Deux techniques pour créer des souris Hypoparathyroid: Parathyroïdectomie Utilisation GFP Glands et Diphtérie-Toxin-Mediated parathyroïdienne Ablation

L’objectif global de cette procédure est de générer deux modèles murins d’hypoparathyroïdie acquise qui sont faciles à utiliser, produisent un phénotype stable et laissent la fonction thyroïdienne intacte. Le principal avantage de ces deux modèles est qu’ils permettent l’ablation précise des glandes parathyroïdes chez la souris, soit par chirurgie guidée par fluorescence, soit par expression spécifique de la PTH du récepteur de la toxine diphtérique, ce qui permet de cibler et de détruire sélectivement les cellules sans interférer avec la glande thyroïde voisine. Nous espérons que nos modèles murins pourront répondre à des questions clés dans le domaine de l’hypoparathyroïdie.

Par exemple, les thérapies analogues de la PTH peuvent-elles aider à maintenir des taux normaux de calcium sérique sans augmenter l’excrétion urinaire de calcium ? Ces modèles peuvent également être utilisés pour étudier d’autres questions cliniques dans l’hypoparathyroïdie. Par exemple, la solidité osseuse est-elle affectée par l’hypoparathyroïdie et change-t-elle avec le traitement ?

Il est difficile de répondre à de telles questions chez les patients, mais ces modèles de souris peuvent être utilisés pour y répondre. Commencez par anesthésier des souris âgées de huit à 10 semaines, en exprimant la GFP spécifiquement chez les parathyroïdes selon un protocole approuvé. Placez l’animal en position couchée sur le dos et assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie appropriée en l’absence de pincement des orteils, de réflexe de retrait ou d’autres moyens.

Étendez la région ventrale du cou et préparez-vous à l’intervention chirurgicale en rasant la fourrure. Désinfectez la peau rasée avec un tampon antiseptique iodé à la povidone, puis préparez le site d’incision à l’aide d’un gommage chirurgical et d’un rinçage à l’alcool selon votre protocole approuvé. Ensuite, couvrez l’animal avec des champs chirurgicaux stériles pour réduire la contamination du site chirurgical.

Après avoir coupé une incision longitudinale de 2 centimètres avec un scalpel chirurgical, utilisez une pince incurvée et dentelée pour disséquer le fascia et poussez les glandes salivaires sur le côté. Ensuite, tout en observant le site chirurgical à travers un microscope de dissection, utilisez les pointes d’une pince pointue pour couper et séparer les muscles paratrachéaux et exposer la trachée. Identifiez les lobes droit et gauche de la glande thyroïde situés à côté de la trachée.

Ensuite, passez la source lumineuse à la lumière fluorescente et visualisez les deux glandes parathyroïdes fluorescentes vertes. Les rongeurs n’ont généralement que deux glandes parathyroïdes. Si vous ne pouvez pas identifier les deux glandes parathyroïdes à côté de la thyroïde de chaque côté, des glandes parathyroïdes ectopiques doivent être suspectées et une recherche minutieuse le long de la trachée doit être effectuée.

Ensuite, utilisez des pinces chirurgicales et des ciseaux pour retirer soigneusement les glandes parathyroïdes vertes et vérifiez soigneusement le long de la trachée pour vous assurer que tous les tissus verts ont été enlevés. Utilisez de la gaze stérile pour l’hémostase. Fermez les muscles paratrachéaux avec des sutures interrompues.

Fermez l’incision cutanée avec des sutures Halstead. Placez l’animal post-chirurgical dans une cage séparée sur un coussin chauffant pour la récupération de la température corporelle. Une fois que la souris est réveillée, mettez de la nourriture en granulés et de l’eau avec de la nourriture à base de gélatine sur le sol de la cage.

Après une période d’observation postopératoire de deux heures, retournez la souris à l’animalerie. Trois jours après la parathyroïdectomie, analysez 10 microlitres de sang de queue pour le calcium ionisé à l’aide d’un analyseur tel que le système de gaz du sang, l’analyseur de calcium et de pH. Si la parathyroïdectomie réussit, le calcium ionisé dans le sang sera égal ou inférieur à moins deux écarts-types de celui des souris témoins simulées.

Commencez par préparer une solution de toxine diphtérique en diluant la poudre de toxine diphtérique avec une solution saline stérile à une concentration de 0,5 microgramme par millilitre. Filtrer stérilement la solution et l’alloquot. Injectez cinq microgrammes par kilogramme de poids corporel de toxine diphtérique chez des souris âgées de huit à 10 semaines, en exprimant les récepteurs de la toxine diphtérique spécifiquement dans les parathyroïdes.

Trois jours après une deuxième injection de toxine diphtérique, analysez 10 microlitres de sang de queue pour le calcium ionisé, comme précédemment. Ce qui suit sont des images représentatives des différents emplacements des glandes parathyroïdes chez la souris exprimant la GFP spécifiquement dans la parathyroïde. Les souris avaient deux ou trois glandes parathyroïdes vertes.

La plupart des glandes parathyroïdes étaient situées près du bord supérieur ou près du bord inférieur de la glande thyroïde. Dans de rares cas, certaines glandes parathyroïdes étaient situées de manière ectopique. L’un des avantages de notre modèle murin est que la glande thyroïde reste intacte.

Cette figure montre les niveaux de TSH de souris GFP-PTX trois mois après la parathyroïdectomie. Cette figure montre les mesures de T4. Les souris GFP-PTX présentent des concentrations de TSH et de T4 qui n’étaient pas différentes de celles des souris témoins.

Cette image montre les taux de calcium sanguin et les taux de PTH chez les souris GFP-PTX. Cette image montre les taux de calcium sanguin et les taux de PTH chez des souris PTHcre-iDTR injectées de toxine diphtérique. Les souris GFP-PTX et les souris PTHcre-iDTR injectées par DT ont présenté une hypocalcémie stable et des niveaux réduits de PTH sur une période d’observation de trois mois.

Une fois maîtrisée, la parathyroïdectomie guidée par la GFP peut être effectuée en 20 minutes environ pour l’ensemble de la procédure. Une seule injection de toxine diphtérique ne prend pas plus d’une minute si elle est effectuée correctement. À la suite de cette procédure, ces souris développent une hypoparathyroïdie et peuvent être utilisées comme modèle de maladie préclinique.

Des questions peuvent être abordées, telles que l’efficacité de différents analogues de l’hormone PTH dans le traitement de l’hypoparathyroïdie. N’oubliez pas que la toxine diphtérique est dangereuse et que les travailleurs doivent recevoir les vaccins habituels contre la toxine diphtérique. Des équipements de protection individuelle tels que des masques et des gants doivent toujours être portés lors de ces procédures.