Name: Deux techniques pour créer des souris Hypoparathyroid: Parathyroïdectomie Utilisation GFP Glands et Diphtérie-Toxin-Mediated parathyroïdienne Ablation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Apprenez deux méthodes pour créer des modèles murins d'hypoparathyroïdisme acquis par parathyroïdectomie guidée par fluorescence ou ablation par toxine diphtérique. Ces modèles préservent la fonction thyroïdienne.

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Ce travail a été soutenu par le NIH accorde R01-DK100584 et China State Key Laboratory de maladies bucco-de SKLOD2015OF01 de financement ouvert (RB). Nous remercions Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, et Kelly Lauter aide.

Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Hôpital général du Massachusetts. Obtenir l&#39;approbation institutionnelle appropriée pour cette étude sur des animaux avant de commencer. Certaines techniques peuvent être ajustées en fonction des besoins locaux IACUC. 1. Les souris GFP-PTX <ol><li> Obtenir des souris PTHcre + et les souris Rosa-MTMG à 8 - 10 semaines d&#39; âge pour de plus amples accouplement. </li><li> Rétrocroisement les PTHcre + souris (mixtes 129; FVB arrière - plan) avec C57BL / 6 pour 6 générations pour obtenir des souris avec des souris C57BL / 6 fond. </li><li> Souris Inbreed PTHcre + pour obtenir PTHcre + / + souris 17. REMARQUE: Pour effectuer le génotypage, extraire l&#39;ADN de la pointe de la queue et de l&#39;utiliser pour la PCR. Les amorces de PCR pour vérifier les hétérozygotie et homozygotes du transgène PTHcre sont les suivantes: l&#39;amorce A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, amorce inverse A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA forward amorce B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, amorce inverse B &#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Cross PTHcre + / + souris 16 avec Rosa-MTMG souris 18. Sevrage PTHcre; chiots MTMG à l&#39;âge de 4 semaines. </li><li> Anesthetize 8 - 10 semaines PTHcre; souris MTMG par injection ip de tribromoéthanol (Avertin) à 0,6 mg / g de poids corporel, ou d&#39;autres agents tels que la kétamine / xylazine. Utiliser la buprénorphine 0,1 mg / kg sc toutes les 12 h comme analgésique pendant 48 heures après la chirurgie selon un protocole approuvé. Veiller à la profondeur appropriée de l&#39;anesthésie par le réflexe pincement de l&#39;orteil de retrait ou d&#39;autres moyens. Placer l&#39;animal dans la position couchée. </li><li> Étendre et préparer la région du cou ventral par le rasage de la peau en utilisant des lames de bord simples. Désinfecter la peau rasée avec un tampon antiseptique povidone iodée. </li><li> Couvrir l&#39;animal avec des champs opératoires stériles pour réduire la contamination du site chirurgical et utiliser micro autoclavérosurgical instruments pour l&#39;intervention chirurgicale. </li><li> Couper une incision longitudinale de 2 cm dans la peau avec un scalpel chirurgical. Disséquer fascia et pousser les glandes salivaires sur le côté par dissection avec des pinces dentelées incurvées. </li><li> Sous le microscope de dissection en utilisant la lumière halogène et un 4 - grossissement 5X, couper et séparer les muscles paratrachéaux en utilisant des pinces acérées conseils et exposer la trachée. </li><li> Identifier la glande thyroïde avec le lobe de gauche à droite et situé à côté de la trachée. </li><li> Mettez la source de lumière à la lumière fluorescente et de visualiser les deux glandes parathyroïdes vert-fluorescent. NOTE: En règle générale, les deux glandes parathyroïdes sont situés à ou près de la surface de la glande thyroïde, mais parfois, ils sont situés plus loin. </li><li> Retirez délicatement les glandes parathyroïdes verts à l&#39;aide de pinces chirurgicales et ciseaux. Utiliser de la gaze stérile pour l&#39;hémostase et de vérifier soigneusement le long de la trachée afin d&#39;assurer que tous les tissus vert a été supprimé. </li&gt; <li> Fermez les muscles paratrachéaux par suture interrompue en utilisant 6-0 polyglactine 910 sutures. Fermer l&#39;incision de la peau par une suture Halsted en utilisant 6-0 polyglactine 910 sutures. </li><li> Facultatif: Injecter 10 ul / g de poids corporel d&#39;une solution de chlorure de sodium stérile normale à 0,9% aux souris pour le remplacement du fluide. </li><li> Placer les animaux dans une cage postchirurgicales séparée sur un incubateur à chaud (37 ° C) pour la récupération de la température corporelle. Une fois que les souris sont éveillés et en position couchée, mettre culot chow et de l&#39;eau avec de la nourriture de la gélatine sur le sol de la cage. </li><li> Après une période d&#39;observation postopératoire de 2 h, retournez la souris à l&#39;animalerie et de suivre les exigences locales en matière de soins postopératoires. </li><li> 3 jours après parathyroïdectomie, obtenir 10 ul sang de la queue et de mesurer le sang ionisé Ca ++ en utilisant un analyseur tel que le système de gaz du sang Ca ++ / pH de l&#39; analyseur. Les résultats de la parathyroïdectomie réussies dans le sang ionisés Ca ++ inférieure ou égale à -2SD de sham-exploité conDes souris TROL (1,20 mmol / L dans nos expériences de n = 30). </li></ol> 2. PTH-Cre-IDTR Souris <ol><li> Obtenir PTHcre + et DTR fl / fl souris à 8 - 10 semaines d&#39; âge pour l&#39; accouplement. </li><li> Rétrocroisement les souris PTHcre (mixtes 129; FVB arrière-plan) avec C57BL / 6 pour 6 générations pour obtenir des souris avec des souris C57BL / 6 fond. </li><li> Inbreed le PTHcre + (C57BL / 6 arrière - plan) des souris pour obtenir PTHcre + / + souris 17. REMARQUE: Pour effectuer le génotypage, l&#39;ADN de souris queue conseils a été extrait et utilisé pour la PCR. Amorces génotypage: l&#39;amorce A, CCTGTCAAGGATGTGGAAGA, inverser l&#39; amorce A &#39;, TCAGATCACACCACACAGCA, l&#39;amorce B, CAGTTGTCTTTAGTTTACTCAGCATCAG, reverse B primer&#39;, GATAATCGCGAACATCTTCAGGTT 17. </li><li> Compagnon PTHcre + / + souris 16 avec DTR fl / fl 19 souris pour obtenir des souris PTHcre-IDTR. </li><li> Préparer la solution DT en diluant diphtheriune poudre de toxine avec une solution saline stérile à une concentration de 0,5 ug / ml. filtre stérile, et stocker des aliquotes à -80 ° C. </li><li> Choisissez 8 - 10 semaines souris PTHcre-IDTR pour expérience d&#39;injection. Décongeler DT aliquote à température ambiante, on administre par voie intrapéritonéale DT à 5 ug / kg (10 ul / g) de poids corporel de l&#39;animal. Pour une efficacité maximale et moins de toxicité, l&#39; administration DT est répétée pour un total de 2 injections dans un intervalle de 3 jours 17. </li><li> 3 jours après la seconde injection, prendre 10 pi queue sang de chaque PTHcre-IDTR / PTHcre-IDTR-MTMG souris et mesurer Ca ++ dans le sang en utilisant un système Ca gaz sanguins ++ / pH analyseur. REMARQUE: On définit les souris avec du sang ionisés Ca ++ inférieure à 1,18 mmol / L de souris hypoparathyroid, ce qui correspond 2SD inférieure à la moyenne des souris témoins véhicule à injection (n = 22). </li></ol>

<ol><li>Brandi, M. L., Brown, E. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandi%2C+ML+%22Hypoparathyroidism%22">Hypoparathyroidism</a>. , Springer. (2015).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous démontrons la technique de parathyroïdectomie GFP-guidée en utilisant des souris transgéniques avec expression de la GFP sélectivement dans les glandes parathyroïdes. Dans les PTHcre; souris MTMG, la double fluorescence (la GFP verte dans les cellules Cre-exprimés et rouge tomate dans la non-Cre cellules exprimé) nous a permis d&#39;identifier clairement, et d&#39;éliminer précisément toutes les glandes parathyroïdes sans enlever les thyroïdes. Alors que nous préférons l&#39;utilisation de la double-fluorescence des souris MTMG pour la capacité d&#39;identifier les tissus non-parathyroïdienne rouge fluorescent, notre procédure devrait aussi bien fonctionner en utilisant des animaux fluorescents simples tels que le rouge de la tomate (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) souris. La procédure est relativement facile à réaliser, nécessite environ 20 min par souris, et se traduit par un phénotype sévère hypoparathyroid et durable. En outre, un autre avantage des glandes parathyroïdes positives à GFP est la facilité de détection des glandes parathyroïdes aberrantes. Nos études démontrentmauvaise localisation des parathyroïdes dans environ un quart des souris B6 (Figure 1), qui sont facilement détectés dans notre modèle de souris par la fluorescence verte. Contrairement à ce que thyro-parathyroidectomie, notre technique évite le retrait de la thyroïde avec un besoin ultérieur pour le remplacement de l&#39;hormone de la thyroïde et de l&#39;effet connu de la suppression de cellules C thyroïdiennes calcitonine productrices. parathyroïdes marquées par fluorescence peuvent aussi être utilisés pour d&#39;autres investigations qui nécessitent l&#39;isolement des glandes parathyroïdes. La limitation de ce modèle comprend l&#39;exigence d&#39;une intervention chirurgicale. compétences de microchirurgie de base et d&#39;un microscope de dissection avec une source de lumière fluorescente sont nécessaires. Une seconde technique pour générer des souris hypoparathyroid qui élimine la nécessité d&#39;une intervention chirurgicale est mise en évidence. Toxine diphtérique-souris traitées PTHcre-IDTR présentent une hypoparathyroïdie phénotype plus doux, mais exigent simplement injecter DT par voie intrapéritonéale à la souris. La partie critique for génère ce modèle a été l&#39;optimisation de la dose et le régime posologique. Des doses élevées de DT ont conduit à la toxicité, mais de faibles doses ont diminué l&#39;efficacité de l&#39;approche. Nous avons déterminé que le régiment de dose de 2 injections à 5 ug / kg, administrée 3 jours d&#39;intervalle, a donné lieu à une hypocalcémie fiable et stable sans mortalité / minimal. En fin de compte, nous espérons que ces deux approches offrent des modèles de souris utiles pour hypoparathyroïdie acquise. L&#39; utilisation d&#39; un roman PTH longue durée d&#39;action, nous avons rapporté la première utilisation de ces deux modèles pour déterminer l&#39;efficacité de nouveaux médicaments pour hypoparathyroïdie 17.

Depuis la première description systématique des glandes parathyroïdes chez l&#39; homme et dans plusieurs autres espèces par Sandström en 1880 1, la compréhension de l&#39;importance de ce petit organe endocrine pour la physiologie humaine et la maladie a continuellement amélioré. glandes parathyroïdes sécrètent l&#39;hormone parathyroïdienne (PTH), le principal régulateur de métabolisme du calcium. PTH est également une hormone importante pour l&#39; homéostasie du phosphate et du remodelage osseux 1, 2. Suppression accidentelle ou d&#39; endommagement des parathyroïdes lors de la chirurgie du cou est la cause la plus fréquente de l&#39; hypoparathyroïdie, une maladie caractérisée par une faible taux de calcium sanguin, faible PTH, et de phosphore élevées 1. Pour mieux étudier acquis hypoparathyroïdie et de test de nouvelles thérapies, fiable et facilement des modèles de souris accessibles sont nécessaires. Les souris sont largement utilisés dans la recherche, car une grande variété d&#39;outils génétiques sont unvailable dans cette espèce permettant des études mécanistiques sophistiquées in vivo. Cependant, alors que parathyroidectomie chirurgical (PTX) peut être utilisé chez les rats 2, 3, 4, 5, et les grands mammifères 6, 7, 8, il est techniquement très difficile chez la souris en raison de la petite taille des glandes et leur répartition anatomique variables 9. Par conséquent, thyro-parathyroïdectomie (TPTX) est généralement effectuée chez la souris, dans laquelle la thyroïde et les glandes parathyroïdes sont enlevés ensemble 10. Cependant, les niveaux d&#39;hormones thyroïdiennes faibles sont un facteur de confusion potentiel dans des expériences, ce qui complique ce modèle. En outre, les cellules C au sein de la glande thyroïde, qui produisent de la calcitonine, une hormone importante dans l&#39;homéostasie du calcium chez les rongeurs, sont également perdues lors du retrait de la ièmeyroids 11. Plusieurs modèles de souris génétiques de l&#39; hypoparathyroïdie existent, qui comprennent la souris PTH-12 null, la GCM2 nulle souris 13 et la souris Nuf avec une mutation activatrice du récepteur sensible au calcium (CaSR) 14, 15. Cependant, ces anomalies génétiques sont déjà présents au cours du développement embryonnaire, et la fonction des parathyroïdes est donc déjà altérée au cours de l&#39;embryogenèse. Ceci peut affecter le développement des organes tels que le squelette. Cela contraste avec les patients avec hypoparathyroïdie postopératoires qui acquièrent la maladie plus tard dans la vie. En outre, certains de ces modèles de souris présentent une létalité précoce et une fertilité réduite, ce qui complique davantage leur utilisation 12, 13, 14. Nous avons développé deux nouveaux m de la sourisodèles pour hypoparathyroïdie acquise. En utilisant des souris transgéniques qui expriment la GFP spécifiquement dans les glandes parathyroïdes permet parathyroïdes d&#39;être facilement identifiés pour l&#39;ablation chirurgicale sans enlever la glande thyroïde. Cette souris a été générée par croisement de souris Cre-PTH, qui exprime la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur de 5,5 kb PTH 16 avec la souris ROSA MTMG. Les PTHcre résultant; souris MTMG expriment la protéine fluorescente verte spécifiquement dans les cellules parathyroïdes. Le second modèle de souris utilise le même PTH-Cre, cette fois pour retirer une cassette d&#39;arrêt de la souris DTR inductible, ayant pour résultat l&#39;expression du récepteur de la toxine diphtérique spécifiquement dans les glandes parathyroïdes. L&#39;administration systémique de DT détruit les cellules parathyroïdes, ce qui rend les animaux hypoparathyroid sans chirurgie. Les deux modèles de souris présentés dans cette étude démontrent un phénotype hypocalcémiant stable au cours des péri d&#39;observation de trois moisod. Les procédures sont faciles à réaliser, le phénotype est reproductible, et les souris hypoparathyroid présentent un taux 17 de survie élevé.

<table><tbody><tr><td>souris ROSAmT/mG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7676</td><td></td></tr><tr><td>Souris PTH-Cre</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5989</td><td></td></tr><tr><td>iDTRmice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>6-0 polyglactin 910 suture avec aiguille</td><td>Ethicon, Inc</td><td>J510G</td><td></td></tr><tr><td>Safety Single Edge Razor Blades</td><td>American Safety Razor Company</td><td>66-0089</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel jetable</td><td>Feather Safety Razor Co., LTD</td><td>72042-11</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pads</td><td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>Ply</td><td>gaze Busse. Inc</td><td>BHD707</td><td></td>Solution de</tr><tr><td>chlorure de sodium à 0,9 %</td><td>HOSPIRA Worldwide, Inc</td><td>07983-09</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 29 g Seringue à insuline</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>Champs chirurgicaux d’incisée</td><td>3M</td><td>6640EZ</td><td></td></tr><tr><td>Dumstar Pince de biologie</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-4984</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissection Ciseaux à ressort</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>MILTEX.,Inc</td><td>V98-42</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Pour dissoudre le 2,2,2-Tribromethanol</td></tr><tr><td>Diphtérie Toxine Poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td>Dissoudre dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 % à 1 mg/mL sous forme de solution mère en -80 &#176 ; C</td></tr><tr><td>Multicap Collection de sang Tubes capillaires</td><td>Siemens Healthcare Diagnostics Ltd</td><td>855578</td><td>Pour la collecte de sang dans l’analyse iCa2+ à l’aide de RapidLab 348 Analyseur de Ca2+/pH</td></tr><tr><td>RapidLab 348 Ca2+/pH</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td>Pour l’analyse iCa2+</td></tr></tbody></table>

deux techniques pour créer des souris hypoparathyroid: parathyroïdectomie utilisation gfp glands et diphtérie-toxin-mediated parathyroïdienne ablation

Two Techniques to Create Hypoparathyroid Mice: Parathyroidectomy Using GFP Glands and Diphtheria-Toxin-Mediated Parathyroid Ablation

L’hypoparathyroïdie (HP) est un trouble caractérisé par de faibles niveaux de PTH qui entraînent une hypocalcémie, une hyperphosphatémie et un faible renouvellement osseux. La cause la plus fréquente de la maladie est l’ablation accidentelle des glandes parathyroïdes lors d’une chirurgie de la thyroïde. De nouvelles thérapies pour la HP sont nécessaires, mais leur test nécessite des modèles animaux fiables de HP acquis. 
Ici, nous démontrons la génération de deux modèles murins de HP acquis. Dans le modèle GFP-PTX, des souris avec une protéine fluorescente verte (GFP) exprimée spécifiquement dans les parathyroïdes (PTHcre-mTmG) ont été créées en croisant des souris PTHcre+ avec des souris Rosa-mTmGfl/fl. Les glandes parathyroïdes vertes fluorescentes sont facilement identifiées à l’aide d’un microscope à dissection de fluorescence et la parathyroïdectomie est réalisée en moins de 20 min. Après une chirurgie guidée par fluorescence, les souris sont profondément hypocalcémiques. Contrairement à la thyro-parathyroïdectomie traditionnelle, cette approche chirurgicale précise laisse les glandes thyroïdes et la fonction thyroïdienne intactes. Le deuxième modèle, qui ne nécessite pas de chirurgie, est basé sur une approche diphtérie-toxine. Les souris PTHcre-iDTR, qui expriment le récepteur de la toxine diphtérique (DT) spécifiquement dans les parathyroïdes, ont été générées en croisant la souris DTR inductible avec la souris PTHcre. Les cellules parathyroïdiennes sont ainsi rendues sensibles à la toxine diphtérique (DT) et peuvent être détruites de manière sélective en injectant systématiquement du DT à des souris. Le phénotype hypocalcémique qui en résulte est stable.

Emplacement de la parathyroïde Glands Tout d&#39;abord, nous avons enregistré la répartition des glandes parathyroïdes de 54 souris PTHcre-MTMG comme observé sous la dissection microscope à fluorescence. 74% (40/54) des souris avait deux glandes parathyroïdes verts (Figure 1A, C, E), 26% (14/54) des souris avait une troisième glande parathyroïde supplémentaire (figure 1B, D, F). Pas de souris avec une seule glande ou plus de trois glandes ont été observées. Habituellement, les glandes parathyroïdes étaient situés près de la frontière supérieure de la glande thyroïde (58%, 71/122; Figure 1A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3)). 27% (33/122) glandes étaient situées près de la frontière inférieure de la glande thyroïde (figure 1C (1), D (3), F (1)), et 13% (16/122) étaient situés loin de la tglande hyroid (figure 1B (3), E (1), F (2)). Nos résultats sont cohérents avec et étendent les résultats antérieurs des emplacements des glandes parathyroïdes 20 variables. Les souris GFP-PTX La chirurgie entière de l&#39;anesthésie à la fermeture de l&#39;incision de la peau a pris environ 20 min par souris. Le taux de souris postopératoires sur une période d&#39;observation de 3 mois de survie était de 96,3% (53/55). 92,4% (49/53) des souris GFP-PTX présentaient des niveaux de calcium ionisé qui étaient 2 SD en dessous de la moyenne des souris témoins opérés de manière fictive ou inférieure. Le phénotype hypoparathyroid chez les souris GFP-PTX (hypocalcémie, faible PTH et de phosphate sérique) était stable pendant toute la durée d&#39;observation de 3 mois. Fait important, la fonction thyroïdienne était pas différents des animaux opérés de manière fictive 3 mois après la chirurgie (TSH = 42 ± 24 vs 30 ± 15 mU / L, p = 0,171; T4 = 30,0 ± 0,6 vs 3,1 ± 0,9 mg / dl, p = 0,707 (figure 2). PTH-cre-IDTR Souris DT souris injectées PTH-Cre-IDTR hypoparathyroïdie développé (calcium ionisé artérielle basse, élevée de phosphore dans le sang, et le taux de PTH trop bas à la normale). Nous avons précédemment rapporté que des cellules positives à quelques PTH échapper à l&#39;ablation par la toxine diphtérique, expliquant la PTH circulant mesurable et donc le phénotype peu plus doux de ces souris 17. Hypoparathyroïdie chez la souris GFP-PTX et PTH-cre-IDTR Souris Des réductions significatives de Ca ++ dans le sang et le taux de PTH sérique ont été observées chez les souris PTX-GFP 3 jours après l&#39; intervention chirurgicale, par rapport aux niveaux observés chez les souris opérés de manière fictive (Ca ++ = 1,05 ± 0,40 vs. </em&gt; 1,30 ± 0,03 mmol / L, p &lt;0,05; La PTH = 32 ± 22 vs 580 ± 137 pg / ml, p &lt;0,05). Le phénotype hypoparathyroïdie est stable sur la période d&#39;observation de 3 mois (figure 3A, réimprimé avec la permission de (référence n ° 17)). Après 2 injections de 5 ug / kg DT à 3 jours d&#39;intervalle, une dose et un régime optimisé pour utiliser le moins de DT pour donner le phénotype hypoparathyroid maximal, DT injecté les souris de IDTR PTH-Cre a montré une hypocalcémie significative et la PTH réduit par rapport à souris de contrôle du véhicule, qui ont persisté au cours de la période d&#39;observation de 90 jours (Ca ++ = 1,10 ± 0,07 mmol / l vs 1,26 ± 0,05 mmol / l, p &lt;0,05; PTH = 218 ± 156 pg / ml vs 572 ± 164 pg / mL, p &lt;0,05) (figure 3B, réimprimé avec la permission de (référence n ° 17)). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig1.jpg" /> Figure 1: <strong&gt; Images représentatives des divers endroits de la parathyroïde Glands dans 54 Souris PTHcre-MTMG sous Fluorescent Dissection Microscope. Les souris avaient soit deux (A, C, E) ou trois (B, D, F) , les glandes parathyroïdes verts. La plupart des glandes parathyroïdes sont situés près de la frontière supérieure (A (1,2), B (1,2), C (2), D (1,2), E (2), F (3) ou à proximité du bord inférieur de la glande thyroïde (C (1), D (3), F (1)). Dans de rares cas, certains étaient situés ectopique (B (3), E (1), F (2)). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig2.jpg" /> Figure 2: TSH et T4 Niveau de souris GFP-PTX. 3 mois après la GFP-PTX, le sérum a été obtenu pour la TSH et T4 Measurem<html> ents. GFP-PTX les souris ont montré des concentrations de TSH (42 ± 24 mU / L) (A) et T4 concentrations (3,0 ± 0,6 mg / dl) (B) qui ne diffèrent pas de souris témoins (TSH = 30 ± 15 mU / L, p = 0,171, n = 11, T4 = 3,1 ± 0,9, p = 0,707, n = 11). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55010/55010fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55010/55010fig3.jpg" /> Figure 3: Blood Ca ++ et taux de PTH chez la souris GFP-PTX et DT Injecté Souris-IDTR PTH-Cre. Les deux souris GFP-PTX (A) et DT injecté PTH-Cre-IDTR souris (B) ont présenté une hypocalcémie stable et réduit le taux de PTH sur 3 période d&#39;observation mois (N = 6-8, *** p &lt;0,001) (re-imprimé avec la permission de la référence n ° 17).es / ftp_upload / 55010 / 55010fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Des souris atteintes d’hypoparathyroïdie acquise seraient utiles pour étudier de nouvelles thérapies médicamenteuses contre l’hypoparathyroïdie. Deux procédures pour créer de telles souris sont démontrées. La souris GFP-PTX est générée par parathyroïdectomie chirurgicale guidée par des glandes parathyroïdes vertes fluorescentescentes. Une deuxième approche, non chirurgicale, est basée sur l’expression spécifique de la parathyroïde du récepteur de la toxine diphtérique.

Deux techniques pour créer des souris Hypoparathyroid: Parathyroïdectomie Utilisation GFP Glands et Diphtérie-Toxin-Mediated parathyroïdienne Ablation

Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most ...

L'objectif général de cette procédure est de générer deux modèles murins d'hypoparathyroïdie acquise faciles à utiliser, produisant un phénotype stable et laissant la fonction thyroïdienne intacte. Le principal avantage de ces deux modèles réside dans leur capacité à permettre l'ablation précise des glandes parathyroïdes chez la souris, soit par chirurgie guidée par fluorescence, soit par l'expression spécifique de la récepteur de la toxine diphtérique sous contrôle du promoteur de l'hormone parathyroïdienne (PTH), permettant ainsi de cibler et de détruire sélectivement ces cellules sans perturber la glande thyroïde adjacente. Nous espérons que nos modèles murins permettront de répondre à des questions clés dans le domaine de l'hypoparathyroïdie. Par exemple, les thérapies à base d'analogues de la PTH peuvent-elles aider à maintenir des taux normaux de calcium sérique sans augmenter l'excrétion urinaire de calcium ? Ces modèles peuvent également être utilisés pour étudier d'autres questions cliniques liées à l'hypoparathyroïdie. Par exemple, la résistance osseuse est-elle affectée par l'hypoparathyroïdie et change-t-elle avec le traitement ?Des questions comme celles-ci sont difficiles à répondre chez les patients, mais ces modèles murins peuvent être utilisés pour y répondre. Commencez par anesthésier des souris âgées de huit à dix semaines, exprimant la GFP spécifiquement dans les parathyroïdes selon un protocole approuvé. Placez l'animal en position supine et assurez-vous d'une profondeur d'anesthésie adéquate par l'absence de réflexe de retrait à la pincée du orteil ou par tout autre moyen approprié.Étendez la région ventrale du cou et préparez la chirurgie en rasant le pelage. Désinfectez la peau rasée avec un tampon antiseptique à base de povidone iodée, puis préparez le site d'incision en utilisant une friction chirurgicale et un rinçage à l'alcool conformément à votre protocole approuvé. Ensuite, recouvrez l'animal de champs chirurgicaux stériles afin de réduire la contamination du site opératoire.Après avoir pratiqué une incision longitudinale de 2 centimètres à l’aide d’un scalpel chirurgical, utiliser une pince courbe cannelée pour disséquer le fascia et déplacer les glandes salivaires sur le côté. Ensuite, tout en observant le site chirurgical au microscope de dissection, utiliser les pointes d’une pince fine pour couper et séparer les muscles paratrachéens et exposer la trachée. Identifier les lobes droit et gauche de la glande thyroïde situés à côté de la trachée.Ensuite, passez à une source de lumière fluorescente et observez les deux glandes parathyroïdes vertes fluorescentes. Les rongeurs n'ont généralement que deux glandes parathyroïdes. Si vous ne parvenez pas à identifier les deux glandes parathyroïdes situées à côté de la thyroïde de chaque côté, une localisation ectopique des glandes parathyroïdes doit être suspectée, et une recherche minutieuse le long de la trachée doit être effectuée.Ensuite, utilisez une pince chirurgicale et des ciseaux pour retirer soigneusement les glandes parathyroïdes vertes et vérifiez attentivement le long de la trachée afin de vous assurer que tous les tissus verts ont été enlevés. Utilisez un pansement stérile pour l’hémostase. Fermez les muscles paratrachéens par des points de suture séparés.Fermer l'incision cutanée avec des sutures de Halstead. Placer l'animal postopératoire dans une cage séparée sur un tapis chauffant afin de permettre la récupération de la température corporelle. Une fois que la souris est réveillée, placer des aliments en granulés et de l'eau avec un peu de nourriture gélatineuse sur le fond de la cage.Après une période d'observation postopératoire de deux heures, ramener la souris au vivarium. Trois jours après la parathyroïdectomie, analyser 10 microlitres de sang de queue pour déterminer le calcium ionisé à l’aide d’un analyseur tel que le système de gaz du sang, ou un analyseur de calcium et de pH. Si la parathyroïdectomie est réussie, le calcium ionisé sanguin sera inférieur ou égal à deux écarts-types en dessous de celui des souris contrôles ayant subi une opération témoin.Commencez par préparer une solution de toxine diphtérique en diluant la poudre de toxine diphtérique avec du sérum physiologique stérile jusqu'à une concentration de 0,5 microgramme par millilitre. Filtrez stérilement la solution et répartissez-la en aliquotes. Injectez cinq microgrammes par kilogramme de poids corporel de toxine diphtérique à des souris âgées de huit à dix semaines, exprimant spécifiquement les récepteurs de la toxine diphtérique dans les parathyroïdes.Trois jours après une deuxième injection de toxine de la diphtérie, analyser 10 microlitres de sang de queue pour mesurer le calcium ionisé, comme précédemment. Les images suivantes sont des exemples représentatifs des différents emplacements des glandes parathyroïdes chez des souris exprimant la GFP spécifiquement dans la parathyroïde. Les souris présentaient soit deux, soit trois glandes parathyroïdes vertes.La plupart des glandes parathyroïdes se situaient près de la bordure supérieure ou près de la bordure inférieure de la glande thyroïde. Dans de rares cas, certaines glandes parathyroïdes étaient situées de manière ectopique. L'un des avantages de notre modèle murin est que la glande thyroïde reste intacte.Cette figure montre les niveaux de TSH chez des souris GFP-PTX trois mois après parathyroïdectomie. Cette figure illustre les mesures de T4. Les souris GFP-PTX présentent des concentrations de TSH et de T4 qui ne diffèrent pas de celles des souris témoins.Cette image montre les taux sanguins de calcium et de PTH chez les souris GFP-PTX. Cette image montre les taux sanguins de calcium et de PTH chez les souris PTHcre-iDTR injectées avec la toxine diphtérique. Les souris GFP-PTX ainsi que les souris PTHcre-iDTR injectées avec la toxine diphtérique ont présenté une hypocalcémie stable et des taux réduits de PTH au cours d'une période d'observation de trois mois.Une fois maîtrisée, la parathyroïdectomie guidée par la GFP peut être réalisée en environ 20 minutes pour l'ensemble du protocole. Une injection unique de toxine diphtérique prend moins d'une minute si elle est effectuée correctement. Après cette intervention, ces souris développent une hypoparathyroïdie et peuvent être utilisées comme modèle préclinique de la maladie.Des questions peuvent être abordées, comme l'efficacité de différents analogues de l'hormone PTH dans le traitement de l'hypoparathyroïdie. N'oubliez pas que la toxine diphtérique est dangereuse et que les personnes manipulant ce produit doivent être munies des immunisations habituelles contre la toxine diphtérique. Des équipements de protection individuelle, tels que des masques et des gants, doivent toujours être portés lors de la réalisation de ces procédures.

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Deux techniques pour créer des souris Hypoparathyroid: Parathyroïdectomie Utilisation GFP Glands et Diphtérie-Toxin-Mediated parathyroïdienne Ablation

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