Méthodologie de l'étude du transfert horizontal de gènes dans Staphylococcus aureus

L’objectif global de cette procédure est de fournir une méthodologie détaillée pour étudier la transmission horizontale de l’ADN dans le staphylocoque doré en s’attaquant aux trois principales voies de transfert. Conjugaison, transduction et transformation naturelle. Cette méthode consiste en un transfert horizontal de gènes résistants aux antibiotiques dans le staphylocoque doré pathogène humain.

Le principal avantage des techniques présentées ici est que nous pouvons tester trois modes de transfert majeurs, y compris la transformation génétique naturelle récemment découverte. Pour commencer l’expérience, préparez cinq millilitres de culture de nuit des bactéries donneuses et receveuses dans un bouillon de soja tryptique. Ou TSB medium avec et sans 32 milligrammes par litre de chloramphénicol, respectivement.

Avec des secousses à 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajustez la densité optique des cultures de nuit à une densité avec du milieu TSB frais. Mélangez 0,5 millilitre de la culture donneuse avec 0,5 millilitre de la culture receveuse.

Et ajoutez un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS au mélange. Ensuite, à l’aide d’un système de pompe à vide, transférez le mélange de bactéries sur une membrane filtrante de 0,45 micromètre. Placez les membranes filtrantes sur une plaque de gélose au sang de mouton.

Incuber les assiettes à 37 degrés Celsius pendant une journée. Retirez la membrane filtrante de la plaque et suspendez-la dans 10 millilitres de PBS. Agitez le mélange pendant environ une minute pour recueillir toutes les bactéries attachées à la membrane.

Faites une dilution en série de 10 fois de la suspension bactérienne avec du TSB frais. Plaque de 100 microlitres des échantillons 0, 10, 4 dilués sur gélose TSB. Ou des plaques TSA complétées par 32 milligrammes par litre de chloramphénicol et huit milligrammes par litre de tétracycline pour sélectionner les transconjugants.

Plaquez 100 microlitres de suspension diluée sur des plaques TSA avec huit milligrammes par litre de tétracycline seule. Pour compter le nombre total de destinataires. Après l’incubation, analyser les colonies à double résistance pour détecter la présence du gène CFR par PCR de colonie et leurs profils de sensibilité.

Déterminer l’antibiogramme en mesurant les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antibiotiques appropriés selon la méthode de microdilution standard ou la méthode de diffusion discale. Le profil de sensibilité des transconjugants doit être identique à celui du receveur. À l’exception du chloramphénicol et d’autres composés affectés par le gène CFR.

Exclure la résistance à la tétracycline développée par la souche donneuse. Préparez une culture de nuit de N315-45 dans cinq millilitres de bouillon nutritif complété par 3,6 millimolaires de calcium. Préparez les sous-cultures en diluant la culture de nuit un à 1 000 dans un volume final de 10 millilitres dans des flacons en verre de 50 millilitres.

Cultivez les bactéries pendant une heure à 37 degrés Celsius en secouant, 180 rotations par minute. Préparez ensuite une série de phages MR83a dilués dans un milieu de chlorure de calcium NB. Ajoutez 20 microlitres du phage dilué dans la culture bactérienne.

Préparez une culture témoin sans lysoinfection pour servir de contrôle positif pour la croissance cellulaire bactérienne. Ensuite, cultivez les cultures à 37 degrés Celsius avec des secousses douces à 100 rotations par minute pendant la nuit. Le lendemain, choisissez un ou deux flacons de culture nettoyés avec la dilution la plus élevée du phage ajouté.

Transférez les cultures dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres. Ajoutez 250 microlitres de chloroforme dans les tubes et mélangez soigneusement la culture en les inversant. Centrifugez la culture à 5 000 fois G pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius.

Transférez les surnageants dans des tubes frais et conservez-les à 4 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Préparez un bouillon nutritif de gélose et gardez-le au chaud dans un bain-marie à 55 degrés Celsius. Ajouter une solution autoclavée de chlorure de calcium 0,5 molaire au milieu jusqu’à une concentration finale de 3,6 millimolaires.

Versez-le dans des boîtes de Pétri de 90 millimètres NB plaques de chlorure de calcium. Préparez une culture de nuit de N315 dans cinq millilitres de chlorure de calcium NB à 37 degrés Celsius en secouant. Le lendemain, ajoutez 10 microlitres de la culture de nuit dans 200 microlitres de chlorure de calcium NB et étalez-le uniformément sur la plaque de chlorure de calcium NB.

Arrêtez l’étalement lorsque la surface de la plaque est recouverte de liquide. Laissez ensuite sécher la plaque pendant cinq minutes. Faites une dilution en série de un à 10 du phage préalablement préparé à l’aide d’un milieu de chlorure de calcium NB.

Repérez trois microlitres de chaque dilution de phage sur la plaque recouverte de bactéries. Incuber l’assiette toute la nuit à 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, comptez le nombre de plaques et calculez le titre de phage à l’aide de l’équation suivante.

Préparez la culture de nuit de N315, COL ou MU50, dans cinq millilitres de chlorure de calcium NB à 37 degrés Celsius avec agitation à 180 rotations par minute. Après une culture pendant la nuit, diluez le phage dans du chlorure de calcium NB à 109 PFU par millilitre. Dans un flacon en verre de 50 millilitres, mélangez 500 microlitres de culture de nuit, 500 microlitres de chlorure de calcium NB frais et un millilitre de phage 109 PFU par millilitre.

Incuber le mélange à 37 degrés Celsius en secouant doucement à 100 rotations par minute pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de citrate trisodique à 20 % aux cultures. Continuez à agiter doucement pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Préparez l’infusion de cerveau fondu ou le milieu gélosé BHI et conservez-le dans un bain-marie à 55 degrés Celsius, et traitez le milieu gélosé avec 32 milligrammes par litre de chloramphénicol. Transférez ensuite le mélange de phages de bactéries dans une fiole de 100 millilitres. Ajoutez 50 millilitres de gélose BHI chaude complétée par 32 milligrammes par litre de chloramphénicol, et mélangez bien.

Versez le mélange dans les boîtes de Pétri de 90 millimètres. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius. Testez davantage la résistance des colonies générées, les transductants, en transférant les colonies sur de nouvelles plaques de gélose BHI complétées par 32 milligrammes par litre de chloramphénicol.

Confirmer la présence du gène CFR par PCR de colonie. Cultivez la cellule réceptrice pendant la nuit, dans cinq millilitres de TSB à 37 degrés Celsius en agitant. Le lendemain matin, transférez 0,5 millilitre de la culture de nuit dans un tube de 1,5 millilitre.

Précipiter les cellules par centrifugation. Ensuite, suspendez les cellules avec 10 millilitres de milieu CS2 dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, faites pousser les bactéries à 37 degrés Celsius avec des secousses à 180 rotations par minute pendant huit heures jusqu’à la fin de la phase exponentielle.

Récoltez les cellules par centrifugation. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu CS2 frais. Ajoutez 10 microgrammes de plasmide purifié ou d’ADN génomique à la suspension cellulaire.

Secouez la culture à 180 rotations par minute. Récupérez ensuite les cellules par centrifugation. Remettre les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu BHI.

Mélangez la suspension cellulaire avec 90 millilitres de supplément de gélose BHI fondu Avec 32 milligrammes par litre de chloramphénicol et cinq microgrammes par litre de tétracycline dans l’expérience de contrôle. Versez le mélange dans les boîtes de Pétri de 90 millimètres et laissez refroidir rapidement et laisser la gélose se solidifier. Répliquer les colonies à l’aide de cure-dents dans des assiettes contenant des antibiotiques appropriés pour confirmer leurs caractéristiques de résistance.

Le protocole de conjugaison est utile pour la transmission intra-espèce où le staphylocoque épidermidis a été utilisé comme donneur de CFR. Et la souche N315 du staphylocoque doré a été utilisée comme receveur. Le protocole utilisé pour la transmission inter-espèces donne des résultats similaires en utilisant le même vecteur conjugatif chez différents donneurs conjugatifs.

Il s’agit du premier article dans lequel les détails de la transformation naturelle sont décrits. La méthodologie fournie serait utile au chercheur pour étudier la transmission et la propagation de la résistance aux antibiotiques, ainsi que le principal déterminant du staphylocoque doré pathogène humain.