apparaître avec des lignes droites et des rangées, chaque chambre de réaction étant remplie et dans la même dimension. Une puce mal chargée aura des lignes vides et des rangées de chambres de réaction, ainsi que des lignes de pliage. Cette figure de fluorescéine amidite d’une puce correctement chargée montre des différences de luminosité de la chambre de réaction apparaissant après quelques cycles.Les chambres de réaction avec un signal d’amplification apparaissent plus lumineuses que les chambres de réaction avec des signaux d’amplification faibles ou nuls. Après un tri cellulaire, une préamplification et un chargement appropriés, la population ILC est apparue hétérogène pour l’expression génique dans le foie de souris adultes de type sauvage. Sur la gauche se trouve une carte thermique sans modifications.Sur la droite se trouve la carte thermique modifiée obtenue après la définition de l’échantillon et du nom du test. À l’aide d’un logiciel en ligne, des signatures d’expression génique spécifiques aux cellules et des relations entre les populations cellulaires ont été identifiées. Chaque ligne représente un gène, et chaque ligne représente la même cellule, et les trois populations de cellules sont représentées en bleu, rouge et vert.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en neuf heures, si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de suivre attentivement l’orientation de la plaque pour la distribution des cellules et des amorces. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer des signatures moléculaires rares et spécifiques dans les populations cellulaires.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer l’expression de plusieurs gènes dans de nombreuses cellules uniques en même temps, après un tri cellulaire, une pré-amplification et un chargement appropriés.

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Génétique

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En vrac gene expression mesures nuage cellule individuelle différences dans les populations de cellules hétérogènes. Nous décrivons ici un protocole pour analyse de l’expression génique et l’index Comment unicellulaires Tri par Florescence activé cellule Tri (FACS) peut être combiné pour délimiter l’hétérogénéité et immunophenotypically caractériser les populations cellulaires moléculairement distinctes.

Une approche combinatoire de cellule unique pour caractériser la moléculaire et immunophénotypiques hétérogénéité des souches humaines et des Populations de l’ancêtre

Ici nous décrivons une méthode robuste de déterminer l’identité et la pureté des cellules immunitaires par des signatures épigénétiques détectées à l’aide de PCR quantitatif (qPCR). La déméthylation de l’ADN à un locus spécifique sert d’identifiant unique pour un type de cellule particulier et permet d’identifier les lymphocytes T CD8MD, réglementaires ou Th17.

Détermination de l’identité et de la pureté des cellules immunitaires à l’aide d’un PCR quantitatif à base d’épigénétique

Ce protocole explique comment collecter des neurones uniques, des microglies et des astrocytes du noyau central de l’amygdale avec une grande précision et une spécificité anatomique à l’aide de la microdissection de capture laser. En outre, nous expliquons notre utilisation de microfluidique RT-qPCR pour mesurer un sous-ensemble du transcriptome de ces cellules.

Combiner la microdissection de capture laser et le QPCR microfluidique pour analyser les profils transcriptionnels des cellules uniques : une approche de biologie des systèmes à la dépendance aux opioïdes

Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d'ARNm de cellules simples pour profiler l'expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l'ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

Les marqueurs épigénétiques sont utilisés pour le sous-tétrage des globules blancs (WBC) par la quantification des modèles de méthylation de l’ADN. Ce protocole présente une méthode de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette multiplexe (mdPCR) utilisant un dispositif microfluidique thermoplastique d’élastomère (TPE) pour la génération de gouttelettes permettant une quantification cible précise et multiplexe spécifique à la méthylation des nombres différentiels WBC.

Méthylation Spécifique Multiplex Droplet PCR à l’aide de polymer Droplet Generator Device for Hematological Diagnostics

Apprenez l'analyse d'expression génique unicellulaire par RT-qPCR multiplex pour caractériser l'hétérogénéité des populations lymphoïdes rares. Cette méthode permet d'évaluer simultanément 48 gènes dans de nombreuses cellules.

Unicellulaire Gene Expression utilisant Multiplex RT-qPCR à Caractériser Hétérogénéité des rares populations lymphoïdes

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